Extracto
Antecedentes
La cisteamina, un aminotiol antioxidante, es el tratamiento de elección para la cistinosis nefropática, una enfermedad de almacenamiento lisosomal rara. La cisteamina es un agente quimio-sensibilización y radioprotección y sus efectos antitumorales se han investigado en diversas líneas de células tumorales y la carcinogénesis química inducida. Aquí, hemos investigado si cisteamina tiene efectos antitumorales y anti-metastásicos en el cáncer pancreático humano trasplantables, una enfermedad metastásica agresiva.
Metodología /Principales conclusiones
efectos anti-invasión de cisteamina fueron estudiados por ensayos de invasión matrigel y migración celular en 10 líneas celulares de cáncer de páncreas. Para estudiar el mecanismo de acción, se analizó la actividad de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y la viabilidad celular en las células tratadas con cisteamina. También se examinó el efecto anti-metástasis de cisteamina en dos modelos murinos ortotópico de cáncer pancreático humano mediante la medición de la metástasis peritoneal y la supervivencia de los animales. La cisteamina inhibió tanto la migración y la invasión de las diez líneas celulares de cáncer pancreático en concentraciones (& lt; 25 mM) que causó ninguna toxicidad a las células. Se redujo significativamente la actividad de las MMP (
IC
50 38 a 460 mM) y la actividad gelatinasa zymographic en una forma dependiente de la dosis
in vitro
y
in vivo
; mientras que los niveles de ARNm y proteína de MMP-9, MMP-12 y MMP-14 se han aumentado ligeramente empleando la concentración más alta de cisteamina.
In vivo
, cisteamina disminuyó significativamente la metástasis en dos modelos tumorales pancreáticas establecidas, aunque no afecta al tamaño de los tumores primarios. Además, la cisteamina supervivencia prolongada de los ratones en una manera dependiente de la dosis sin causar ninguna toxicidad. De manera similar a los
in vitro
resultados, la actividad de MMP se redujo significativamente en los tumores de los animales tratados con cisteamina. Cisteamina no tuvo efectos adversos clínico o preclínico en el huésped incluso a la dosis más alta.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados sugieren que la cisteamina, un agente con un perfil de seguridad probado, pueden ser útiles para inhibición de la metástasis y la prolongación de la supervivencia de un anfitrión con cáncer de páncreas
Visto:. Fujisawa T, B Rubin, Suzuki a, Patel PS, Gahl WA, Joshi BH, et al. (2012) La cisteamina suprime la invasión, metástasis y prolonga la supervivencia mediante la inhibición de metaloproteinasas de la matriz en un modelo de ratón de cáncer de páncreas humano. PLoS ONE 7 (4): e34437. doi: 10.1371 /journal.pone.0034437
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 2 de Junio, 2011; Aceptado: March 2, 2012; Publicado: 20 Abril, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia .
Introducción
la cisteamina es un aminotiol simple y anti-oxidante que tiene un potencial para el tratamiento de la enfermedad por radiación, trastornos neurológicos y cáncer. Cisteamina también está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de pacientes con cistinosis, una enfermedad autosómica recesiva caracterizada por la acumulación de cistina en los lisosomas [1], [2]. La farmacocinética y los efectos adversos de cisteamina han sido muy bien estudiados [3] - [5]. En el campo del cáncer, muchos estudios han reportado efectos anticancerígenos de cisteamina con respecto al desarrollo y la proliferación del cáncer. Cisteamina impidió no sólo el desarrollo de metaplasia sino también la carcinogénesis de cánceres de tumores gástricos y mamarios inducidos químicamente y por la radiación [6] - [8]. La cisteamina por sí mismo o conjugado con nanopartículas u otros compuestos suprimen la proliferación de células cancerosas derivadas de tumores neoplásicos neuronales [9], SMMC-7721 carcinoma hepatocelular [10], cáncer de mama [11], y líneas celulares de melanoma [12]
in vitro
. Estos derivados parecen inhibir el crecimiento de células cancerosas, sinergizar el efecto de otros fármacos contra el cáncer, inducir apoptosis o ejercer efectos citotóxicos sobre la replicación del ADN. La cisteamina también se encuentra para ejercer un efecto bifásico en la autofagia mediante la inducción de la formación de autofagosomas en puntos de tiempo tempranos pero la degradación autophagic en puntos de tiempo posteriores [13]. La cisteamina es conocida para inhibir la neoplasia intestinal inducidos por irradiación X [6] y la carcinogénesis gástrica inducida por N-metil-N'-nitrosoguanidina en ratas [9], [14]. Sin embargo, no existe ningún informe en la literatura frente a los efectos anti-invasivos o anti-metastásicos de cisteamina en los cánceres humanos.
