Extracto
Múltiples actividades se atribuyen al factor de necrosis tumoral citoquinas (TNF) en la salud y la enfermedad. En particular, el TNF se demostró que afectará a la carcinogénesis de múltiples maneras. Esta citoquina actúa a través de la activación de dos receptores de superficie celular, TNFR1, que se asocia con la inflamación, y TNFR2, que fue demostrado que causa la señalización anti-inflamatoria. Se evaluaron los efectos de TNF y de sus dos receptores en la progresión del cáncer de páncreas en un
in vivo
imágenes de bioluminiscencia en un modelo de ratón ortotópico tumor singénico con células Panc02. Los ratones deficientes para TNFR1 no fueron capaces de rechazar de forma espontánea tumores Panc02 y además muestra la progresión del tumor mejorada. Por el contrario, una fracción de tipo salvaje (37,5%), TNF deficiente (12,5%), y ratones deficientes TNFR2 (22,2%) fueron capaces de rechazar completamente el tumor dentro de las dos semanas. Los tumores pancreáticos en ratones deficientes TNFR1 muestran una mayor densidad vascular, mejoran la infiltración de células CD4
+ T y CD4
+ forkhead cuadro de P3 (FoxP3)
+ células T reguladoras (T
reg), pero redujo los números de CD8 + células T
. Estas alteraciones fueron acompañadas adicionalmente por la regulación positiva de la transcripción de IL-4. Por lo tanto, TNF y TNFR1 se requieren en el carcinoma ductal pancreático para asegurar una óptima CD8
+ T-vigilancia inmunológica mediada por células del tumor y rechazo. La administración exógena sistémica de TNF humano, sin embargo, que sólo interactúa con TNFR1 murino, se aceleró la progresión tumoral. Esto sugiere que TNFR1 tiene básicamente la capacidad en el modelo Panc02 para desencadenar efectos pro-y anti-tumorales, pero la disponibilidad de espacio-temporal de TNF parece determinar finalmente el resultado global
Visto:. Chopra H, I Lang, Salzmann S, Pachel C, Kraus S, Bäuerlein CA, et al. (2013) Factor de Necrosis Tumoral induce la promoción de tumor y efectos anti-tumorales en cáncer de páncreas a través de TNFR1. PLoS ONE 8 (9): e75737. doi: 10.1371 /journal.pone.0075737
Editor: Dominik Hartl, Universidad de Tübingen, Alemania |
Recibido: 24 Julio, 2013; Aceptado 21 de agosto de 2013; Publicado: 30 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Chopra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Interdisziplinäre der Forschung Zentrum für Klinische Universität Würzburg [otorga B-149, B-233], Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung eV (R /06/17), la Deutsche Forschungsgemeinschaft [subvenciones SFBTR 52 Z2, Wa 1025 /18-1, de KFO 216 DT8, y Ma 760 /19-1] y el Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2010_Kolleg.52) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) es una de las enfermedades más devastadoras con excepcionalmente pobres tasas de supervivencia a los 5 años y las opciones terapéuticas muy limitadas [1] - [3]. Varias vías de señalización son perturbados en el cáncer de páncreas y esto no sólo afecta a las células tumorales directamente, sino que también se aplica a las células del estroma dentro y alrededor del tumor [4] - [6]. Especialmente la señalización NF-kB es comúnmente desregulado en PDA [7] - [9]. Un activador importante de NF-kappa B es el factor de necrosis tumoral de citoquinas (TNF), que es producida principalmente por las células inmunes activadas, especialmente macrófagos y las células T, pero también puede ser expresada por las células tumorales [10], [11].
el TNF es una proteína transmembrana de tipo II trimérica de la que una forma soluble es liberada por el procesamiento proteolítico. Las dos formas de TNF interactúan con dos receptores, TNFR1 y TNFR2, pero difieren en su capacidad para activar estos receptores. TNF unido a la membrana activa fuertemente ambos receptores, mientras que TNF soluble, a pesar de la unión a TNFR2, sólo activa TNFR1 adecuadamente [12]. Mientras TNFR1 es un representante típico del subgrupo contiene el dominio de la muerte de la familia de proteínas del receptor de TNF, TNFR2 pertenece al subgrupo TRAF interactuar. A pesar de que tiene un dominio de muerte, TNFR1 en respuesta a TNF inicia principalmente vías de señalización pro-inflamatorias que conducen a la activación de NF-kB factores de transcripción y varios MAP quinasas, pero normalmente no en la inducción de la muerte celular. Es evidente a partir del análisis de los ratones knockout TNFR1 y TNFR2 que muchos procesos inmunorreguladores están controlados por los dos receptores de TNF en un antagonista, aditivo o incluso de manera sinérgica pero también hay evidencia de funciones autónomas de cada uno de los dos receptores [11], [13]. En particular, TNFR2 ha demostrado desempeñar un papel importante en la homeostasis de las células T reguladoras inmunosupresores (T
, reglas) [14] - [16].
