Extracto
El monoclonal IgM anticuerpo PAT-SM6 derivadas de tumores humanos induce apoptosis en las células tumorales y es considerado un agente potencial contra el cáncer. Un objetivo principal para PAT-SM6 es el regulador de la respuesta de proteína no plegada GRP78, sobre-expresa externamente en la superficie celular de las células tumorales. estudios pequeños ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) de GRP78 humana mostraron un monómero forma de pesa de dos dominios, mientras que el análisis SAXS de PAT-SM6 reveló una estructura en forma de platillo con capacidad simetría de cinco veces, consistente con estudios previos de las proteínas relacionadas. análisis de la velocidad de sedimentación de GRP78 y PAT-SM6 mezclas indicó la formación del complejo débil caracterizado por constantes de disociación en la gama alta concentración micromolar. Por el contrario, los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) mostraron interacciones fuertes y específicas entre PAT-SM6 e inmovilizado GRP78. La constante de unión aparente estimada a partir de una curva de saturación PAT-SM6 fuertemente correlacionada con la concentración de GRP78 se utiliza para recubrir la bandeja de microtitulación. Los experimentos que utilizan anticuerpos policlonales IgG antiGRP78 o un derivado de IgG monoclonal de PAT-SM6 no mostraron una dependencia similar. Los experimentos de competición con GRP78 solubles indicaron una inhibición más eficaz de PAT-SM6 unión a bajas concentraciones de recubrimiento GRP78. Estas observaciones sugieren un mecanismo de unión basado en la avidez que depende de la unión de múltiples puntos de PAT-SM6 a GRP78 agrupado en la superficie de la bandeja. Análisis de los datos de ELISA a concentraciones de recubrimiento de alta GRP78 produjo una constante de disociación aparente de aproximadamente 4 nM. Proponemos que la acción biológica de PAT-SM6 en la apoptosis de las células tumorales puede depender de la naturaleza multivalente de PAT-SM6 y la alta avidez de su interacción con múltiples moléculas de GRP78 agrupados en la superficie de células tumorales
Visto.: Rosenes Z, Mulhern TD, Hatters DM, Ilag LL, Power BE, Hosking C, et al. (2012) La Lucha contra el Cáncer de IgM anticuerpo monoclonal PAT-SM6 se une con gran avidez a la proteína desplegada respuesta del regulador GRP78. PLoS ONE 7 (9): e44927. doi: 10.1371 /journal.pone.0044927
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de junio de 2012; Aceptado: 9 Agosto de 2012; De publicación: septiembre 19 de, 2012
Copyright: © Rosenes et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Consejo de Investigación australiano (LP100100392) con el apoyo adicional proporcionado por Patrys Ltd. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses : Este trabajo es apoyado en parte por Patrys Ltd, una empresa que realiza actualmente ensayos clínicos de PAT-SM6 como un tratamiento potencial contra el cáncer
Introducción
anticuerpos
IgM naturales juegan un papel importante en el. respuesta inmune innata en el que están involucrados en la detección temprana de partículas extrañas, así como la detección de auto-estructuras modificadas incluyendo proteínas modificadas químicamente y las fibrillas de amiloide [1], [2], [3]. anticuerpos IgM también participan en el reconocimiento y la eliminación de las células transformadas como una defensa importante contra el cáncer [4]. El reciente desarrollo de la tecnología de hibridoma humano [5] ha conducido al aislamiento de un gran número de anticuerpos monoclonales de la clase IgM de los tumores de pacientes con cáncer [6]. Un número de estos anticuerpos matan específicamente células malignas mediante la inducción de vías de apoptosis [7], destacando el uso potencial de los anticuerpos IgM monoclonales en el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer.
El anticuerpo monoclonal IgM humana, PAT-SM6 , induce la muerte de las células tumorales a través de una vía apoptótica acompañado por la acumulación de lípidos intracelular [8]. PAT-SM6 dirige a las células tumorales, mediante la unión a la proteína GRP78 que es sobre-expresado externamente en la superficie celular de las células tumorales [9]. GRP78, también conocido como (proteína de unión a inmunoglobulina de la cadena pesada) de BiP, es un miembro de la proteína de choque térmico 70 (HSP70) de la familia que previene la apoptosis inducida por el estrés. PAT-SM6 también se une la lipoproteína de baja densidad (LDL) y LDL oxidada [8] conduce a un modelo de trabajo para la actividad de apoptosis específica de tumor de PAT-SM6 mediante el cual PAT-SM6 ofrece exceso de lípidos en forma de LDL unido o LDL oxidada en tumores de unión a GRP78 modificado presente en la superficie de las células tumorales [8].