A. Para el ensayo de invasión de Matrigel, las células se incubaron con concentraciones crecientes de cisteamina en la cámara de matrigel durante 24 horas. Se contó el número de células invadidas en el lado opuesto de la membrana. B y C. cicatrización de heridas ensayo. Las células se cultivaron hasta confluencia y se rascó con una punta amarilla esterilizada. Se incubaron durante 24 horas con 0-5 mM de cisteamina y el área de la herida entre las capas de células se midió. Las líneas horizontales negras de la figura (vehículo) representan el área en el momento 0 cuando se hizo la herida y indican el área de la herida cuando las células se rascaron (B). D. Para el ensayo de viabilidad celular, las células de cáncer de páncreas se incubaron con varias concentraciones de cisteamina y de células vivas se contó el número a las 24 y 48 horas. Los datos se expresan como media ± S. D. de triplicados determinaciones. significaciones estadísticas se muestran por †: P & lt; 0,01 y ‡:. P & lt; 0,001
El cáncer de páncreas se caracteriza por la invasión local de estructuras adyacentes y metástasis a los ganglios linfáticos y el hígado en las primeras etapas. En el momento del diagnóstico, la mayoría de los cánceres de páncreas metastásico son ya, haciendo que el tumor no resecable [15], [16]. Por lo tanto, los esfuerzos deben centrarse no sólo en la orientación del tumor primario, sino también el control de las metástasis de tratar con éxito el cáncer de páncreas.
Las metaloproteinasas de matriz (MMP) son un grupo de endopeptidasas dependientes de cinc implicadas en la angiogénesis en mamíferos, la cicatrización de heridas, y remodelación de tejido [17]. En el cáncer, las MMP desempeñan un papel importante en la invasión de células y la metástasis mediante el control de la degradación de la matriz extracelular [18]. En particular, MMP-9 desempeña un papel central en la invasión del cáncer de páncreas, y su inhibición disminuye metástasis hepáticas del cáncer de páncreas [15], [19]. Por lo tanto, muchos inhibidores de MMP de amplio para reducir la especificidad han sido investigados por sus efectos contra el cáncer. Algunos inhibidores de MMP suprimen con éxito el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos animales [20] - [22], pero no muestran efectos contra el cáncer en ensayos clínicos. Una de las razones es sus graves efectos adversos, especialmente los que implican graves dolor en las articulaciones y músculos [23], [24]. Por lo tanto, es importante identificar los inhibidores de MMP con efectos secundarios poco o nada.
A. Para medir la actividad total de las MMP en las líneas celulares de cáncer de páncreas, las células se incubaron con 0-5 mM de cisteamina durante 24 horas, la proteína total extraída y la actividad medida usando sustrato fluorogénico. El efecto de cisteamina en MMP-9 en el nivel de proteínas mediante ELISA (B), MMP-9, MMP-12 y los niveles de MMP-14 de ARNm (C) y las actividades gelatinasa zymographic (D) se determinó después de incubar células de cáncer pancreático con cisteamina para 24 horas. la actividad de MMP-9 se determinó por ELISA y mRNA de QRT-PCR. β-actina se utilizó para un gen de referencia en QRT-PCR. Los datos representan la proteína MMP-9 en pg /g de lisado celular total y la relación en porcentaje de ARNm RFU /β-actina. Los datos se expresan como media ± S. D. de determinaciones por triplicado y los experimentos se repitieron tres veces. significaciones estadísticas se muestran mediante *: P & lt; 0,05, †: p & lt; 0,01 y ‡:. P & lt; 0,001
IC
50 de MMP se determinó mediante la incubación de cada enzima MMP con varias concentraciones de cisteamina y batimastat en un ensayo fluorimétrico como se describe en materiales y métodos.
