Extracto
Objetivo
Este estudio tuvo como objetivo investigar el estado de metilación de la región promotora del spalt similar factor de transcripción 3 (
SALL3
) y la expresión de
SALL3 Hoteles en cáncer de cuello uterino para explorar la función de este gen en la carcinogénesis del cáncer cervicouterino.
Métodos
El estado de metilación de
SALL3
fue detectado por PCR específica de metilación, y
SALL3
expresión génica se evaluó mediante PCR en tiempo real cuantitativa en las líneas celulares de cáncer de cuello uterino, SiHa, HeLa y C33A , así como en muestras de tejido de cáncer cervical (n = 23), emparejado muestras de tejido pericarcinomatous (n = 23) y muestras de tejido normales de cuello uterino (n = 17). MTT se utilizó para medir la capacidad de la viabilidad y la proliferación celular de las células SiHa y HeLa.
Resultados
La
SALL3
promotor era completamente metilado en las células SiHa, no metilado en las células C33A y parcialmente metilado en células HeLa. Después del tratamiento de las células SiHa y HeLa con 5 mM y 10 mM de 5-azacitidina (5-Aza), respectivamente, el nivel de metilación de la
SALL3
promotor disminuido y observó incremento en el grado de no metilación en una dosis -dependiente. Por otra parte, la expresión relativa de
SALL3
mRNA aumentó a medida que la concentración de 5-Aza aumentó en SiHa (
p
& lt; 0,05) y HeLa (
p
& lt; 0,05 ) Células. Este aumento mencionados arriba en
SALL3
mRNA en las células SiHa fue más notable que la observada en las células HeLa. capacidad de proliferación celular también disminuyó después de la administración de 5-Aza a las células SiHa y HeLa (
p
& lt; 0,05). La metilación del
SALL3
promotor se observó en 15 de 23 (65,21%) muestras de tejido de cáncer cervical, 15 de 23 (65,21%) igualaron las muestras de tejido pericarcinomatous y 5 de 17 (29,41%) muestras de tejido cervical normal (
p Hotel & lt; 0,05).
SALL3
expresión mRNA fue significativamente menor en el cáncer de cuello de útero y los tejidos pericarcinomatous en comparación con los tejidos cervicales normales (
p Hotel & lt; 0,05). En todas las muestras de tejido del cuello uterino, la infección por VPH se asoció positivamente con la hipermetilación de la región promotora del
SALL3 gratis (
p Hotel & lt; 0,05, r = 0,408), y la expresión de
SALL3
mRNA en tejidos VPH positivos fue menor que en los tejidos de VPH-negativos (
p Hotel & lt; 0,05).
Conclusión
La hipermetilación aberrante de
SALL3
junto con la participación de VPH inactivan su función como un supresor de tumores y contribuyeron a la carcinogénesis en el cáncer cervical
Visto:. Wei X, Zhang S, D Cao, Zhao M, Q Zhang, Zhao J, et al. (2015) La hipermetilación aberrante de SALL3 con la participación de VPH Contribuye a la carcinogénesis del cáncer cervical. PLoS ONE 10 (12): e0145700. doi: 10.1371 /journal.pone.0145700
Editor: Xuefeng Liu, de la Universidad de Georgetown, Estados Unidos |
Recibido: June 9, 2015; Aceptado: 6 de diciembre de 2015; Publicado: December 23, 2015
Derechos de Autor © 2015 Wei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos subyacentes los resultados de nuestro estudio son de libre acceso en el documento y su archivo de información de apoyo
Financiación:.. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81472428)
Compitiendo intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cervicales filas de cáncer como la segunda causa de mortalidad relacionada con el cáncer del tracto genital en las mujeres en todo el mundo, y resulta en aproximadamente 266.000 muertes. cada año de acuerdo con la reciente National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Directrices (2015 version) [1] .Over 99% de los casos están relacionados con la infección de los genitales con los virus del papiloma humano (VPH), que han sido identificados en la etiología de cuello de útero cáncer y haber infectado a aproximadamente 660 millones de personas [2]; Sin embargo, la prevalencia de la infección por VPH es aún insuficiente para dar cuenta de todas las instancias de la carcinogénesis cervical. En los últimos años, los mecanismos epigenéticos, especialmente la metilación del ADN, han surgido y han proporcionado posteriormente nuevos conocimientos sobre la aparición de tumores [3, 4]. Sin embargo, los científicos continúan explorando los mecanismos de la carcinogénesis y el desarrollo de los cánceres de la genómica.
Spalt-como factor de transcripción 3 (
SALL3
) es un miembro de la
SAL
familia y está situado en 18q23.
SALL3
codifica una sal-como C
2 H
2-proteína de tipo dedo de zinc. Las mutaciones en algunos de estos genes están asociados con trastornos congénitos en los seres humanos, lo que indica su importancia en el desarrollo embrionario [5-7]. Shikauchi
et al
[8] encontró que
SALL3
fue silenciado por la metilación del ADN y que el producto de proteína de este gen (SALL3) interactúa directamente con el dominio de PWWP DNMT3A en el carcinoma hepatocelular humano ( CHC), que sugirió que
SALL3
actúa como un supresor de tumores en el CHC. Love
et al
[9] secuenciado los exomas de 59 tumores de linfoma de Burkitt, y los resultados mostraron por primera vez que
SALL3
fue mutado de forma recurrente en los linfomas de Burkitt. Por otra parte, en el CD133 (+) las células de cáncer colorrectal (CCR),
SALL3
fue significativamente hasta regulado en comparación con CD133 (-) células CRC [10]. Por otra parte, un estudio reciente que utiliza el análisis de metilación del ADN de alto rendimiento también mostró que
SALL3
era un biomarcador potencial para el cáncer de colon [11]. Los resultados mencionados anteriormente demuestran que la expresión anormal de
SALL3
se asocia con la aparición de varios tipos de cáncer. Sin embargo, si
SALL3
está implicado en la carcinogénesis del cáncer de cuello uterino sigue siendo desconocido.