(a) GRP78 se expresó y se purificó a partir de
E. coli
células, y se sometió a espectroscopia de dicroísmo circular. Se muestra un espectro representativo de 0,15 mg /ml de GRP78 purificada a 25 ° C (círculos abiertos) y el ajuste de Dichroweb usando establecer sp175 filtro (línea continua). análisis de la velocidad (B) Sedimentación de GRP78 se realizó por centrifugación 0,4 mg /ml de GRP78 a 28.000 rpm en una ultracentrífuga analítica. Los límites de sedimentación de absorbancia resultantes se controlaron a 280 nm y los datos representativos se muestran como círculos abiertos. Se adapta a los datos experimentales utilizando un modelo de sedimentación c (S) se muestran como líneas continuas. Para mayor claridad, se muestra sólo uno de cada 10 de exploración. (C) parcelas distribución de tamaño de 1,2 mg /ml de GRP78 (línea continua) o 0,6 mg /ml de GRP78 (línea discontinua) calcula a partir de los datos de ajuste representados en (B) a corriente alterna (S) modelo de sedimentación.
Los modelos preclínicos de cáncer muestran una inhibición PAT-SM6 humana del crecimiento del tumor [8], lo que sugiere una posible terapia para tratar el cáncer. La seguridad y tolerabilidad de PAT-SM6 como un anticuerpo anti-cáncer para el tratamiento de melanoma se ha establecido en una fase reciente I de ensayos clínicos [10]. El mayor desarrollo de PAT-SM6 como un agente eficaz contra el cáncer será asistido por una información más detallada sobre la base estructural y la fuerza de las interacciones de PAT-SM6 con antígenos diana. Este conocimiento es esencial para la predicción informado de efectos secundarios no deseados asociados con el uso terapéutico de PAT-SM6 solo, o en terapias de combinación con otros agentes. En el presente estudio hemos investigado la estructura y las interacciones de purificado PAT-SM6 con GRP78 humana recombinante expresada y purificada a partir de bacterias. Utilizando el análisis de la velocidad de sedimentación y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) se muestra que, mientras PAT-SM6 tiene una afinidad relativamente baja para las moléculas GRP78 individuales, la interacción de PAT-SM6 con moléculas GRP78 agrupado en la superficie de una placa de microtitulación es mucho más fuerte y que se caracteriza por las constantes aparentes de avidez en el rango de baja concentración nanomolar.
Materiales y Métodos
el anticuerpo monoclonal humano PAT-SM6 y un derivado hexameric modificado, PAT-SM6-hexagonal, que carecen de una unirse a la cadena J, se expresaron y se purificaron a partir de cultivos en suspensión estable de una línea celular humana en medio libre de suero [11], [12]. Procedimientos similares se utilizaron para expresar y purificar un derivado de IgG (PAT-SM6 IgG) compuesta de las secuencias de cadena pesada y ligera de PAT-SM6. control de isotipo IgM se obtuvo de Jackson ImmunoResearch Labs, Inc, West Grove, PA. La secuencia de codificación para la longitud completa, gen GRP78 humano maduro se insertó en un vector de inducción de calor pPOW, resultando en una construcción con una secuencia de secreción pelB N-terminal y C-terminal 6xHis-tag [13]. La proteína se expresó en
E. coli
células BL21 (DE3) y después se purificó de la porción soluble del lisado celular por cromatografía de afinidad de níquel utilizando un 5 ml Su-Trap columna (GE Healthcare) de acuerdo con el protocolo del fabricante. isomerasa de glucosa se obtuvo de Hampton Research, Aliso Viejo, California
dicroísmo circular (CD) Medidas
Los espectros de CD de GRP78 (0,15 mg /ml) y PAT-SM6 (0,15 mg /ml) en tampón fosfato salino (PBS; fosfato sódico 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) fueron adquiridos usando un Aviv Modelo 62 DS espectrómetro de CD (Aviv Biomedical, Inc, Lakewood, New Jersey) a 25 ° C con una 1 mm cubeta de paso de luz de cuarzo, un ancho de banda espectral de 1 nm, un tiempo de la señal promedio de 2 s y un intervalo de datos de 0,5 nm. Elipticidades en miligrados se corrigieron para las mediciones de tampón solo y se convierten en el sentido de elipticidades de residuos (MRE) utilizando la fórmula MRE = elipticidad × MRW /(10 × c × l) donde MRW es el peso residuo media en g /mol, c la concentración en mg /ml, y L la longitud de la trayectoria en cm. CD espectros se analizaron para obtener estimaciones de la estructura secundaria utilizando Dichroweb [14].
