Extracto
A pesar de un aumento del nivel de expresión de XIAP se asocia con la metástasis de las células cancerosas , los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo en gran parte inexplorado. Para comprobar la base estructural específica de XIAP para la regulación de la migración de las células cancerosas, hemos introducido diferentes dominios de XIAP en XIAP
- /- células HCT116, y encontró que la expresión reconstituyente de larga duración HA-XIAP y HA-XIAP ΔBIR, ambos que tienen dominio intacto ANILLO, restaurado expresión de β-actina, la polimerización de actina y la motilidad de las células cancerosas. Mientras que la introducción de HA-XIAP ΔRING o mutante H467A, que abolió su función ligasa E3, no mostró la restauración obvia, lo que demuestra que la actividad ligasa E3 del dominio XIAP ANILLO jugó un papel crucial en la regulación de XIAP de la motilidad de las células cancerosas. Por otra parte, se requiere anillo de dominio en lugar de dominio BIR para la interacción con RhoGDI independiente en su actividad ligasa E3. En resumen, nuestros estudios presentes encontraron que el papel de XIAP en la regulación de la motilidad celular ha quedado desligado de sus propiedades inhibidoras de la caspasa, pero relacionados con la interacción física entre RhoGDI y su anillo de dominio. Aunque la actividad ligasa E3 del dominio RING contribuyó a la migración celular, que no participó en RhoGDI vinculante ni su modificación ubiquitinational
Visto:. Liu J, Zhang D, Luo W, J Yu, Li J, Yu Y, et al. (2012) E3 ligasa Actividad de XIAP ANILLO de dominio se requiere para la migración de las células del cáncer mediado por XIAP, pero no por su RhoGDI la actividad de unión. PLoS ONE 7 (4): e35682. doi: 10.1371 /journal.pone.0035682
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 10, 2011; Aceptado: March 20, 2012; Publicado: 19 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionada por Estados Unidos Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional del Cáncer y CA112557 CA119028-05S110, NIH /NIEHS ES012451, y ES010344. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el ligada al X inhibidor de la proteína de la apoptosis (XIAP) es un miembro de los inhibidores de la familia [1] proteína apoptosis (IAP). XIAP primero fue reconocido por sus potentes propiedades en la regulación de la apoptosis celular [2], [3]. Investigaciones posteriores descubrieron que XIAP puede regular otras vías celulares desacoplado de su actividad de caspasa-inhibitoria [4], [5], mayormente inspirado en los hallazgos de los ratones deficientes en XIAP que mostraron ningún fenotipo apoptótico abierta [6]. Recientemente se ha sugerido una amplia variedad de pruebas de que las implicaciones de XIAP en el metabolismo del cobre [7], la motilidad celular [8], [9] y la activación de JNK y NFKB vías [10], [11] no estaban relacionados con su efecto inhibitorio sobre caspasas.
Las múltiples funciones de la raíz XIAP desde su base estructural. XIAP se compone de tres dominios de baculovirus IAP repetir (BIR) al extremo amino terminal y un dominio RING carboxilo-terminal [12]. Cada dominio BIR se compone de aproximadamente 70 aminoácidos que coordinan un ion de zinc a través de histidina y residuos de cisteína [13]. Sus propiedades anti-apoptóticos potentes dependen principalmente de las funciones de una ranura en el dominio BIR3 y dos superficies en el dominio BIR2 que se han informado de obligar e inhiben la caspasa-9 y la caspasa-3/7, respectivamente [14]. dominio RING se define por la presencia de siete cisteínas y una histidina que forman la arquitectura refuerzo transversal y coordinan dos iones de zinc [15]. dominios ANILLO menudo funcionan como modula que confieren ligasa (E3) la actividad de la ubiquitina [13]. Mutando el residuo de histidina clave en el aminoácido 467 a alanina de XIAP humana, Lewis et al encontró que se requiere la función de E3 ubiquitina ligasa de ANILLO para la activación de NFkB, si bien no para la transcripción Smad dependiente de [16], lo que indica que estructura- funciones basadas de XIAP también forman parte del contexto celular dependiente.