En el cáncer de páncreas TNF juega un complejo pero hasta ahora papel mal entendido [17] - [23]. A continuación, nos dirigimos a la forma del TNF y sus receptores impacto en el control inmunológico del CAP en un modelo de ratón ortotópico singénico. La pérdida de TNFR1 dentro del huésped abrogó el control del tumor y dio como resultado el crecimiento del tumor mejorada. deficiencia de TNFR1 causada desregulación de la infiltración de células T y la activación. Proponemos un nuevo papel anti-tumorigénico de acogida TNFR1 en PDA, donde el TNF-TNFR-interacciones regulan la homeostasis de ambas células T reguladoras y citotóxicas decidir si PDA se controla y, finalmente, rechazado o crece progresivamente.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la normativa alemana para la experimentación con animales. El estudio fue aprobado por el Regierung von Baja Franconia como autoridad responsable (Permiso Número 55.2-2531.01-76 /10). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia esketamine /xilacina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Animales
C57BL /6 deficientes para el TNF (B6.129S-TNF
tm1Gkl /J , corta B6.TNF KO), TNFR1 (C57BL /6-TNFRSF1A
tm1Imx /J, corta B6.TNFR1 KO), TNFR2 (B6.129S7-TNFRSF1B
tm1Imx /J, corta B6.TNFR2 KO), TNFR1R2 (B6.129S-TNFRSF1A
tm1ImxTnfrsf1b
tm1Imx /J, corta B6.TNFR1R2 KO) se obtuvieron inicialmente de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME, EE.UU.) y backcrossed para el albino C57BL /6 antecedentes (C57BL /6J-Tyr & lt; c-2J ratones, Jackson Laboratories) para una mejor
in vivo
sensibilidad en la bioluminiscencia de imágenes (disminución de la absorción de la luz debido a la falta de melanina en la piel) como se describe anteriormente [16]. Los genotipos de los ratones KO se verificaron rutinariamente por PCR. Los ratones hembra fueron utilizados para experimentos de entre 8 y 12 semanas de edad. Todos los animales fueron criados dentro de las instalaciones de animales libres de gérmenes patógenos específicos del Centro Experimental de Medicina Molecular del Hospital de la Universidad, Würzburg recibir comida para roedores y en autoclave beber agua ad libitum.
Cell Cultura y
Para la transducción lentiviral de células Panc02 [24], 293 T Las células fueron transfectadas transitoriamente con un protocolo de precipitación con fosfato de calcio estándar en placas de 10 cm con 10 g pMDL y 5 g plásmidos de encapsidación RSV-REV, plásmido de la cubierta /G 6 g VSV y 20 g de la eGFP y luciferasa de luciérnaga plásmido que codifica FUGLW. Dos días más tarde, el sobrenadante que contiene las partículas lentivirales se aspiró, se filtró a través de un filtro de 0,45-micras, se añadieron 8 g polibreno /ml y la mezcla se utilizó para transducir las células tumorales. Las células transducidas fueron ordenados flujo dos veces para EGFP-expresión, denominado en lo sucesivo Panc02-FUGLW. Las células se mantuvieron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de antibióticos (penicilina, estreptomicina), L-glutamina y 0,1% β-mercaptoetanol. Las células se tripsinizaron y se pasaron dos veces por semana. Cell medio de cultivo y los suplementos fueron obtenidos de Invitrogen (Darmstadt, Alemania), todos los artículos de plástico era de Greiner BioOne (Frickenhausen, Alemania). células Panc02-FUGLW son singénicos a ratones C57BL /6.