IC
50 es la concentración de inhibidor a la que se produce una inhibición del 50% de la proteolisis.
En el presente estudio, se examinaron los efectos anti-invasivos de cisteamina, que tiene un excelente perfil de seguridad, en líneas celulares de cáncer pancreático
in vitro
. También se investigó el efecto anti-metastastic- de cisteamina en modelos animales de cáncer de páncreas humano, determinar específicamente si se puede disminuir la metástasis del cáncer en modelos de cáncer de páncreas ortotópico en ratones inmunodeficientes. Por último, la seguridad de cisteamina subcutánea se evaluó en ratones portadores de tumores.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
líneas celulares de cáncer de páncreas (Hs766T, MIA-PaCa2 , Panc-1, ASPC-1, PK-1, Mpanc96, BxPC-3, KLM, HPAF-II, y SW1990) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). clorhidrato de cisteamina fue adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se disolvió en agua destilada.
Ensayo de Migración Celular
ensayo de migración celular es un ensayo clásico de cicatrización de heridas [25]. Para este ensayo, las células se cultivaron en platos de Petri de 10 cm hasta que estuvieron completamente confluente. Las monocapas de células se rasparon con una punta de micropipeta amarillo estéril y se lavaron con PBS tres veces; las células fueron cultivadas en medio que contiene 0-5 mM de cisteamina durante 24 horas. Se seleccionaron cinco campos aleatorios y fotos fueron tomadas usando un microscopio invertido. La superficie media (mm
2) de la brecha entre las capas de células se calculó utilizando el software de imágenes IPLab (BD Biosciences-Bioimagen, Rockville, MD).
Hs766T y MIA-PaCa2 células (2 × 10
6) se implantan directamente en el páncreas de 5-6 semanas de edad desnudos femeninos
nu /nu
ratones y luego cavidad peritoneal y la piel se cerraron con clips. dosis crecientes de cisteamina se inyectaron por vía subcutánea como se describe en materiales y métodos. Los tumores primarios y las metástasis de ≥ 5 mm se contaron en ratones tratados con vehículo y cisteamina.
a
: P & lt; 0,05,
B Opiniones: P & lt; 0,01 y
c
: P & lt; 0,05,
d:
P & lt; 0,001. +: Ascitis moderada, ++: ascitis grave, -.: No hay ascitis
Hs766T y células MIA-PaCa2 (2 × 10
6) fueron implantados directamente en el páncreas de 5-6 semanas de edad desnudo femenino
nu /nu
ratones y luego utilizando clips cavidad peritoneal y la piel se cerraron. De día 4 después de la implantación del tumor, los ratones fueron tratados dos veces al día con vehículo o 25, 100, 250 mg /kg /día de cisteamina hasta el final del experimento. Los ratones con tumores fueron sacrificados 4 semanas después de la implantación de células. A. Se muestra un ratón representante de cada grupo de tratamiento que alberga el tumor MIA-PaCa2. Las flechas amarillas indican tumores primarios en el páncreas y los triángulos azules indican lesiones metastásicas. En otro experimento, el control y los ratones tratados con cisteamina se siguieron para la supervivencia. Kaplan-Meier de supervivencia de los ratones que albergaban Hs766T (B) y MIA-PaCa2 (C), los tumores.
Matrigel invasión de ensayo
invasión celular se ensayó en cámaras de invasión de Matrigel (BD BioCoat BD Biosciences; 24 pozos, 8 micras de tamaño de poro) como se describe anteriormente [26]. Brevemente, las células se incubaron con diferentes concentraciones de cisteamina (0-5 mM) durante 24 horas. Las células no invadidos se retiraron de la superficie superior de la membrana con un hisopo de algodón, y las células en la superficie inferior de la membrana fueron fijadas y teñidas con H & amp; E. se contaron tres campos al azar por cámara. Los datos se muestran como media ± S. D. de determinaciones por triplicado.
Los ratones con tumores Hs766T fueron tratados con dosis crecientes de pesos cisteamina y corporales se midieron en el día 10 y día 25 después de la implantación del tumor. No hubo diferencia significativa entre los grupos de tratamiento.