El aumento de expresión de XIAP se encuentra en muchos tejidos de cáncer y se asocia con la quimio-resistencia, progresión de la enfermedad y el mal pronóstico [9] [17], [18], [19, ], [20], [21], [22]. Los últimos resultados de nuestro laboratorio y otros 'demostraron que XIAP podría regular la metástasis tumoral [8], [23], [24]. metástasis tumoral es una causa principal de muerte para la mayoría de los pacientes de cáncer [25]. Muchas moléculas implicadas en la cascada metastásica se controlan por los miembros de Ras-superfamilia de pequeñas proteínas de unión a GTP, que son capaces de unirse GDP /GTP y hidrolizar GTP conduce a la activación de las proteínas efectoras aguas abajo [26]. Human Rho-GTPasa subfamilia consta de 23 moléculas de señalización, entre los que RhoA, RhoB, Rac1 y Cdc42 son los más ampliamente investigado y comunicado a controlar varios aspectos de la motilidad celular y la invasión, es decir, la polaridad celular, la organización ctyoskeletal, y de transducción de señales [27], [28].
Rho-GTPasa actividad está estrechamente controlada por cuatro componentes principales implicados en el ciclo GTPasa PIB /GTP, incluyendo las proteínas activadoras de GTPasa (GAP), inhibidores de la disociación de GDP-(gdis), la disociación GDI factores (GDFs), y factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) [29]. RhoGDI juega un papel clave en el equilibrio de todo el ciclo de GTPasa mediante la prevención de dissocation PIB y el mantenimiento de asociación GTP través de la interacción con el grupo prenilación de GTPasa. Por lo tanto, secuestra GTPasa en el citoplasma mientras que la localización en la membrana plasmática interna es necesaria para la activación GTPasa. Los efectos inhibidores de RhoGDI sobre la actividad GTPasa han sido apoyados por varias líneas de evidencia [30], [31], [32]. Por ejemplo, Leffers
et al
. han encontrado que la sobreexpresión de RhoGDI en los queratinocitos humanos causadas interrupción del citoesqueleto de actina y la inhibición de la motilidad [32]. Por lo tanto, RhoGDI es considerado como un candidato atractivo para la regulación de la actividad de Rho GTPasa en el tratamiento del cáncer [26]
.
Nuestros estudios recientes han demostrado que XIAP mediada motilidades celulares de cáncer a través de manera RhoGDI dependiente en la regulación del citoesqueleto [ ,,,0],23]. En el presente estudio, se aclarará más los mecanismos moleculares que subyacen a la interacción proteína XIAP-RhoGDI y proporcionó la base estructural de XIAP por la contribución a la mediación de la motilidad de las células cancerosas.
Resultados
anillo era de dominio requerido para la expresión β-actina mediada por XIAP
XIAP expresión es elevada en muchas líneas celulares de cáncer y está estrechamente relacionado con la progresión y la agresividad del cáncer maligno [33], [34]. Nuestro trabajo reciente ha demostrado que XIAP podría regular la β-actina de expresión [23]. Como resultado, el agotamiento de XIAP expresión atenuada tasa de migración celular y la capacidad invasiva como se muestra en la cicatrización de heridas ensayo de ensayo y trans-bien, respectivamente (Figs. 1A-1E). Tomar nota, sólo hubo diferencia marginal en la tasa de proliferación entre el TE y XIAP
- /- células cuando se cultivan en medio de cultivo celular normal (10% de FBS) durante un máximo de 5 días, que incluía el intervalo de tiempo para el ensayo de cicatrización de heridas ( la Fig. 1F), lo que indica que la tasa de migración de células reducido observado en XIAP
- /- células no fue debido a la proliferación celular defectuoso. Por otra parte, la inducción dinámica de la polimerización de actina, la formación es decir, F-actina, por EGF también se redujo dramáticamente en XIAP
- /- células detectadas por espectrofotómetro (Fig. 1G). Consistentemente, se observó un claro cambio de la morfología del esqueleto celular y riza las más periféricas /ondulaciones de la membrana en las células HCT116 WT tratados con EGF pero no en XIAP
- /- las células (Figuras 1 H & amp;. 1I). Estos fenómenos fueron reproducibles derribando XIAP en células HCT116 (Fig. 2). Por lo tanto, indicó que XIAP jugó un papel clave en la mediación de la migración de células de cáncer y la invasión.