PDA ortotópico modelo y se trataron con tripsina En Vivo La bioluminiscencia de imágenes
células
Panc02-FUGLW, se recogieron y se lavaron dos veces con PBS. Los ratones receptores se anestesiaron con i.p. inyección de 80 mg /kg de peso corporal (pc) clorhidrato esketamine (Pfizer, Berlín, Alemania) y 16 mg /kg de peso corporal xilacina (cp Pharma, Burgdorf, Alemania) y se colocaron en una placa de calentamiento 37 ° C. Se inyectaron células Panc02-FUGLW ortotópicamente como se describe en otra parte [17], [25], con ligeras modificaciones. En pocas palabras, la cavidad abdominal se abrió por una laparotomía transversal mínima invasión. se identificó y se exterioriza la cabeza del páncreas. 1 × 10
4 células Panc02-FUGLW viables se inyectaron lentamente en 30 l de PBS en la cabeza del páncreas usando un 710 RN 100 l jeringa Hamilton con un calibre 28, 10 mm, Punto Estilo 4 agujas (jeringas Hamilton, Bonaduz , Suiza). El páncreas se colocó de nuevo en la cavidad abdominal y el peritoneo y la piel se cierra mediante la ejecución de una sola capa de 6-0 suturas de poliglactina (Johnson & amp; Johnson, Norderstedt, Alemania).
Para TNF tratamiento, los ratones se inyectaron ip con TNF humano 5 g en 200 l de PBS cada dos días comenzando el día de la inoculación de células tumorales. Para
in vivo
bioluminiscencia de imágenes [26], los ratones fueron anestesiados y co-inyectados con 300 mg /kg de peso corporal D-luciferina (Biosynth, Staad, Suiza). Diez minutos más tarde, las señales de bioluminiscencia de los ratones anestesiados fueron evaluados con un sistema de imágenes IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Mainz, Alemania). Se tomaron fotos de la vista lateral en modo automático con un tiempo máximo de exposición de cinco minutos por imagen. Imágenes fueron evaluados utilizando software de imagen vida 4.0 (Caliper Life Sciences).
Ex vivo
Imaging
En el día 23 o 30 después de la inoculación de las células tumorales, los ratones fueron inyectados con D -luciferin y 10 minutos más tarde sacrificados. Los órganos internos se eliminaron y se sometieron a
ex vivo
bioluminiscencia de imágenes [26]. Las muestras de tejido se incluyeron en Tissue Tek OCT (Sakura Finetek, Staufen, Alemania) para su posterior análisis histológico.
Aislamiento de células inmunes a partir de tejido pancreático y bazos
Los tejidos se picada con una cuchilla quirúrgica y digerido durante 45 minutos a 37 ° C con 2 mg /ml de colagenasa D y 0,1 mg /ml de DNasa I (ambos de Roche, Mannheim, Alemania). piezas de tejido se trituran a través de un filtro de células de 70 micras y se centrifugan. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis de eritrocitos (NH 168 mM
4Cl, mM de KHCO 10
3, 0,1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) y se incubó durante 2 minutos. A continuación, se añadieron 10 volúmenes de PBS y las células se centrifugaron de nuevo. El sedimento resultante se resuspendió en PBS y se utilizaron las células para citometría de flujo. Los bazos se filtraron directamente a través de un filtro de 70 micras de células en tampón de lisis de eritrocitos y se lavaron una vez con PBS.
inmunofluorescencia Microscopía
Cryo-incrustados tejidos se cortaron en 3 micras de grosor en un criostato Leica CM1900 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se montaron en portaobjetos esmerilado. Las láminas fueron y se fijaron con acetona a temperatura ambiente durante 7 minutos se secó al aire. Los portaobjetos se lavó y se bloqueó con 2% de FBS en PBS durante 15 minutos. Cuando se utilizaron anticuerpos conjugados con biotina, se realizó bloqueo adicional utilizando un kit de bloqueo de avidina /biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Los portaobjetos se incubaron después con los anticuerpos apropiados para 1 hora a temperatura ambiente. Entre el anticuerpo en las incubaciones, los portaobjetos se lavaron con PBS tres veces. Las diapositivas se counterstained con DAPI y montado con medio de montaje (Vector Laboratories). Los anticuerpos utilizados fueron: CD11b-Alexa 647 (M1 /70), CD31-Biotina (MEC13.3), CD4-Alexa 647 (GK1.5), CD8-Biotina (53-6,7), Foxp3-purificado (fjk-16) (eBioscience), burro anti-rata-Cy3 (Dianova, Hamburgo, Alemania), F4 /80-Alexa 488 (IC: A3-1), GR-1-biotina (RB6-8C5), estreptavidina-Alexa 546 (Invitrogen ). Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de fluorescencia Zeiss Imager.Z1m (Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) y se evaluaron usando el software Zeiss AxioVision (Carl Zeiss). Las células inmunes se contaron y se dan como células /mm
2 o como píxeles /150 000 m
2 como se evaluó por el software Image J (NIH, Bethesda, MD).