Tumor ratones portadores fueron tratados con dosis crecientes de cisteamina y el suero se recogió de venas de la cola dos veces, es decir, el tratamiento pre-cisteamina (día 4) y post- tratamiento (día 18). Hígado, músculo y la función renal biomarcadores fueron evaluados después del tratamiento cisteamina. La alanina aminotransferasa (ALT), la creatina quinasa (CK), aldolasa, y creatinina (Cr) se midieron en cada grupo. No hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular de líneas celulares de cáncer pancreático se midió contando el número de células viables. Brevemente, 3 × 10
5 Las células se sembraron por pocillo en una placa de 6 pocillos con 2,0 ml de medio completo y se incubaron durante la noche para el chapado. Las células se trataron con diferentes concentraciones de cisteamina durante 24-48 horas. Después de la incubación, las células fueron separadas con tripsina, se lavaron y se tiñeron con 0,4% de azul de tripano. El número de células se contó manualmente mediante un hemocitómetro y se presentó como el número de células viables por mililitro.
A. En el día 30 después de la implantación ortotópico de células de cáncer de páncreas, se recogieron los tumores, proteínas totales extraídas y la actividad de MMP determinan usando sustrato fluorogénico MMP. niveles B. MMP-9 de ARNm se determinaron en ARN total extraído de los tumores de QRT-PCR. β-actina se utilizó para un gen de referencia. C. MMP-9 nivel de proteína se determinó por ELISA. ensayo D. zimográfico se realizó en los tumores tratados con cisteamina. Los datos se expresan como media ± S. D. de triplicado a cuadruplicar determinaciones. El experimento se repitió dos veces. significaciones estadísticas se muestran mediante *: P & lt; 0,05, †: p & lt; 0,01 y ‡:. P & lt; 0,001
Medición de la actividad de MMP
actividad de las MMP se midió mediante Mca-KPLGL -Dpa-AR-NH2 Fluorogenic péptido sustrato (R & amp; D systems, Emeryville, CA). se recogió la proteína total de células de cada línea celular de cáncer de páncreas usando tampón de lisis (que contiene 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl
2, 0,05% Brij35 y 0,25% de Triton-X) sin un inhibidor de MMP. Substrato y 10 g de proteína total de células en el tampón se mezclaron en una pared negro placa de 96 pocillos. Después de 1 hora de incubación, unidades de fluorescencia se determinaron utilizando excitación /emisión = 320/405 nm.
gel de sustrato de ensayo para la actividad de MMP zymographic
gel de gelatina zymography se realizó en lisados celulares de HS7666 y MIA -PaCa2 línea celular de cáncer de páncreas con o sin cultivo con diferentes concentraciones de cisteamina esencialmente como se describe por D'Angelo et al [27]. En resumen, 50 g de proteína total se sometieron a electroforesis en 10% SDS-PAGE que contiene 0,1% de gelatina como sustrato. Después de lavar con 1% de Triton X-100 en Tris 50 mM /HCl, pH 7,5 durante 1 hora para eliminar el SDS, los geles se incubaron durante la noche a 37
° C en 50 mM Tris /HCl, pH 7,5, que contiene 150 mM NaCl, CaCl2 10 mM y 0,1% de Triton X-100, antes de la tinción con tinción seguro simplemente azul. Los geles se lavaron con agua desionizada a temperatura ambiente. enzimas degradantes de gelatina se identificaron por su capacidad de digerir gelatina como se demuestra por las zonas claras de la gelatina digerida. Pertinentes de la banda se cuantificaron mediante el escaneo de análisis densitométrico y se normalizó al número de células.
Quantitative PCR con transcripción inversa
inversa cuantitativa se llevó a cabo la transcripción-PCR (qRT-PCR) como se describe anteriormente utilizando SYBR QuantiTect green PCR Kits (QIAGEN, Valencia, CA) [28]. Gene primers específicos para la MMP-9 humana, la MMP-12, MMP-14 y β-actina se adquirieron de QIAGEN o sintetizarse en la facilidad de la base CBER. La expresión génica se normalizó a ß-actina antes se determinó el factor de cambio en la expresión génica.
Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
El nivel de proteína MMP-9 se determinó usando MMP total de Humana -9 kit DuoSet (I + amp; D systems, Emeryville, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Diez microgramos de proteína total se dividió en alícuotas en cada pocillo y la concentración de MMP-9 se determinó por el método colorimétrico.