(A), Fuera de combate de XIAP en células HCT116 se verificó mediante ensayo de transferencia Western. (B y C), se evaluó el comportamiento de la migración de la célula durante la ejecución de un ensayo de curación de la herida, y las imágenes fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo. Barra de escala de 300 micras. El área de la herida se cuantificó usando software de análisis de la migración celular, y los datos cuantitativos se mostraron como se indica (bar de error representan S.D., n = 3). El asterisco (*) indica una diferencia significativa en el porcentaje de área de la herida entre las líneas celulares indicadas (
p
& lt; 0,05). (D y E), La invasión de WT (Vector), XIAP
- /- (Vector), y XIAP
- /- se determinó células HCT116 (HA-XIAP), cuantificados y expresados como porcentaje de invasión. Los resultados se representan mediante la media ± S. D. de los datos de los experimentos de tres independientes con pocillos por duplicado para cada experimento. El asterisco (*) indica una disminución significativa en el porcentaje de invasión en comparación con la de WT (vector) y XIAP
- /- células (HA-XIAP) (
p Hotel & lt; 0,01). (F), las tasas de proliferativas de las líneas celulares indicadas fueron evaluadas por un kit de ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo luminiscentes. Los resultados se representan mediante la media ± S. D. de los pocillos por triplicado. (G-I), las células indicadas se trataron con o sin EGF y la inducción F-actina se analizó por espectrofotometría (G), o observó bajo el microscopio confocal (H), respectivamente. La fluorescencia de las células se cuantificó por el software de ImageJ (I). Los datos cuantitativos se demostró como se indica (barra de error representan S.D., n = 3). El asterisco (*) indica una disminución significativa en comparación con la de las células WT (
p Hotel & lt; 0,01).
(A), desmontables de XIAP en células HCT116 fueron verificados por Western Blot ensayo. (B y C), se evaluó el comportamiento de la migración de la célula durante la ejecución de un ensayo de curación de la herida, y las imágenes fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo. Barra de escala de 300 micras. El área de la herida se cuantificó usando software de análisis de la migración celular, y los datos cuantitativos se mostraron como se indica (bar de error representan S.D., n = 3). El asterisco (*) indica una diferencia significativa en el porcentaje de área de la herida entre las líneas celulares indicadas (
p Hotel & lt; 0,05) guía empresas
proteína XIAP contiene cuatro dominios funcionales, incluyendo tres BIRs. y un anillo de dominio (Fig. 3A). La función anti-apoptótica de XIAP BIRs se informó a ser atribuible a su unión y el deterioro de la activación de caspasa [1]. El dominio RING de XIAP pertenece a E3 ligasa y media la ubiquitinación y la degradación de la proteína [1]. Para verificar la base estructural específica de XIAP para la regulación de la migración de células de cáncer, transfectadas diferente HA-tagged XIAP construcciones de ADNc, que incluye de longitud completa (HA-XIAP), ANILLO dominio de deleción (HA-XIAPΔRING), supresión BIR total (HA -XIAPΔBIR), y un punto de mutación H467A, lo que resulta en la pérdida de actividad de ubiquitina ligasa E3, en XIAP
- /-. se identificaron las células respectivamente, y los transfectantes estables (Fig 3B). Re-constitucional expresión de HA-XIAP o HA-XIAP ΔBIR que contiene dominio RING en XIAP
- /- las células resultaron en un aumento en la expresión de β-actina, en comparación a la de XIAP
- /- (Vector) las células, mientras que la expresión de HA-XIAP ΔRING que contiene dominios BIR, o HA-XIAP H467A que hace que la abolición de la actividad ligasa E3, no proporcionó una reparación comparable (Fig. 3C). Por lo tanto, se ha demostrado que XIAP ANILLO de dominio y su actividad ligasa E3 jugaron un papel en la regulación de la expresión de β-actina.