Citometría de Flujo
Las células se bloquearon con suero de rata normal (1:20 en PBS) y se tiñeron con los anticuerpos apropiados a 4 ° C durante 30 min. Después de la tinción del antígeno de superficie, las células se lavaron una vez con PBS y se marcaron con yoduro de propidio. Para la tinción intracelular, las células se tiñeron con el kit de tinción de células muertas violeta LIVE /DEAD corregible (Invitrogen) y se procesan adicionalmente usando el ratón tinción de células T reguladoras kit#2 (eBioscience, Frankfurt, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los anticuerpos utilizados fueron de Biolegend (Uithoorn, Países Bajos) si no se indica lo contrario: α4β7-PE (DATK32), CCR4-APC (2G12), CCR5-PE (C34-3448), CCR7-APC (4B12), CD102-Biotina ( 3C4 (MIC2 /4)), CD103-Pacific Blue (2E7), CD106-Alexa 488 (429), CD107a-FITC (1D4B), CD107b-Alexa 647 (M3184), CD11a-PE (M17 /4) (BD) , CD11b-Alexa 647 (M1 /70), CD11b-PE /Cy7 (M1 /70), CD11c-Alexa 647 (N418), CD25-PE (PC61.5) (eBioscience), CD24-PE (LG.7F9) (eBioscience), CD29-PE (HMβ1-1), CD4-FITC (RM4-5) (eBioscience), CD4-APC (RM4-5), CD44-PE (IM7), CD45.1-PE (A20), CD45.2-APC (104), CD49d-Alexa 647 (RI-2), CD49f-Alexa 488 (GoH3), CD54-PE (YN1 /1.7.4), CD62E-PE (10E9.6) (BD), CD62L-APC /Cy7 (MEL-14), CD69-Pacific Blue (H1.2F3), CD8-PE /Cy7 (53-6,7), CXCR3-APC (CXCR3-173), CXCR4-Alexa 488 (2B11) (eBioscience ), E-selectina proteína de fusión de IgG (R & amp; D Systems, Wiesbaden, Alemania), F4 /80-Alexa 488 (C1: A3-1), Foxp3-APC (fjk-16) (eBioscience), Ly6G-PE (1A8 ) (BD), proteína de fusión de P-Selectina IgG (BD), TNFR1-APC (55R-286), TNFR2-PE (TR75-89), de cabra anti-IgG humana-PE (Jackson), estreptavidina-Alexa 546 ( Invitrogen). Todos los experimentos se realizaron en un BD FACS Canto II (BD) y datos de la muestra grabada usando el software BD FACSDiva y analizados mediante el software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón, EE.UU.).
Aislamiento de RNA, transcripción inversa y QRT -PCR
se aisló el ARN a partir de muestras de tejido utilizando Qiashredder y RNeasy mini columnas Spin kit (Qiagen, Hilden, Alemania). 1 g de ARN total se transcribió de forma inversa usando el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Expresión de genes de interés (secuencias de cebadores se pueden encontrar en la Tabla 1) se analizó en un termociclador iCycler (Bio-Rad, Munich, Alemania), utilizando iTaq universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) y β-actina como gen de referencia. Los niveles de expresión se calcularon utilizando el ΔΔC
T método.
in vitro
TNF Tratamiento y Análisis de las capacidades metastásicas en
1 × 10
5 Panc02 células por pocillo se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejan durante la noche. Las células fueron tratadas con 1,67 nM de TNF humano o 1,67 nM murina TNF durante 48 h, se recogieron raspando suavemente la monocapa de la superficie de plástico, se lavaron dos veces con PBS y se evaluó para la expresión de moléculas de adhesión y receptores de quimioquinas por citometría de flujo.
para probar la capacidad de las células Panc02 para unir a los diferentes componentes de la matriz extracelular, se utilizó el 48 pocillos ensayo de adhesión celular CytoSelect (Biolabs celulares, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para probar la capacidad de las células para invadir Panc02 la membrana basal, se utilizó el CytoSelect 24-Well Cell Invasion Ensayo (célula Biolabs) según las instrucciones del fabricante.