(A) Los datos de SAXS primas se muestran como círculos que representan la intensidad media de
I gratis (
q
) como una función de transferencia de impulso
q
. Las barras de error indican ± 1 desviación estándar (σ). símbolos negros:
I
(
q
) ≥ símbolos sigma y gris:
I
(
q
) & lt; σ. (B) Guinier parcela para estos datos SAXS para q.Rg & lt; 1,3. plot (C) Kratky de los datos de SAXS. (D & amp; E) parcelas Porod-Debye en función de
q
3 y
q
4, respectivamente. (F) El derivado de SAXS
ab initio Reconstrucción forma (promedio filtró forma a partir de 10 reconstrucciones) se muestra superpuesta en la disposición de dominio refinado-NMR de las estructuras cristalográficas de los dominios N- y C-terminales de la GRP78 homólogo bacteriana DnaK [26].
ángulo pequeño dispersión de rayos X (SAXS)
SAXS datos han sido recogidos en la línea de luz /WAXS australiano Sincrotrón SAXS en conjunción con in- cromatografía de filtración en gel de la línea, según lo descrito por Gunn y compañeros de trabajo [15]. Las concentraciones de carga para la columna de filtración en gel de la línea en la era de 5 mg /ml para SM6 y 5 mg /ml para GRP78. perfiles de SAXS imágenes del detector se analizaron como promedios de diez secuenciales 2 s exposiciones utilizando el software de SAXS15ID (Sincrotrón de Australia), que luego se convierte en individuo
I gratis (
q
).
I
(
q
) es la intensidad de rayos X dispersos como una función de la magnitud del vector de transferencia de momento
q
= (4πsinθ) /λ, donde el ángulo de dispersión es 2θ y la longitud de onda de rayos X es λ (1,0332 Å). El
q
rango sobre el cual se recogieron las intensidades era 0,0047 hasta 0,2807 Å
-1. perfiles de SAXS se analizaron mediante el ATSAS (versión 2.4) conjunto de programas [16]. El análisis se realizó utilizando Guinier AUTORG. La intensidad en el ángulo cero
I gratis (0) y la dimensión máxima (
D
max
) de partículas de dispersión se estimaron a partir de
P gratis (
r
) funciones de distribución par de vector de distancia utilizando AUTOGNOM. Los volúmenes de las partículas dispersantes respectivos se calcularon a partir del área bajo Kratky parcelas (
q
2
I gratis (q) /
I gratis (0) vs .
q
) como se describe por Svergun y Fegin [17]; con lo cual, las parcelas Kratky se extrapolaron a baja
q gratis (
q Hotel & lt;
q
min) usando la aproximación Guinier y extrapolado a alta
q
(
q
donde
I gratis (
q
)
/I gratis (0) & lt; 0,01) usando la aproximación Porod [18].
Ab initio
reconstrucciones forma de dispersión de datos se realizaron con DAMMIF [19] y se promediaron formas filtrados calculados a partir de conjuntos de 10 reconstrucciones mediante el paquete de programas de DAMAVER [20]. refinamiento cuerpo rígido con la adición de segmentos que faltan se realizó utilizando CORAL [21] para varios modelos de cadena. perfiles de dispersión teóricas de modelos estructurales se generaron y se compararon con los datos de SAXS experimentales utilizando CRYSOL [22]. Los modelos estructurales y sobres de formas superpuestas en forma óptima usando SUPCOMB [23]. Las comparaciones estadísticas de la bondad de ajuste de perfiles de dispersión teóricas de los modelos estructurales a los datos experimentales de SAXS se llevaron a cabo mediante el cálculo del
F-estadística para
pares de ataques e integrando la adecuada
F
distribución t [ ,,,0],24].