(A), la representación esquemática de la proteína XIAP y la función identificada de cada dominio. (B y C), Identificación de los transfectantes estables que albergan XIAP y sus diversos plásmidos de deleción en XIAP
- células HCT116 - /. Los números bajo las bandas indicadas el análisis densitométrico de las proporciones relativas de los niveles de beta-actina a los controles de carga (GAPDH) evaluados por software de ImageQuant versión 5.2 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Los resultados fueron representativos de al menos tres experimentos independientes.
actividad ligasa E3 del dominio XIAP RING fue implicado en la mediación de la migración celular y la polimerización de actina
Para explorar aún más la importancia biológica de β cambio de la expresión regulada por actina dominio XIAP ANILLO, Herida ensayo de curación se realizó para comparar las tasas de migración entre varios transfectantes portadoras de diferentes dominios de XIAP como se identifica en la figura. 3B. De acuerdo con defectos en la expresión de β-actina, ni introducción de HA-XIAP ΔRING ni HA-XIAP H467A podría revertir el deterioro en la migración celular de XIAP
- /- las células, mientras que la expresión de larga duración HA-HA-XIAP o XIAPΔBIR, ambos de los cuales posee dominio RING intacto, restauró la reducción de la capacidad de migración de las células causada por el agotamiento de XIAP (Fig. 4A). Mientras que debido a la baja expresión relativa de HA-XIAPΔBIR en comparación con la de HA-XIAP en los transfectantes individuales (Fig. 3B), la tasa de curación de la herida observada en HA-XIAPΔBIR-expresión de transfectantes fue más lenta que la de HA-XIAP- las células que expresan (Fig. 4A). El porcentaje de área de la herida dejó un-cerrado el 4
º día en comparación con el encendido 0 día se cuantificó usando el software de análisis de migración de la célula, lo que demuestra que las áreas de heridas en XIAP
- /- (vector), HA- XIAP ΔRING y HA-XIAP H467A transfectantes fueron marcadamente más alta que en las células HCT116 WT (Fig. 4B). Por lo tanto, se sugirió que la actividad ligasa E3 del dominio RING jugó un papel importante en la motilidad celular mediada por XIAP.
(A), el comportamiento de la migración celular se evaluó con un ensayo de cicatrización de heridas, y las imágenes fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo. Barra de escala de 300 micras. (B), el área de la herida dejó un-cerrado en el 4
º día se cuantificó usando el software de análisis de la migración celular, y los datos cuantitativos se demostró como se indica (barras de error representan S.D., n = 2). El asterisco (*) indica una diferencia significativa en el porcentaje de área de la herida en comparación con la de las células WT (Vector) (
p Hotel & lt; 0,05).
Los filamentos de actina desempeñan un centro papel en numerosas funciones celulares, tales como la migración celular y la regulación morfológico [35]. Para determinar la posible participación de diferentes dominios de XIAP en la regulación de la polimerización de actina, se trataron las células con EGF, y después se extrajo células para la determinación de los niveles de F-actina por citometría de flujo utilizando los transfectantes estables mencionados anteriormente. Una vez más, las formaciones de F-actina inducidos por el tratamiento de EGF eran obviamente obtuvieron en las células HCT116 WT, XIAP
- /- (HA-XIAP) y XIAP
- /- (HA-XIAP ΔBIR) transfectantes, mientras que no hubo inducción de F-actina observables en XIAP
- /- (vector), XIAP
- /- (HA-XIAP ΔRING) o XIAP
- /- (HA-XIAP H467A) transfectantes (Fig. 5A) . El resultado cuantificación se muestra en la Fig. 5B. En conjunto, nuestros resultados demostraron que la función de dominio XIAP ANILLO en la regulación de actina de polimerización y de células motilidad estaba mediada por la actividad de ligasa E3.
(A), las células indicadas se trataron con o sin EGF y F- inducción actina se analizó por citometría de flujo. (B), Los datos cuantitativos se demostró como se indica (barra de error representan S.D., n = 2). El asterisco (*) indica una diferencia significativa en la inducción de la actina F en comparación con la de las células WT (Vector) (
p Hotel & lt; 0,05).