células Panc02 no tratados y tratados con TNF se evaluaron adicionalmente durante la actividad de metaloproteinasas de la matriz MMP-2 y MMP-9 por zimografía de gelatina. Para el aislamiento de proteínas, tejido de miocardio de un corazón de ratón infartado, así como sedimentos celulares Panc02-FUGLW se homogeneizaron con tampón RIPA y PMSF (Cell Signaling, Frankfurt, Alemania). Las muestras se separaron en un gel de poliacrilamida al 10% que contiene 2,5 mg /ml de gelatina a un voltaje constante de 120 V durante 2 horas a 4 ° C. Después de la electroforesis, las proteínas se renaturated por incubación de los geles en 2,5% de Triton X-100 durante 90 min a temperatura ambiente. Los geles fueron incubadas en tampón de activación (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, CaCl2 5 mM, 0,2 M NaCl, y 0,02% de Brij-35) durante 12 horas a 37 ° C. Finalmente, los geles se tiñeron durante 1 h con una solución de tinción con azul de Coomassie al 0,5% y después se destiñeron en 40% v /v de metanol, 10% v v /ácido acético para revelar bandas de compensación que indican la actividad proteolítica. La intensidad de las bandas se cuantificó usando ImageJ (versión 1.44p)
Estadísticas
Todos los gráficos que se muestran son los datos de al menos dos experimentos independientes combinado.; el número de animales se indica en las leyendas de las figuras. Todos los datos se muestran como media ± error estándar de la media. Estas cifras fueron preparadas usando el software GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, EE.UU.) y Adobe Photoshop 7 (San Jose, CA, EE.UU.). Todos los grupos se compararon con el tipo salvaje o el grupo de control no tratado, respectivamente, por la prueba t de dos colas de Student no apareado utilizando el software GraphPad InStat 3. Los datos que alcanzan significación estadística se indican como: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01
Resultados
Pérdida de anfitrión TNFR1 abroga el rechazo espontáneo de tumores ortotópico Panc02
. para seguir el crecimiento del tumor de forma no invasiva en un modelo singénico de ratón de la PDA, hemos generado células Panc02 expresan eGFP y luciferasa de luciérnaga (Panc02-FUGLW) y se inyectaron 1 x 10
4 de estas células tumorales ortotópicamente en tipo salvaje albino C57Bl /6 ratones albino y ratones C57BL /6 deficientes para TNF, TNFR1, TNFR2 o ambos TNFR. En todos los genotipos evaluados, tumores Panc02-FUGLW inicialmente crecieron durante los primeros 7 días después de la inoculación del tumor (Figura 1A y B). 3/8 ratones B6 de tipo salvaje, 1/8 ratones B6.TNF KO, y 2/9 ratones KO B6.TNFR2 rechazaron de forma espontánea del tumor dentro de 14 días. En contraste 13/13 ratones deficientes para TNFR1 o TNFR1 y TNFR2 no podían rechazar el tumor.
In vivo
BLI (Figura 1A y B) y
ex vivo
BLI un mes después de la inoculación del tumor (Figura 1C y D) también reveló significativamente más alta carga tumoral en ratones deficientes para TNFR1 (o TNFR1 y TNFR2) que en los ratones de tipo salvaje. Por lo tanto, TNFR1 apareció como un factor importante para el control y el rechazo de los tumores Panc02.
murino adenocarcinoma ductal pancreático se transdujeron células (Panc02) para expresar de forma estable eGFP y luciferasa de luciérnaga y 10
se inyectaron 4 células tumorales ortotópica en ratones C57BL /6 albinos. El crecimiento del tumor en ratones de tipo salvaje (B6.WT) y ratones que eran deficientes para TNF o sus receptores se determinó por
in vivo
BLI. A: El crecimiento del tumor muestra como radiación total (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 7). B: Ejemplos de las imágenes de la evolución en el tiempo de formación de imágenes de un ratón que rechazó espontáneamente el tumor (izquierda) y un ratón que no podía controlar la progresión del tumor (derecha). C:
Ex vivo de imágenes
un mes después de la inoculación de las células tumorales. Los órganos internos se obtuvieron imágenes de la presencia de células tumorales. Los ejemplos de imágenes de un ratón que rechazó de forma espontánea del tumor (I), un ratón con baja carga tumoral (II), y un ratón con una alta carga tumoral (III). D: tamaño del tumor pancreático un mes después de la inoculación Panc02 se muestra como la luminosidad total de (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 5). * P = 0.05, ** p≤0.01. Los datos combinados de cuatro experimentos independientes.