sedimentación Velocity Analysis
experimentos la velocidad de sedimentación se llevaron a cabo usando una ultracentrífuga analítica XL-I (Beckman Coulter, Fullerton, CA) equipado con un rotor Ti An-60 a 20 ° C . Las muestras de proteína fueron añadidos a piezas centrales epon llenas de doble sector con fosfato 20 mM de sodio, pH 7,0, NaCl 100 mM, arginina 55 mM en el compartimiento de referencia. datos de absorbancia radiales fueron adquiridas a una velocidad del rotor de 28.000 rpm, utilizando una longitud de onda de 280 nm, y con incrementos radiales de 0.003 cm en modo de escaneo continuo. Los límites de sedimentación se ajustaron a un modelo suponiendo una distribución de coeficientes de sedimentación para las especies que no interactúan, c (S), utilizando el programa SEDFIT [25]. Los datos se ajustaron usando un parámetro de regularización de p = 0,95 y la flotación de la relación de fricción.
(A) 0,15 mg /ml de PAT-SM6 se sometió a espectroscopia de dicroísmo circular. Se muestra una representante del espectro a 25 ° C (círculos abiertos) y el ajuste de Dichroweb usando establecer sp175 filtro (línea continua). (B) análisis de la velocidad de sedimentación de PAT-SM6 se realizó por centrifugación 0,4 mg /ml de PAT-SM6 a 28.000 rpm en una ultracentrífuga analítica. Los límites de sedimentación de absorbancia resultantes se controlaron a 280 nm y los datos representativos se muestran como círculos abiertos. Se adapta a los datos experimentales utilizando un modelo de sedimentación c (S) se muestran como líneas continuas. Para mayor claridad, sólo se muestra cada 3ª exploración. (C) parcelas distribución del tamaño de pentamérica PAT-SM6 (línea continua) y hexameric PAT-SM6 (línea discontinua) calculada a partir de los datos de ajuste representados en (B) a corriente alterna (S) modelo de sedimentación.
ligado a enzimas inmunoabsorbente (ELISA)
Los antígenos se revistieron sobre bandejas de 96 pocillos de microtitulación (Nunc Maxisorp) por incubación durante la noche a 4 ° C. Después, las placas se lavaron 3 veces en PBS, 3 veces en PBS + 0,1% Tween 20, 3 veces en PBS y se bloquearon con 5% (w /v) de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, después se lavaron de nuevo como anteriormente. Todas las preparaciones de anticuerpos se realizaron en 5% (w /v) de BSA en PBS. Para los experimentos de ELISA indirectos, los anticuerpos se aplicaron directamente a la placa y se incubaron durante 1 hora. Para los ELISA competitivos, los anticuerpos se incubaron en solución con diversas cantidades de antígeno antes de la aplicación a la placa de microtitulación. Después de lavar de nuevo como anteriormente, peroxidasa conjugada con anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de conejo (Calbiochem), de conejo anti-IgG humana (Calbiochem), o de conejo anti-IgM humana (Dako), depende de la fuente primaria de anticuerpos y clase) era aplicada a la placa y se incubó durante 1 hora según las instrucciones del fabricante. Después de un lavado final, la unión del anticuerpo se determinó usando 100 l por pocillo de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina solución de sustrato (Sigma) y midiendo el cambio de color a 655 nm. El curso de tiempo para el desarrollo de color fue esencialmente lineal en el rango de densidad óptica 0-3. Las mediciones se realizaron 15 min después de la adición de sustrato. En experimentos de control, que implica el recubrimiento directo de las placas con PAT-SM6, sobre el rango de concentración de 0-2,5 mg /ml, se observó un aumento sistemático en la señal de ELISA con una mayor concentración de recubrimiento, lo que implica una correlación directa entre la señal y el ELISA cantidad de anticuerpo unido a la placa. Se analizó los datos de ELISA para la titulación de anticuerpo primario de unión a GRP78 inmovilizado suponiendo un simple isoterma de unión de Langmuir se describe por la relación Y = K
a /(1-K
a) en la que Y es la magnitud de la señal de ELISA y K
a es la constante de unión aparente asumiendo una sola clase de sitios de unión.