XIAP ANILLO de dominio con el que tratamos RhoGDI, independiente de su actividad ligasa E3
Nuestro trabajo reciente demostró que RhoGDI estuvo involucrado en la polimerización de actina regulada por XIAP [23]. Por lo tanto hemos detectado la interacción física entre estas dos moléculas por la co-inmunoprecipitación utilizando anticuerpo específico anti-XIAP. Los resultados mostraron que RhoGDI se detectó en el complejo co-inmunoprecipitado en XIAP
+ /+, pero no XIAP
- /- células HCT116 (Fig. 6A), lo que sugiere que podría interactuar con RhoGDI endógeno XIAP. La interacción entre XIAP y RhoGDI fue verificado recíprocamente mediante la detección de XIAP en el complejo de co-inmunoprecipitación tirado hacia abajo por transfectantes de anticuerpos anti-GFP usando de XIAP
- /- (HA-XIAP /GFP-RhoGDI), mientras que no hubo ningún nivel detectable de XIAP en el complejo de Co-IP en transfectantes de XIAP
- /- (HA-XIAP /GFP-vector) (figura 6B.). Luego derribaron RhoGDI en WT y XIAP
- células para confirmar la participación de RhoGDI en la motilidad celular /-. Cicatrización de heridas resultados del ensayo mostró que desmontables de RhoGDI en las células WT no causó un cambio obvio en la velocidad de cierre de la herida, sin embargo se observó un notable aumento de la migración celular en XIAP
- /- células (shRNA-RhoGDI) en comparación con la de el control no silenciar, XIAP
- /- células (no silenciar) (Fig. 6C). Consistentemente, desmontables de expresión RhoGDI también incrementó el contenido de F-actina en XIAP
- células (Si-RhoGDI) expuestos a EGF (Fig 6D, p & lt; 0,05.) - /. Las secuencias del gen RhoGDI (401-419), que era complementaria a ARNsi oligonucleótido en pEGFP-C3 /RhoGDI re-construcción, se mutaron para evitar la destrucción de ARNm exógeno por RhoGDI siRNA [36]. Como se muestra en la Fig. 6E, la sobreexpresión de pEGFP-C3 /RhoGDI-re fue identificado en XIAP
- /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re). Esta expresión reconstituyente de RhoGDI en XIAP
- /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) polimerización de la actina atenuada dramáticamente inducida por el tratamiento de EGF en comparación con la de XIAP
- /- células (Si-RhoGDI) (2 % vs. 14%, p & lt; 0,01, Fig 6F).. Además, la expresión reconstituyente de RhoGDI en XIAP
- /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) células restauradas papel inhibitorio de RhoGDI en la formación de actina filamentosa (Fig 6G.), Lo que sugiere que la reintroducción de RhoGDI-re compensación habilitado para la pérdida de de la función endógena RhoGDI en la polimerización de actina en XIAP
- células - /. Nuestros resultados proporcionaron pruebas de que RhoGDI podría estar implicada en la regulación de XIAP ANILLO dominio mediada por la polimerización de la actina y la migración celular
(A), lisados de WT y XIAP
-. /- Células HCT116 fueron co-inmunoprecipitada con anti-anticuerpo XIAP (ratón) o IgG de ratón normal, y los inmunoprecipitados se sometieron después a inmunotransferencia con anticuerpos anti-XIAP (conejo) anti-RhoGDI (conejo) o. El cinco por ciento de los lisados se utilizó como entrada. (B), XIAP
- /- células (HA-XIAP) fueron transfectadas transitoriamente con la GFP-RhoGDI o vector vacío, GFTP-vector. Co-inmunoprecipitación se realizó con perlas de agarosa anti-GFP de anticuerpos conjugados. Los inmunoprecipitados se sometieron a inmunotransferencia usando anticuerpos como se indica. (DO). transfectantes estables de shRNA-RhoGDI en WT y XIAP
- /- Se identificaron las células. La migración celular se determinó por ensayos de cicatrización de heridas en los tiempos indicados entre no silenciamiento y transfectantes shRNA-RhoGDI en WT y XIAP
- /- las células, respectivamente. El área de la herida se cuantificó usando software de análisis de la migración celular, y los datos cuantitativos se demostró como se indica (bar de error representan S.D., n = 3). El asterisco (*) indica una diferencia significativa entre las líneas de células indicadas (
p
& lt; 0,05). Barra de escala de 300 micras. (D), las células indicadas se trataron con EGF por 1 min para la determinación de la inducción de F-actina por citometría de flujo. (E), La expresión constitutiva de GFP-RhoGDI-Ra en XIAP