IC
50 de cisteamina contra la actividad de las MMP
IC
50 de cisteamina y batimastat se determinó utilizando un kit de perfiles de inhibidor de MMP fluorimétrica (Enzo Life Science, Farmingdale, NY), siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, cada enzima MMP se mezcló con diversas concentraciones de cisteamina y batimastat en una placa de pared negro 96 y se incubó durante 30 minutos. Después de la administración de sustrato fluorogénico, una velocidad de aumento de fluorescencia se midió usando excitación /emisión = 320/405 nm.
Medición de la metástasis, la supervivencia y el peso corporal de los animales implantados con cáncer de páncreas ortotópico en ratón modelo
Mujer desnuda
nu /nu ratones
entre las edades de 5 y 6 semanas se mantuvieron en una instalación de barrera en el bastidor filtros HEPA. Se llevaron a cabo todos los estudios en animales bajo protocolo aprobado por el#2000-06 CBER Institucional Cuidado de Animales y el empleo de conformidad con los principios y procedimientos descritos en
los NIH Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
. Para la inyección de células tumorales ortotópico, el páncreas se expone cuidadosamente, y 2,0 × 10
6 de las células Hs766T MIA-PaCa2 y se inyectaron en el órgano. a continuación, el páncreas fue devuelto a la cavidad peritoneal, y la pared abdominal y la piel se cerró con clips de la piel [29], [30]. De día 4 después de la implantación del tumor, dosis crecientes de cisteamina (0, 25, 100, o 250 mg /kg /día) se inyectaron por vía subcutánea dos veces al día hasta el final del experimento. Al día 30, los ratones fueron sacrificados y el número de nódulos metastásicos visibles a ojo desnudo y cuyos tamaños eran & gt; 5 mm de diámetro contó. El peso total del tumor primario y nódulos metastásicos también se midieron. Fotos fueron tomadas inmediatamente después de sacrificar a los animales. Además, el tiempo de supervivencia del ratón se monitorizó en un experimento independiente. Los ratones fueron sacrificados cuando tuvieron ascitis grave o caquexia. Los ratones de ambos modelos de tumores se pesaron en el día 10 y día 25 después del tratamiento de cisteamina.
Medición de enzimas en suero de ratón
se recogió sangre
Mouse de la vena de la cola. Los niveles séricos de alanina aminotransferasa (ALT), la creatina quinasa (CK), aldolasa y la creatinina (Cr) se midieron utilizando diferentes kits obtenidos de Pointe Scientific, Inc. (Canton, MI) y Caldon Biotech, Inc. (Vista, Ca), siguiendo las instrucciones del fabricante.
actividad de MMP-9 y MMP expresión en tumores primarios
Cuando los ratones fueron sacrificados en el día 30, se recogieron
tumores primarios. Para la extracción de proteína total, el tumor estaba empapada con tampón de lisis y se homogeneizaron usando TissueRuptor (QIAGEN); se recogió el sobrenadante. ARN total fue extraído utilizando el kit FastRNA favorable verde (MP Biomedicals, Solon, OH) siguiendo las instrucciones del fabricante. la actividad de MMP, gelatina hidrolizar la actividad MMP y los niveles de ARNm y de proteína de MMP-9 se determinaron como se ha mencionado anteriormente.
El análisis estadístico
Los datos para la actividad enzimática, ELISA, y QRT-PCR eran comparación entre cada grupo por ANOVA. Las curvas de supervivencia se generaron mediante el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank.
Resultados
cisteamina inhibe la migración de células de cáncer de páncreas y la invasión sin ser citotóxicos para las células
primero examinamos el efecto de cisteamina en la invasión de células de cáncer de páncreas usando el ensayo de invasión de matrigel. Para este ensayo, se utilizó 10 líneas celulares de cáncer de páncreas diferentes en una cámara de invasión de Matrigel. Como se muestra en la Fig. 1A y la Figura S1, cisteamina inhiben la invasión de células de una manera dependiente de la concentración. Incluso la concentración más baja de cisteamina (0,05 mM) inhibió significativamente la invasión de células en todas las líneas celulares de cáncer de páncreas.
examinó el efecto de cisteamina en la migración de mismas 10 líneas celulares de cáncer pancreático en el ensayo de invasión. Para el ensayo de migración, se utilizó un ensayo de cicatrización de heridas. Las imágenes representativas de la cicatrización de heridas celular en las células Hs766T se muestran en la Figura 1B. La migración celular se inhibió significativamente en y por encima de 0,05 mM de cisteamina en todas las 10 líneas de células (Figura 1C y Figura S2). Las líneas horizontales negras de la figura 1B (vehículo) representan el área en el momento 0, cuando se hizo la herida. Desde cisteamina mediada efectos similares en todas las 10 líneas celulares en estos ensayos, elegimos dos líneas de células al azar para todos los otros ensayos.