(a) los datos de SAXS primas se muestran como círculos que representan la intensidad media de
I gratis (
q
) como una función de transferencia de impulso
q
. Las barras de error indican ± 1 desviación estándar (σ). símbolos negros:
I
(
q
) ≥ símbolos sigma y gris:
I
(
q
) & lt; σ. plot (B) Guinier para estos datos SAXS para
q
R
g
. & lt; 1,3. plot (C) Kratky de los datos de SAXS. (D & amp; E) parcelas Porod-Debye en función de
q
3 y
q
4, respectivamente. (F) El
ab initio Reconstrucción forma (promedio filtra forma a partir de 10 reconstrucciones con simetría explícita P5) se muestra superpuesta sobre el cuerpo rígido refinado modelo de SAXS, generada a partir de fragmentos Fab y Fc unidas por un sistema flexible de 8 residuos enlazador de poli-Gly. La orientación de los cuatro dominios Ig constante de cada fragmentos Fc fue modelada sobre la estructura cristalina de la IgE y la orientación relativa Fc estaba limitada por restricciones de distancia aplicación de enlaces disulfuro entre cadenas [33].
resultados
Caracterización de GRP78 purificada
GRP78 humano, vinculado a una extensión de pelB N-terminal y cola de His [11] se expresó y purificó a partir de
e. coli
. Espectrometría de masas del producto purificado dio una masa de 73.270,7 Da en comparación con un valor teórico basado en la composición de 73.269,9 Da. CD espectrofotometría indicó una estructura plegada con un espectro de CD que se caracteriza por un doble mínimos a aproximadamente 208 y 221 nm (Figura 1). El análisis de los espectros produjo estimaciones de 22,1% y 29,1% para A y A -estructura, respectivamente. Estos valores se pueden comparar con las estimaciones de 36% á-hélice y 27% la ficha para la estructura secundaria determinada a partir de la estructura tridimensional del homólogo de HSP70 bacteriana, DnaK [26]. Se obtuvo evidencia adicional para el correcto plegamiento de GRP78 humana purificada mediante el ensayo de la actividad de ATPasa residual. El uso de un ensayo de quinasa-lactato deshidrogenasa piruvato junto [27] indicó una actividad específica de aproximadamente 4 nmol ATP hidrolizado por segundo por cada mol de GRP78.
A. 0,4 mg /ml de PAT-SM6 y 0,4 mg /ml de GRP78 se incubaron juntos y se centrifugó a 28.000 rpm. Los límites de sedimentación de absorbancia resultantes se controlaron a 280 nm y los datos representativos se muestran como círculos abiertos. Se adapta a los datos experimentales utilizando un modelo de sedimentación c (S) se muestran como líneas continuas. B. En correspondencia c (S) Parcelas de distribución del tamaño de los datos que se presentan en (A) para PAT-SM6 (negro línea discontinua), GRP78 (gris línea discontinua) y la mezcla de las dos proteínas (línea continua). C. distribuciones radiales obtenidos después de centrifugación a 28.000 rpm durante 72 min para PAT-SM6 (0,4 M; círculos grises), GRP78 (10 micras; círculos negros) y la mezcla de PAT-SM6 (0,4 M) y GRP78 (10 mM, sólida línea). La línea gris sólida es la suma de las distribuciones radiales obtenidos para PAT-SM6 y GRP78 solo, suponiendo que no hay interacción.
datos de la velocidad de sedimentación de GRP78 purificada mostraron una sola frontera sedimentación importante (Figura 1). El análisis de esta suponiendo una distribución de tamaño continua de especies no interactúan datos indicó una especie dominante caracterizado por un coeficiente de sedimentación, coeficiente de fricción y la masa molecular coherente con la presencia de monómero GRP78 (Tabla 1). Además de esto, las principales especies, los datos identifican una especie dependientes de la concentración más grandes (s20, w de aproximadamente 7,2 S) atribuidos a la presencia de un dímero en equilibrio lento con las especies monoméricas predominantes.
datos SAXS para la GRP78 se muestra en la Figura 2A. La trama Guinier partir de estos datos (Figura 2B) fue lineal a baja
q gratis (donde
q
Rg
. & Lt; 1,3) y el radio de giro (
R
g
) obtenida a partir de la pendiente era de 45,5 ± 2,2 Å. La masa del monómero de GRP78 se estimó a partir del área bajo la parcela Kratky (Figura 2C) para ser 89,5 kDa, que es 22% más alto que el valor teórico de 73,2 kDa. Dado que el in-line cromatografía de filtración en gel nos permitió eliminar la contribución de dispersión de cualquier dímero, este análisis da una densidad proteína monomérica de 0,85 g.cm
-1, que es indicativo de la densidad de electrones difusa de una gran flexibilidad molécula [28]. La inspección de las parcelas Porod-Debye (Figura 2D & Amp; 2E) mostró los datos de SAXS GRP78 no meseta como
I
(
q
)
q
. 4 vs
q
4, pero sí meseta como
I gratis (
q
).