- /- (Si-RhoGDI) se verificó por transferencia Western. (F y G), la inducción relativa de F-actina en presencia de EGF se determinó por espectrofotómetro (F), y se observaron niveles de actina filamentosa bajo microscopía confocal (G) en los transfectantes indicados. El asterisco (*) indica un aumento significativo en comparación con los de XIAP
- /- (Si-Control) (
p
& lt; 0,05), y el (♣) indica una disminución significativa en comparación a los de XIAP
- /- células (Si-RhoGDI) (
p Hotel & lt; 0,001, n = 3) guía empresas
para determinar los dominios de XIAP específicos implicados en la interacción. con la proteína RhoGDI, que co-transfectadas GFP-RhoGDI construir con HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING y HA-XIAP ΔBIR respectivamente, en XIAP
- - /células. Como se muestra en la Fig. 7A, se detectó HA-tag en el co-inmunocomplejo tira hacia abajo por el anticuerpo anti-GFP en transfectantes que albergan HA-XIAP y HA-XIAP ΔBIR. Además, se observó una afinidad similar a GFP-RhoGDI en transfectantes de HA-XIAP H467A, una mutación con pérdida de actividad de ligasa E3 en el dominio RING. Si bien sólo se observó una banda marginal de HA en el complejo inmunológico de transfectantes ΔRING HA-XIAP, revelando que XIAP ANILLO dominio jugó un papel en la interacción con RhoGDI independiente en su actividad ligasa E3. Además, aunque dominio RING de XIAP podría unirse a RhoGDI, su interacción no dio lugar a la ubiquitinación de RhoGDI (Figs. 7B y 7C). La conjugación de ubiquitina a RhoGDI apenas se detecta incluso en presencia de ubiquitina de tipo salvaje exógena en el complejo inmunológico empujado hacia abajo por la GFP que fue etiquetada con RhoGDI (Fig. 7B). Tampoco expresan mutante de ubiquitina hacen posibles reducciones evidentes en la ubiquitinación de RhoGDI (Fig. 7B). Además, no hubo diferencias observables en RhoGDI ubiquitinación entre las células WT y XIAP
- /- las células (Fig. 7B). Los resultados similares se reproducen en células 293T tal como se muestra en la Fig. 7C. Por lo tanto, se sugirió que, si bien se requiere la actividad E3 ligasa para la migración celular mediada por XIAP, no era esencial para RhoGDI vinculante, ni para su modificación ubiquitinational
(A), XIAP
-. /- las células fueron transfectadas con GFP-RhoGDI, junto con HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING, o HA-XIAP ΔBIR. Co-inmunoprecipitación se realizó con perlas de agarosa anti-GFP de anticuerpos conjugados. Los inmunoprecipitados se sometieron a inmunotransferencia para la detección de XIAP usando un anticuerpo HA. (SEGUNDO). WT (Vector), XIAP
- /- (Vector) y XIAP
- /- (HA-XIAP) HCT116 células fueron transfectadas con las construcciones de GFP-RhoGDI en combinación con ubiquitina-WT, ubiquitina-K48R, ubiquitina -K63R o ubiquitina-K48R /K63R (KKRR). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se lisaron las células y co-inmunoprecipitó con anticuerpo anti-GFP, y luego a inmunotransferencia con anticuerpos anti-GFP anti-Ub y. (C), las células 293T fueron transfectadas con diversas construcciones, como se indica para la detección de RhoGDI ubiquitinación por anticuerpos anti-GFP anti-Ub y. (D), un modelo para la modulación regulada-XIAP de la motilidad celular: XIAP se une a RhoGDI a través de su dominio RING e inhibe RhoGDI Sumoylation que se traduce en la baja regulación de la función de RhoGDI y promueve la polimerización de la actina y la motilidad celular. O actividad ligasa E3 del dominio XIAP anillo podría regular algunos factores ONU-verificado que posteriormente controlan la migración celular independiente de los RhoGDI vinculante.
Discusión
Nuestros hallazgos previos han demostrado que ya sea por nocaut o desmontables de XIAP disminuyó la migración de células HCT116 y la invasión [23]. En el presente estudio, hemos proporcionado la base estructural de XIAP para sus funciones reguladoras en la metástasis del cáncer. Mediante la introducción de diferentes dominios de XIAP en XIAP
- /- las células, nuestro trabajo mostró que se requería ANILLO dominio en lugar de dominio BIR para la expresión β-actina, la migración celular, así como la interacción RhoGDI. la actividad ligasa E3 del dominio RING contribuyó a los dos primeros efectos, pero no participó en RhoGDI vinculante ni su modificación ubiquitinational, lo que indica que el papel de XIAP en la regulación de la motilidad celular fue desacoplada de sus propiedades caspasa-inhibidor, pero relacionado con su función en el anillo que atribuible en parte a la interacción física con RhoGDI (Fig. 7D).