También se examinó la citotoxicidad de cisteamina en contra de dos líneas celulares de cáncer pancreático (Hs766T y MIA-PaCa2 ). Número de células viables después del tratamiento 24 y 48 horas de cisteamina se contaron. La cisteamina mostró toxicidad celular a & gt; concentración de 12,5 mM en ambas líneas celulares ensayadas, pero no se observó evidencia de toxicidad a concentraciones más bajas como el número de células viables fueron similares a las células no tratadas (Figura 1D). Estos resultados sugieren que tanto la migración celular y la invasión se inhibieron a una concentración no citotóxica de cisteamina.
cisteamina inhibe la actividad enzimática de MMP en las líneas celulares de cáncer pancreático
Para investigar el mecanismo de la inhibición de la migración celular y la invasión de cisteamina, se examinó el efecto de cisteamina en la actividad enzimática de MMP. La cisteamina inhibió la actividad de MMP en dos líneas celulares de cáncer de páncreas representativos ensayados en un dependiente de la concentración manera (Figura 2A). La
IC
50 {la concentración de cisteamina en el que la actividad de la enzima MMP 50% (proteólisis) se inhibe} se calculó por ELISA (Figura 3). Cisteamina inhibe directamente cada actividad enzimática de MMP, con un
IC
50 de 38 a 460 mM. Desde MMP-9 desempeña un papel central en la invasión del cáncer de páncreas, se examinaron los niveles de ARNm y de proteína en ambas líneas celulares. En contraste con la actividad enzimática, la proteína y los niveles de mRNA de MMP-9 se aumentaron modestamente a la mayor concentración de cisteamina (5 mM) (Figura 2B y 2C). También observamos que los ARNm para otros dos MMPs (MMP-12 y MMP-14) mostró un aumento modesto similar a MMP-9 en respuesta a la cisteamina tratamiento (Fig. 2C). Por el contrario, gelatina zymographic resultados de la actividad de hidrólisis de MMP-9 diferían significativamente de la expresión de ARNm y tanto a favor como MMP-9 activa actividades disminuyeron significativamente en una manera dependiente de la dosis (Fig 2D).
cisteamina disminuye la metástasis y prolonga la supervivencia de los ratones inmunodeficientes implantados de forma ortotópica con el cáncer de páncreas humano
Se investigó el efecto anti-metástasis de cisteamina en dos modelos de ratón ortotópico usando líneas celulares de cáncer de páncreas humano. Los ratones se trataron dos veces al día por vía subcutánea con cisteamina de día 4 después de la implantación del tumor hasta el final del experimento. Al día 30, el número y el peso de los nódulos tumorales primarias y metastásicas se midieron (Figura 4). En ambos modelos de tumor, el tamaño y el peso de los tumores primarios no mostraron ninguna diferencia entre el control y los grupos tratados. Sin embargo, cisteamina disminuyó significativamente el número de nódulos metastásicos en una forma dependiente de la dosis. A la dosis más alta (250 mg /kg /día), cisteamina disminuyó significativamente el número de metástasis de tumor Hs766T por ~ 90% (34 a 3,6). El peso total de nódulos metastásicos del tumor MIA-PaCa2 también se redujo en aproximadamente 90% a la dosis más alta. Además, dos de los 5 ratones en el modelo de tumor Hs766T y 4 de 5 ratones en el modelo de tumor MIA-PaCa2 desarrollaron ascitis en su cavidad peritoneal. Sin embargo, no ratones desarrollaron ascitis en dosis de 100 y 250 mg /kg /día en cualquier modelo de tumor. Una imagen representativa de cuatro ratones con el tumor MIA-PaCa2 se muestra en la Figura 5A. También se comparó la supervivencia de los ratones entre los diferentes grupos de tratamiento. el tiempo de supervivencia del ratón se prolongó significativamente cuando se tratan con ≥100 mg /kg /día cisteamina en ambos modelos tumorales (Figura 5B y 5C).