Panc02 tumores muestran alterada la infiltración de células T en ratones KO B6.TNFR1
A continuación, se analizó la infiltración de células inmunes en tumores Panc02-FUGLW cultivan en cualquiera C57BL /6 de tipo salvaje o ratones C57BL /6 deficientes para el TNF, TNFR1 o TNFR2 (Figura 2 y Tabla 2) para determinar si la pérdida de control del tumor podría estar relacionado con los cambios en el infiltrado de células inmunes del tumor. La pérdida de TNFR1 correlacionada con una disminución del número de células CD8 infiltrantes
+ T y el aumento del número de infiltrarse CD4
+ Foxp3
+ T
reg. deficiencia de TNFR1, además, aumentó significativamente la densidad vascular según la evaluación de CD31-expresión, pero no modificó significativamente la infiltración con células innatas inmune del linaje mieloide (CD11b
+, F4 /80
+, Gr1
+ células). Los patrones alterados infiltración de células T de tumores Panc02-FUGLW de B6.TNFR1 KO un mes después de la inoculación nos llevó a evaluar el fenotipo de las células T en la primera etapa de la expansión del tumor. Por lo tanto, analizamos la expresión de marcadores de activación de células CD4
+ y CD8
+ T 7 y 15 días después de la inyección de células tumorales (Figura 3). marcadores de activación de células T solamente sutilmente diferentes. Sin embargo, se observó una tendencia hacia una mayor activación con el tiempo de CD8
+ células T (de expresión de CD25 y CD69) y menor activación de CD4
+ células T (expresión CD27, CD54, y CD69). El crecimiento del tumor está fuertemente asociada con la inflamación mieloide. El flujo porcentajes incrementados citometría reveladas de CD11b
+ y Ly6G
+ células en el páncreas con el tiempo independientemente de los antecedentes genéticos de los ratones portadores de tumores. Curiosamente, en un nivel sistémico, la pérdida de TNFR1 resultó en significativamente disminuyó CD11b
+ y Ly6G números
+ de células en el bazo de los ratones portadores de tumores. el crecimiento del tumor aumentó dentro de los páncreas de los ratones KO TNFR1 fue confirmada por un número significativamente elevados de eGFP células
+ Panc02-FUGLW en estos ratones dos semanas después de la inoculación del tumor (Figura 3).
uno
Panc02-tumores se explantaron meses después de la inoculación de células tumorales, las secciones histológicas se tiñeron consecutivos para las poblaciones indicadas de células inmunes y los vasos sanguíneos (CD31). Los tumores pancreáticos dio lugar a una afluencia de las poblaciones de células inmunes del sistema inmune innato y adaptativo que no se observaron en el tejido pancreático sano en condiciones de estado estacionario. Es de destacar que la deficiencia de TNFR1 dio lugar a un CD8
+ infiltración de células T citotóxicas reducida, pero aumentó T
infiltración de células reg. se muestran fotomicrografías ejemplares. La barra de escala indica 100 micras.
páncreas y el bazo de los ratones no tratados previamente y portadores de tumores de una y dos semanas después de la inoculación de células tumorales se explantaron y se prepararon como suspensiones de células individuales. Se analizaron las células T para la expresión de receptores de la superficie de activación asociada por citometría de flujo. Además, el porcentaje de T
regs, células mieloides y las células tumorales se determinó mediante citometría de flujo (w /o tumor: B6.WT n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6; d + 7: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 6; d + 15: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 7). * P = 0.05, ** p≤0.01. Los datos combinados de cuatro experimentos independientes.
A fin de evaluar las diferencias mecánicas de control del tumor entre el tipo salvaje y los ratones KO TNFR1, se evaluó la expresión de los genes inmunosupresores y diversas citocinas en Panc02-FUGLW tumores (Figura 4). Aquí, se observó en un nivel transcripcional significativamente el aumento de expresión de la galectina-9 e IL-4, mientras que la expresión de iNOS se redujo significativamente.