q
3 vs
q
3, que apoya aún más la sugerencia de que GRP78 es muy flexible, pero contiene significativa estructura plegada [28]. Como control, análisis similar se llevó a cabo en los datos de SAXS registrados a partir de una proteína globular compacta, la isomerasa de glucosa. Estos análisis mostraron una meseta en ambos
I
(
q
).
q
3 vs
q
3 y
I
(
q
).
q
4 vs
q
4 parcelas y dio una densidad de 1,32 g.cm
-1, que está en excelente acuerdo con estudios previos de esta molécula [28].
La concentración de GRP78 se utiliza para recubrir los pozos era 30μg /ml. A: Los anticuerpos primarios utilizados fueron PAT-SM6 (carriles 1 y 3), el anticuerpo IgM anti-GRP78 (carril 2) y de isotipo de control (carril 4). En el carril 3 se omitió la etapa de revestimiento inicial con GRP78. B: El anticuerpo primario utilizado fue PAT-SM6. Las incubaciones se realizaron en tampón de fosfato de sodio 20 mM con NaCl no añadido (carril 5), NaCl 140 mM (carril 6) y NaCl 500 mM (carril 7). C: El anticuerpo primario utilizado fue PAT-SM6. Las incubaciones se realizaron en tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 140 mM a valores de pH de 6 (carril 8), 7,4 (carril 9) y 8 (carril 10).
Ab initio
modelado forma de GRP78 se realizó siguiendo la estimación de la función de distribución de partículas de vector de distancia
P gratis (
r
) por transformación de Fourier indirecta. La dimensión máxima (
D
max
) de
P gratis (
r
) el análisis se estimó en 134 Å. La Figura 2F muestra el volumen filtrado modelo SAXS medio resultante superpuesta a la RMN refinado estructura de longitud completa de DnaK [26]. La forma global y la orientación relativa media de la N-dominio y C-dominio de la GRP78 es consistente con los datos de RMN para DnaK, estableciendo aún más la naturaleza predominantemente monomérico y plegado correcto del producto GRP78 humano expresado bacteriana.
Caracterización de purificada PAT-SM6
La estructura y el comportamiento de la solución purificada PAT-SM6 se caracteriza también. CD espectros para PAT-SM6 reveló un único mínimo a aproximadamente 215 nm, lo que sugiere una estructura secundaria de hoja-β predominantemente (Figura 3). Los resultados se comparan favorablemente con los estudios de CD anteriores sobre la estructura secundaria de anticuerpos IgM [29]. El análisis de los datos de CD de PAT-SM6 indicó estructura secundaria compuesta de aproximadamente 3,8% a-hélices, 51% de A-capítulos, 7.7% y 35.8% vueltas estructura desordenada. datos de la velocidad de sedimentación de PAT-SM6 mostraron un único límite mayor (Figura 3). Análisis de los datos, suponiendo una distribución coeficiente de sedimentación continua de especies no de interacción, reveló la presencia de una importante y una población menor caracterizada por coeficientes medios de sedimentación de 17 S y 24 S, respectivamente (Tabla 1). Estos resultados son consistentes con la presencia de especies de IgM monoméricas y diméricas [30]. El valor de mejor ajuste obtenido para la relación de fricción, f /fo, se utilizó para analizar la forma general del monómero PAT-SM6. Los datos indican una forma asimétrica que corresponde a un elipsoide achatado con los parámetros enumerados en la Tabla 1. Los datos de velocidad de sedimentación se obtuvo también para un derivado hexameric PAT-SM6, PAT-SM6-hex, que carece de una cadena J [11]. El análisis del tamaño-distribución de los datos indican una especie importante que sedimentan caracterizados por s20, w y f /fo valores de 17,6 S y 1,95, respectivamente
Los anticuerpos primarios utilizados fueron:. A. PAT-SM6; B. policlonal anti-GRP78; C. PAT-SM6-hexagonal y D. PAT-SM6 IgG. Las concentraciones de recubrimiento GRP78 eran 30 mg /ml (círculos cerrados), 15 mg /ml (abrir triángulos invertidos), 7,5 mg /ml (cuadrados cerrados), 3,75 mg /ml (rombos abiertos), 1,88 mg /ml (triángulos cerrados) , 0 mg /ml (círculos abiertos). Las líneas continuas son las líneas de ajuste óptimo calculadas para una simple isoterma de unión.