También supervisará atentamente el estado general y el peso corporal de los ratones durante el periodo experimental . No hubo diferencia significativa en la apariencia general y el peso corporal entre los cuatro grupos de animales en ambos modelos tumorales (Figura 6). Del mismo modo, no hubo alteración en las enzimas séricas que representan la función hepática (ALT) o el daño muscular (aldolasa) ni evidencia de daño del músculo esquelético o de la función renal (creatinina quinasa y creatinina) en los grupos tratados con cisteamina (Figura 7). Por otra parte, no se detectó toxicidad en los órganos en ningún órgano vital, como el hígado, riñón, cerebro, corazón y pulmón en ratones tratados con cisteamina cuando se evaluaron por examen histológico (Figura S3).
cisteamina disminuye la actividad de MMP en tumores primarios ortotópico
actividad de MMP en los tumores ortotópico primarios se midió en el día 30. La cisteamina disminución de la actividad MMP en los dos tumores (Hs766T y MIA-PaCa2) a 100 y 250 mg /dosis cisteamina kg (Figura 8A). En las mismas muestras, se midió el ARNm por Q-RT-PCR y los niveles de proteína de MMP-9 por ELISA. En contraste con
in vitro
resultados, cisteamina no afectó los niveles de ARNm y proteína de MMP-9 en los tumores primarios recogidos de ratones (Figura 8B y 8C). Sin embargo, el ensayo de zimografía para MMP-9 mostró una disminución dependiente de la dosis en la actividad de la gelatinasa (Fig. 8D).
Discusión
Se demuestra que la cisteamina inhibe la migración de células de cáncer de páncreas y la invasión a través de la inhibición directa de MMP actividad enzimática
in vitro
. Esta propiedad recién descubierta de cisteamina como resultado la inhibición de la metástasis de las células cancerosas pancreáticas humanas ortotópicamente implantados en el páncreas de ratones inmunodeficientes; el efecto fue dependiente de la dosis de cisteamina. La cisteamina disminuye no sólo el número de metástasis en la cavidad peritoneal, pero también disminuyó la ascitis generados por metástasis de tumores de páncreas agresivo. En contraste, no se observó ningún cambio significativo en el tamaño o peso del tumor pancreático primario. En consonancia con esta observación, cisteamina no causó ningún efecto sobre la viabilidad celular en las líneas de cáncer de páncreas hasta una concentración que provocó una inhibición significativa de la migración celular y la invasión. Los ratones tratados con cisteamina sobrevivió más tiempo en comparación con los ratones de control tratados con excipiente. Tanto
in vitro Opiniones y en tumores primarios
in vivo
, la actividad enzimática de MMP disminuyó con el tratamiento con cisteamina, mientras que su expresión en el mRNA y los niveles de proteína no cambió. resultados zymographic cisteamina confirmado inducida por la inhibición de MMP
in vitro
y
in vivo.
Estas observaciones indican que el bloqueo de las actividades catalíticas de MMPs por cisteamina es crítico en la inhibición de la metástasis tumoral en un modelo animal de páncreas cáncer.
Los efectos anti-metastásicos de cisteamina se mediada sin signos visibles de toxicidad. Los ratones tratados con incluso la dosis más alta de cisteamina (250 mg /kg /día) no mostró efectos adversos relacionados con el aspecto general, el peso corporal, el daño muscular, las enzimas séricas y los niveles de creatinina en suero. Además, los principales órganos de los animales tratados no mostraron evidencia de daño histológico. Estas observaciones son consistentes con el perfil de seguridad conocido de cisteamina en los seres humanos [2], [3]. La cisteamina causó sólo síntomas gastrointestinales en los sujetos, ya que aumentó la producción de ácido gástrico y disminución de la motilidad gastrointestinal [31]. Sin embargo, estos efectos fueron controlados por el uso concomitante de inhibidores de la bomba de protones [32]. Es de destacar que la cisteamina suficientemente inhibida la migración de células de cáncer y la invasión
in vitro
a 50 mM, una concentración que se puede alcanzar
in vivo
. La administración oral de cisteamina (administrada cada 6 horas a 60 a 90 mg /kg de peso corporal por día) pueden aumentar el nivel plasmático de cisteamina hasta ~ 50 M [3], [33] - [35]. Además, 100 mg /kg /día s.c. inyección de cisteamina en los animales es similar a la dosis utilizada para la cistinosis, y esta dosis produjo una disminución significativa en la metástasis tumoral y la prolongación de la supervivencia. Consideramos que la cisteamina se puede administrar de forma segura en la clínica para controlar la metástasis del cáncer de páncreas.