Panc02-tumores se explantaron un mes después de la inoculación de las células tumorales y el ARN total fue aislado a partir del tejido tumoral. El ARN se transcribió inversamente y se amplifica mediante qRT-PCR. Los datos se presentan como expresión relativa dentro de los tumores derivados de ratones B6.TNFR1 KO en comparación con tumores derivados de ratones de tipo salvaje (WT) (B6.WT n = 3, B6.TNFR1 KO n = 4). * P = 0.05.
exógenos TNF no induce metástasis A pesar de la mejora del crecimiento tumoral e influir T
reg homeostasis
TNF fue mostrado para mejorar la metástasis de las células tumorales en varios
in vivo en modelos de ratón [27] - [29] que incluye un modelo de xenotrasplante ortotópico de PDA con pancreatectomía inducida por metástasis [17]. Para probar si TNF también influye en el crecimiento y la metástasis del tumor Panc02-FUGLW, se trataron ratones portadores de tumores con TNF humano recombinante, que sólo se une a murino TNFR1, cada dos días durante tres semanas después de la inoculación de células tumorales. Esto aumentó significativamente el crecimiento de tumores en general dentro de los páncreas y la ablación de rechazo de tumores espontáneos como se evaluó con
in vivo
y
ex vivo
BLI (Figura 5A y B), pero no inducir metástasis en el hígado, el de riñones, o el mesenterio (datos no mostrados). También se analizó la infiltración de células CD8
células
+ y CD4 + T, y T
, reglas en los tumores de los animales tratados y tratados con TNF-y de hecho se observó que el tratamiento con TNF humano a aumentar significativamente T
números de reg dentro de los tumores (Tabla 3). Dado que nosotros y otros han encontrado previamente que TNFR2 en lugar de TNFR1 en T
se requiere, reglas para impulsar su expansión [14] - [16], esto apunta a un mecanismo indirecto por el cual la administración de TNF humano desencadena T
reg expansión en nuestro modelo de PDA.
10
se inyectaron 4 células tumorales en el bazo de ratones albinos B6.WT. Los ratones se dejaron sin tratar o se trataron todos los demás días con 5 g de TNF humano recombinante. El crecimiento del tumor se determinó por
in vivo
BLI. A: El crecimiento del tumor muestra como radiación total (sin tratar n = 11, TNF n = 10). B:
Ex vivo
de imagen 23 días después de la inoculación de las células tumorales. Los órganos internos se obtuvieron imágenes de la presencia de células tumorales. el tamaño del tumor pancreático se muestra como total de radiación (n = 11 sin tratar, TNF n = 10). ** P≤0.01. Los datos combinados de dos experimentos independientes.
Las células Panc02 muestran poco en las capacidades vitro para Metástasis
Debido a la actividad metastásica limitado de células Panc02
in vivo
, se analizaron las capacidades metastásicas de estas células
in vitro
particular también a la estimulación de TNF. Panc02 células adheridas a las proteínas de la matriz extracelular fibronectina, laminina I, y fibrinógeno, pero ni yo ni al colágeno IV. Ni TNF humano ni murino modificado adhesión de las células Panc02 a componentes de la matriz extracelular (Figura 6A) a pesar de una fuerte activación de la vía clásica NF-kappa B (datos no presentados). A continuación, analizamos células Panc02 para su expresión de las proteínas implicadas en la adhesión y migración de las células (Figura 6B). Encontramos que las células tumorales PDA para expresar CD29 (integrina β1), CD49f (integrina α6), y CD107a y b, la expresión de que no estaba modulada por TNF. CD106 (VCAM-1) expresión, sin embargo, fue inducida por TNF. También se evaluó la capacidad invasiva de las células Panc02 mediante el uso de un
in vitro
invasión de ensayo y medición de las actividades gelatinolytic (Figura 6C). TNF no indujo significativamente la invasión y mientras que el miocardio infartado ratón mostró MMP-9 y -2 actividades, las células Panc02 no lo hacían, independientemente de la estimulación del TNF. En resumen, los resultados de la
in vitro
análisis de los factores relacionados con la metástasis confirmó la actividad metastásica limitada observada con células Pan02
in vivo
.
Panc02 células fueron tratadas con 1,67: adhesión a diferentes proteínas de la matriz extracelular (n = 4). determinación de citometría de flujo de la expresión de las proteínas implicadas en la adhesión y la migración (n = 3): B. C: capacidad invasiva de las células Panc02. Panel izquierdo:
in vitro
invasión de la membrana basal (n = 3). Panel derecho: Gelatina zymography de muestras de células tumorales. lisado de corazón de ratón infartado se utilizó como control positivo (n = 4).