En el ensayo de curación de heridas, se encontró que la expresión reconstituyente de larga duración HA-HA-XIAP y XIAP ΔBIR, ambos con anillo de dominio, en XIAP
- /- células HCT116 restauran la motilidad de las células cancerosas, mientras que la introducción de HA-XIAP ΔRING o mutante H467A, que abolió su función E3 ligasa, no mostró la restauración obvia, lo que demuestra que la actividad ligasa E3 del dominio XIAP ANILLO jugó un papel en la regulación de XIAP de la motilidad de las células cancerosas. Las alteraciones en los niveles de ß-actina despertadas por expresar diversos dominios de XIAP fueron consistentes con sus efectos en la migración celular. El jefe intracelular "motor" de la migración celular es citoesqueleto de actina [37]. Estudios previos han sugerido que el EGF induce la migración celular por reorganización de citoesqueleto de actina y la acumulación masiva de F-actina [38]. En nuestros estudios, mal funcionamiento de la polimerización de actina en XIAP
- /- células podrían ser rescatados por la expresión re-constitucional de ya sea de longitud completa HA-XIAP o HA-XIAP ΔBIR, mientras que la sobreexpresión de HA-XIAP ΔRING o H467A mostró ninguno de esas restauraciones. De acuerdo a nuestros resultados, datos no publicados de Mehrotra también aclamados que la actividad ligasa E3 de XIAP era crítica para su papel regulador en la metástasis de las células basado en la observación de que H467A XIAP mutante falló en sinergia con survivina en la estimulación de NFkB dependen de la vía [24]. Por lo tanto, era evidente que la función de XIAP en la regulación de la migración celular era dependiente de su actividad ligasa E3 de dominio RING en lugar de relacionada con su potencial anti-apoptóticos.
Se ha sugerido que el papel de los PAI en la celda motilidad puede ser evolutivo conservado desde el homólogo DIAP1
Drosophila
IAP ha sido implicado en la migración celular y morfogénesis mediante el control de la actividad de caspasa no apoptótico [13]. DIAP1 se ha demostrado para promover la migración de las células del folículo dentro de la cámara de huevos durante el
Drosophila
ovogénesis a través de la regulación de la actividad de la pequeña GTPasa, Rac. Las mutaciones en DIAP1 exhiben defectos en la migración celular, probablemente debido a alteraciones en la organización celular dependiente de actina [13], lo cual era bastante similar a lo que hemos observado en XIAP
- /- células en los estudios actuales. GTPasas pequeñas desempeñan funciones importantes en una plétora de eventos celulares, como la regulación de los sistemas de actina filamentosa [39]. La familia Rho GTPasas actúan como interruptores de ciclismo molecular entre PIB determinada forma inactiva en el citosol y el estado unido a GTP activo en la membrana citoplasmática [40]. RhoGDI se caracterizó como un regulador por disminución de Rho GTPasas extrayéndolos de las membranas y la solubilización de ellos en el citosol. RhoGDI también puede interactuar con las regiones de cambio de GTPasas y restringir el acceso a GEFs y las lagunas a fin de mantener GTPasa en los estados inactivos [39]. Como ya informamos aquí, XIAP fue capaz de interactuar físicamente con RhoGDI e inhibir su actividad en la regulación de la actina del citoesqueleto de montaje. Así que cuando XIAP fue altamente expresado, la actividad RhoGDI se suprimió el cual proporciona una explicación para las observaciones que la anulación de RhoGDI en las células HCT116 WT no afectar el ritmo de cierre de la herida ya que la actividad RhoGDI ya ha sido inhibida por XIAP, mientras que en XIAP
- /-. celdas en las que el efecto represivo sobre la actividad RhoGDI era invalida, RhoGDI derribando mucho más evidentes efectos biológicos expuestos
Además, nuestros estudios han demostrado que el dominio RING (XIAP ΔBIR), pero no los dominios BIR (XIAP ΔRING ), podría ser co-inmunoprecipitado en el complejo inmune utilizando el anticuerpo específico contra GFP-RhoGDI. Aunque se demostró la actividad de ligasa E3 de dominio RING que se requiere para la migración celular, el deterioro de su función por mutación H467A no afectó la interacción con RhoGDI. Así es la hipótesis de que, además de RhoGDI, puede haber otros objetivos de abajo de la actividad ligasa E3 de XIAP responsable del control de la motilidad celular, como NFkB [24] o algunos factores-ONU identificado. Aunque la actividad ligasa E3 de XIAP contribuyó a autoubiquitination de sí mismo y ubiquitinación de sus compañeros de unión, como Smac y AIF XIAP, RhoGDI no fue sometido a la conjugación de ubiquitina incluso cuando XIAP se sobreexpresa.