Tanto los niveles de ARNm y proteínas para la MMP-9 fueron modestamente a moderadamente upregulated
in vitro
a la dosis más alta de cisteamina. Del mismo modo, el ARNm de la MMP-12 y 14 también se upregulated modestamente a la dosis más alta. No se observó este aumento de MMP-9
in vivo
, tal vez porque las células del cáncer pancreático se incubaron con cisteamina solamente durante 24 horas, mientras que
in vivo
tumores en fueron expuestos a la cisteamina de forma continua durante 27 días. No hemos intento de medir los niveles de cisteamina en los tumores
in vivo
porque el destino metabólico intracelular de cisteamina
in vivo
es muy complejo y difícil de medir ya que se une a liberar tiol, en particular los de cisteínas proteínas celulares. En su lugar, dependen fundamentalmente de sus efectos biológicos de cisteamina sobre las actividades de MMP y el crecimiento del tumor. Sin embargo, la MMP-9 aumentado, MMP-12 y MMP-14 niveles en la concentración más alta
in vitro
puede representar un efecto compensatorio temporal de las células debido a una disminución repentina de la actividad de MMP por cisteamina. Por el contrario, la actividad catalítica de la MMP-9 para hidrolizar la gelatina en el ensayo de zimografía no mostró tal regulación al alza después del tratamiento con la dosis más alta de cisteamina de líneas celulares de cáncer pancreático
in vitro
así como tumores ortotópico
In
vivo. De hecho en el ensayo de zimografía para MMP-9, cisteamina causó una disminución dependiente de la dosis en la actividad de la gelatinasa. Estos resultados sugieren que la inhibición enzimática de MMP-9 por cisteamina puede estar implicado en la disminución de la invasión y la metástasis de cáncer de páncreas. MMP1, MMP2, MMP7, MMP9 y también se han demostrado que se expresa en el tumor de páncreas [36], [37], pero el efecto de cisteamina en la proteína y los niveles de ARNm para todas estas MMPs no fue examinada a excepción de MMP9. Por lo tanto, el presente estudio carece de datos sobre el efecto de cisteamina en la proteína y los niveles de mRNA de todos los MMPs, incluyendo MMP2. Sin embargo, es importante señalar que la cisteamina inhibe la actividad enzimática de las MMP, que incluye todas las MMPs.
La actividad anti-MMP de cisteamina fue menor que la de los inhibidores de MMP específicas tales como batimastat y marimastat (
IC
50
nM a mM bajos en comparación con los de alta gama M durante cisteamina), pero cisteamina se puede tolerar mejor
in vivo
. De hecho, batimastat tenía problemas de mala biodisponibilidad oral [24] y marimastat fracasado en la clínica como la dosificación más alta produce altas toxicidades musculoesqueléticos y pobre supervivencia en pacientes con metástasis de cáncer de mama [38]. En el presente estudio, los ratones toleraron hasta 250 mg /kg /día cisteamina sin ninguna evidencia visible, bioquímica o histológica de la toxicidad o daño muscular.
En los estudios de tratamiento del cáncer anteriores, cisteamina se utiliza debido a su anti- oxidativo y los efectos de radio-protector [39]. Durante estos estudios, se observó que la cisteamina también tenía actividades anti-cancerígenos y anti-proliferativas en una variedad de cánceres. Ahora informe que cisteamina ejerce efectos anti-metastásicos y anti-MMP. Sin embargo, la cisteamina no afectó el tamaño del tumor pancreático primario, lo que sugiere que debe utilizarse simultáneamente con otros agentes anti-tumorales tales como gemcitabina para efectos contra el cáncer óptimas [13].