Discusión
Aquí hemos demostrado que TNFR1 es un receptor importante para el control inmunológico de PDA. La pérdida de este receptor en los resultados de anfitrionas en perturbaciones de la infiltración de células inmunes en el tumor y ablación de mecanismos inmunovigilancia. Sin embargo, la activación exógena de TNFR1 con TNF recombinante en animales con tumores resultó en una mayor progresión del tumor, en nombre de un papel de doble filo de TNF-TNFR1- interacciones en el control del tumor PDA.
Un estudio reciente analizó el antígeno T carcinogénesis de múltiples etapas inducida en los islotes pancreáticos y se encontró que mientras que en ratones de tipo salvaje infiltración de CD4
+ células T inducidas por inactividad tumor, pérdida de TNFR1 en estas células les cambió a un fenotipo promotor de tumores mediante la estimulación de la angiogénesis [18]. Estas observaciones están de acuerdo con nuestros resultados, es decir, la pérdida de TNFR1 aumento de la densidad vascular dentro de los tumores. Mientras TNFR1-deficiencia de no modificar constantemente el fenotipo de activación de las células T infiltrantes de tumor, encontramos más células CD4
+ T que infiltran los tumores en TNFR1 deficientes que en ratones de tipo salvaje. Por otra parte, se observó un número reducido de infiltración de células CD8
+ T y los números de T
, reglas aumentado. Chee y sus colegas encontraron que la pérdida de TNFR1 en los ratones NOD para protegerlos de la diabetes al afectar el homing de las células T convencionales en los islotes pancreáticos al tiempo que aumenta el número de T
reg células [30]. En nuestro modelo, la deficiencia de TNFR1 resultó en cambios en la expresión de IL-4, la galectina-9, y iNOS. En línea con esto, la IL-4 ha sido descrito como un potente T
H2 de citoquinas [31] que fue propuesto para promover el crecimiento de células tumorales PDA y poder desempeñar un papel activo en la progresión tumoral de esta patología [32], [33 ]. La galectina-9 suprime T
H1 funciones inmunes [34] e induce T
regs [35]. El papel de esta proteína en PDA no está bien establecido, sin embargo, el aumento de expresión de IL-4 y la galectina-9 podría insinuar hacia un mecanismo que explica el aumento de CD4
+ células T y T
infiltración reg en tumores Panc02 cultiva en ratones TNFR1-deficiente. iNOS fue descrita ser aumentada en tumores de páncreas [36], [37].
El papel del TNF en la progresión tumoral pancreática es objeto de controversia. Mientras que algunos estudios han demostrado propiedades anti-tumorigénicos de TNF [19], [21], otros han mostrado resultados opuestos [17], [20]. Se demuestra aquí una función pro-tumorigénico de TNF sistémicamente activo que el tratamiento de ratones portadores de tumores con esta citoquina aumentado significativamente el crecimiento del tumor. Esto va de la mano con los números elevados de T
, reglas dentro de los tumores. Recientemente hemos demostrado un mecanismo similar en el modelo de metástasis pulmonar B16F10 [16] donde el tratamiento mejorado crecimiento tumoral TNF exógeno en un T
manera reg-dependiente.
TNF se sabe que juega un papel en el cáncer de promoción metástasis [16] - [17], [27] - [29]. A pesar de esto, no se observó un aumento de la metástasis del tumor primario Panc02 al hígado al tratamiento con TNF exógeno. Mientras que hace metástasis PDA fácilmente en otros modelos [17], [38] y en pacientes humanos [39], [40], el tumor Panc02 no parecen tener la capacidad de hacer metástasis espontánea. Las células tumorales mostraron muy poca capacidad gelatinolytic y
in vitro
ni su invasivo ni sus capacidades adhesivas eran moduladas por la estimulación de TNF.
En resumen, proponemos un papel de TNFR1 en la vigilancia inmunológica del tumor de PDA . Aunque nuestros datos hablan por un inmune efecto anti-tumorigénico de TNF a través de TNFR1 mediada, como resultado de advertencia también se observó que el tratamiento exógeno de ratones portadores de tumores con TNF aumenta el crecimiento del tumor en lugar de controlaba.