En conjunto, nuestros estudios actuales revelan que la actividad ligasa E3 del dominio XIAP ANILLO contribuyó a la polimerización de actina, la formación del citoesqueleto y la migración celular. Aunque se requiere anillo de dominio para la interacción mediada RhoGDI cuales motilidades celulares, su actividad ligasa E3 no estaba implicado en la unión o RhoGDI ubiqutination. La base molecular alternativa para su actividad ligasa E3 aún queda completamente caracterizada.
Materiales y Métodos
Los plásmidos
Los plásmidos que expresan HA-etiquetados XIAP, HA-XIAP ΔRING, HA-XIAP ΔBIR, HA-XIAP H467A, y PEBB-HA expresión vector vacío, fueron regalos de Dr. Colin S Duckett (Universidad de Texas en Austin, Austin, TX) [16]. vector pEGFP-C3 /RhoGDI que expresa la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados RhoGDI y Rac1 fue proporcionado amablemente por el Dr. Mark R. Philips (Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE.UU.). ARNp-U6 /siRhoGDI y pEGFP-C3 /mRhoGDI (gen RhoGDI se mutó de 403-AAA GGC CGC AAG ATT GAC-420 a 403-AAG GGA GTA AAA ATC GAT-420 para evitar la destrucción de ARNm exógeno por el correspondiente ARNsi) era proporcionada por el Dr. BL Zhang como se describe anteriormente [36]. XIAP humana y RhoGDI shRNA plásmidos fueron adquiridos de Applied Abierta (Pittsburgh, PA)
Cultivo de células y transfección
De tipo salvaje y XIAP
-. /- Células HCT116 (cáncer de colon humano líneas de células) fueron regalos de tipo doctor Bert Vogelstein (Instituto Médico Howard Hughes y Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Los Hopkins Medical Institutions Johns, Baltimore, MD) [37]. WT y XIAP
- /- células HCT116 se cultivaron en medio de McCoy 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Nova-Tech, Grand Island, NE) y penicilina /estreptomicina (Life Technologies , Grand Island, NY). transfecciones celulares se realizaron con Lipofectamine reactivo (Invitrogen) o FuGENE® reactivo de transfección HD (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Para la transfección estable, los cultivos se sometieron a la higromicina B o G418 o la selección de medicamentos puromicina (Life Technologies), y las células supervivientes de la selección de antibióticos se agruparon como transfectantes estables de masas. Estos transfectantes estables se cultivaron en el medio libre de antibióticos seleccionado por al menos dos pasos antes de su uso en los experimentos.
Curación de Heridas Ensayo
Las células se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos y cultivaron hasta 80% de confluencia. Las heridas fueron hechas con puntas de pipeta estériles. Las células se lavaron con PBS libre de suero y después se cultivaron en medio normal para los diversos puntos de tiempo. Las fotografías fueron tomadas cada 24 h hasta que la herida se curó en las células de los padres [41]. El área de la herida se cuantificó usando el software de análisis de la célula de Migración (Muscale LLC, Scottsdale, AZ).
invasión celular Ensayo
Un BD BioCoatTM MatrigelTM Cámara Invasion (BD Biosciences, San Diego, CA) se utilizó para el ensayo de invasión. Las células (2,5 × 10
4) fueron sembradas por plaquita por triplicado en medio 5A de 500 l de suero libre de McCoy. Los insertos se colocaron en pocillos que contienen 500 l de medio con FBS al 5% y TPA (20 ng /ml). Las células se incubaron durante 72 h en una incubadora con 5% de CO
2 atmósfera humidificada. Luego, las células en la superficie superior de los filtros fueron fotografiados primero y luego se retira completamente frotando con un hisopo de algodón. La membrana se cortó con un escalpelo afilado y se coloca en la placa de 96 pocillos.