A. Encuadernación constantes para PAT-SM6 (círculos cerrados) y PAT-SM6-hexagonal (círculos abiertos). B. constantes de unión para PAT-SM6 IgG (círculos cerrados) y anti-GRP78 (círculos abiertos).
Los datos SAXS para PAT-SM6 se presentan en la Figura 4A. La trama Guinier (Figura 4B) es lineal a baja
q gratis (
q
R
g
. & Lt; 1,3) y el
R
g
obtenido a partir de la pendiente fue 122,0 ± 1,4 Å. El
D
max
se estimó a partir del análisis
P gratis (
r
) para ser ~4.2 nm y la masa molecular derivado del área bajo la gráfica Kratky ( Figura 4C) fue de 1,06 × 10
6 Da. Estas estimaciones de la masa,
R
g
y
D
valores máximos para PAT-SM6 están en buen acuerdo con los de estudios anteriores SAXS de IgM [31]. Una vez más, la presencia de una meseta en la trama de
I
(
q
).
q
3 vs
q
3 (Figura 4D) y la falta de una meseta en el
I
(
q
).
q
4 vs
q
4 parcela (Figura 4E) indicó una estructura plegada con una flexibilidad significativa [28].
Ab initio de modelado
forma de PAT-SM6 no convergen en una forma física realista, sin la imposición de restricciones de simetría explícitas. En lugar de imponer arbitrariamente a la simetría de cinco veces, la bondad de ajuste de los perfiles teóricos SAXS de los modelos con diferentes simetrías (P2, P3, P4, P5 y P6) a los datos de SAXS se compararon [24]. Cinco veces la simetría dio el mejor ajuste, que fue significativamente mejor que los ataques con cuatro veces o simetría séxtuple (
P gratis (
F
) valores de 0,036 y 0,004, respectivamente) . El modelo de la forma media SAXS del monómero PAT-SM6 con simetría quíntuple de acuerdo bien con las características generales caracterizado microscopía electrónica anterior, los estudios de SAXS y modelado de homología de IgM [31], [32], [33]. De cadena Multi cuerpo rígido refinamiento contra los datos de SAXS se realizó utilizando fragmentos Fab flexible ligados a fragmentos Fc de IgE basados en [34], como por reciente modelado EM [33]. P5 simetría se impuso y la orientación relativa de los fragmentos Fc se vio limitado por las restricciones a distancia correspondientes a los enlaces disulfuro entre la subunidad [35]. La SAXS
ab initio
modelo de la imagen se muestra superpuesta sobre el cuerpo rígido refinado modelo de SAXS (Figura 4F). Ambos modelos sugieren SAXS asimetría en la posición relativa de los dos fragmentos Fab dentro de cada uno de los cinco pares de cadena de la cadena de la luz pesados, lo que es consistente con las reconstrucciones de forma EM [35]. Estos estudios estructurales confirman la relativa homogeneidad de la preparación PAT-SM6 y la idoneidad para los estudios de soluciones sobre las interacciones con antígenos específicos.
A. La concentración de GRP78 se utiliza para recubrir los pocillos fue 7,5 mg /ml. Los anticuerpos primarios utilizados fueron PAT-SM6 (5 mg /ml, círculos cerrados) y anti-GRP78 (círculos abiertos) policlonales. Los resultados también se presentan para los experimentos de control omitiendo la capa GRP78 utilizando anticuerpos primarios PAT-SM6 (5 mg /ml, triángulos cerrados) o anti-GRP78 (cuadrados abiertos). B: La unión de PAT-SM6 (5 g /ml) a GRP78 inmovilizado a diferentes concentraciones de recubrimiento GRP78 en ausencia (barras negras) o presencia (barras grises) de GRP78 soluble (4 mg /ml). C: la inhibición inducida por GRP78 Soluble de PAT-SM6 unión a GRP78 inmovilizado a diferentes concentraciones de recubrimiento GRP78. Las concentraciones de PAT-SM6 y GRP78 solubles utilizados fueron de 5 mg /ml y 4 mg /ml, respectivamente.
La interacción de la PAT-SM6 con GRP78 en la Solución
análisis de la velocidad de sedimentación se utilizó para investigar la interacción de PAT-SM6 y de GRP78. Las exploraciones radiales en la Figura 5A, obtenidas de una mezcla de PAT-SM6 (0,4 M) y GRP78 (10 mM), muestran un lento y un límites de movimiento rápido que corresponden aproximadamente a las velocidades de contorno obtenidos para muestras separadas de GRP78 y PAT-SM6 , respectivamente (figuras 2 y 4). análisis de distribución de tamaño continuo de los datos obtenidos para la mezcla de PAT-SM6-GRP78 confirmó dos poblaciones principales caracterizadas por coeficientes medios de sedimentación similares a los valores medios de GRP78 y PAT-SM6. Análisis de la zona bajo la población correspondiente a PAT-SM6 indicó una pequeña disminución en el área de aproximadamente 10%, consistente con la pérdida de material. Esta pérdida se atribuyó a la formación y el rápido agotamiento de los complejos antígeno-anticuerpo de gran tamaño. Otra prueba de la pérdida de material debido a la formación de complejos es proporcionada por una comparación de las exploraciones radiales tomadas en un solo punto de tiempo para PAT-SM6 solo, GRP78 solo y la mezcla de PAT-SM6 y de GRP78. Los resultados muestran que el valor de meseta de la mezcla de PAT-SM6-GRP78 es más baja que las exploraciones de densidad óptica combinada de los componentes separados, indicativo de la formación de complejos. Una dificultad en el análisis de los datos para complejos reversibles débiles es la naturaleza dinámica de las interacciones y la complejidad del ajuste de los datos a modelos específicos [36]. Sin embargo, los datos en la Figura 5C indican la pérdida de sólo una pequeña cantidad de PAT-SM6 como complejos grandes, que corresponde a aproximadamente el 10% de PAT-SM6. Puesto que la concentración total de PAT-SM6 y GRP78 utilizado en estos experimentos fue 0,4 M y 10 mM, respectivamente, esta estimación de la proporción de rendimiento de complejo de una estimación de la constante de disociación, suponiendo un complejo 1:01, de aproximadamente 90 mM. Esta afinidad de unión relativamente baja es típico de las interacciones antígeno-IgM en comparación con las interacciones entre la afinidad madurada anticuerpos IgG y sus antígenos cognados [37].
Análisis ELISA de la interacción entre el AF-SM6 y GRP78
La interacción de PAT-SM6 con GRP78 inmovilizado en una placa de microtitulación se analizó usando un ensayo ELISA. Los resultados de la Figura 6 muestran una fuerte señal positiva utilizando PAT-SM6 o anti-GRP78 como el anticuerpo primario. Los experimentos de control omitiendo el procedimiento de recubrimiento GRP78 inicial o utilizando un anticuerpo de control de isotipo IgM dieron una señal de que estaba cerca de fondo. La magnitud de la señal positiva para la interacción de PAT-SM6 con GRP78 inmovilizada fue similar para las muestras incubadas en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4 en comparación con muestras de PAT-SM6 en PBS mientras que la señal se redujo significativamente cuando se aumentó la concentración de NaCl a 500 mM. La unión de PAT-SM6 a GRP78 inmovilizada fue similar para las incubaciones realizadas a valores de pH de 6, 7,4 y 8.
A la vista de la señal relativamente fuerte observada para la interacción de PAT-SM6 con GRP78 en ensayos de ELISA (Figura 6) en comparación con la interacción relativamente débil deducida a partir de estudios de la velocidad de sedimentación (Figura 5B y C) se realizaron experimentos adicionales para determinar la fuerza de las interacciones observadas en condiciones de ELISA. Los resultados de la Figura 7A muestran la señal de ELISA determinada como una función de la concentración de PAT-SM6 para diferentes concentraciones de recubrimiento de GRP78. Los resultados muestran saturaciones curvas típicas en las que la magnitud de la señal de ELISA a saturación aumenta sistemáticamente a medida que aumenta la concentración de recubrimiento de GRP78 PAT-SM6. También se muestran en la Figura 7 son los experimentos de control utilizando diferentes concentraciones de anti-GRP78, PAT-SM6-hexagonal y PAT-SM6 IgG. En cada caso hay un aumento sistemático de la magnitud de las curvas de saturación con incremento de la concentración de recubrimiento GRP78.