En nuestro estudio, hemos demostrado que la región promotora del
SALL3
se hypermethylated y, junto con la infección por VPH, está implicado en el cáncer cervical; Además, se había reducido regulado el nivel de expresión de ARNm SALL3. Sugerimos que la metilación del ADN de
SALL3
inhibe su papel como un supresor tumoral y contribuye a la carcinogénesis del cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el "Comité de Ética del primer hospital Afiliado de la Universidad Jiaotong de Xi'an" en Shannxi, china. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes para participar en este estudio.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Las tres líneas celulares de cáncer cervical humano SiHa, HeLa y C33A nos fueron dadas por el Dr. Jing Ji desde el primer hospital Afiliado de la Facultad de Medicina, Universidad de Xi'an Jiaotong [12, 13]. Todas estas células se cultivaron en el alto contenido de glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) (Hyclone, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Si Ji Qing, China) a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2.
5-azacitidina Tratamiento
1.0 × 10
5 /pocillo se cultivaron células SiHa y HeLa por separado en placas de 6 pocillos en DMEM con FBS al 10%, y después de 24 horas, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene 0, 5 o 10 mM 5-azacitidina (5-Aza) (Sigma, EE.UU.). El medio que contiene 5-Aza fue reemplazado cada 24 horas durante un período de 72 horas.
MTT Ensayo
3 × 10
3 /pocillo células SiHa o HeLa se sembraron en 96- pocillos y se cultivaron con 0, 5, 10 o M-5 Aza. A lo largo de un período de 5 días, el medio se reemplazó cada 24 h, y se añadió la misma concentración de 5-Aza. A 3- (4, 5-dimetiltiazol-3-il) -2, se utilizó 5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) de ensayo para evaluar la capacidad de proliferación de las células SiHa y HeLa tras el tratamiento con 5-azacitidina de acuerdo con un protocolo estándar. La viabilidad celular se midió por la absorbancia a 490 nm.
Pacientes y muestras
Veintitrés muestras de tejido de cáncer cervical, 23 muestras de tejido pericarcinomatous emparejados y 17 muestras de tejido cervical normal se obtuvieron de la Primera afiliado del hospital de la Universidad de Xi'an Jiaotong entre enero de 2014 y diciembre de 2014. Todos los pacientes fueron diagnosticados por el examen patológico y ninguno había recibido quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Cada paciente fue voluntario para este estudio de investigación y dieron su consentimiento informado por escrito.
Las muestras de cáncer de cuello uterino se recogieron desde el centro de los tumores, mientras que las muestras de tejidos pericarcinomatous originaron 1,0 cm de distancia del tejido canceroso. Diecisiete muestras de cuello uterino normal se obtuvieron de cuello uterino de los pacientes que se sometieron a una histerectomía total debido a enfermedades uterinos benignos. El tamaño medio de cada muestra fue de 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm. Después se disecaron los tejidos, cada muestra se lavó con PBS esterilizado y se almacena a -80 ° C. Todos los procedimientos se realizaron en hielo.
extracción de ADN, modificación con bisulfito y PCR específica de metilación (MSP)
ADN genómico se aisló a partir de células y tejidos usando un kit Takara Mini BEST universal ADN genómico Extracción (Takara, china) según las instrucciones del fabricante. Un total de 500 ng del ADN extraído fue modificada-bisulfito con el kit EZ metilación del ADN-Gold ™ (Zymo Research, EE.UU.). Los pares de cebadores usados en el MSP ha sido el siguiente:
SALL3
: 5'-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3 '(hacia adelante), 5'-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3' (inverso) para la metilación y 5'-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3 ' (avance), 5'-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3 '(inversa) de no metilación. Ambos de los productos de PCR eran 197 pb. Los programas termociclador fueron las siguientes: 95 ° C durante 10 minutos y 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, la temperatura de hibridación para los pares de cebadores metilados era 51 ° C, mientras que para los pares de cebadores no metilados era 50 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos, seguido de una incubación a 72 ° C durante 7 productos minutos.El de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2%, se tiñeron con Gelview y se visualizaron bajo iluminación ultravioleta. Cada reacción se realizó por triplicado.
prueba de ADN del VPH
VPH-ADN de veintitrés muestras de tejido de cáncer de cuello uterino y diecisiete muestras de tejidos normales del cuello uterino fueron probados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y flujo a través de la hibridación. 21 genotipos de VPH se ensayaron cualitativamente por kit de prueba de HPV genotipificación según el sistema de la fosfatasa alcalina (HybriBio, China), incluyendo tipos de alto riesgo de HPV-16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58 , 59 y 68, los tipos de VPH de bajo riesgo-6,11,42,43,44 y tipos comunes de VPH en china-53,66 y CP8304.
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR (Q- PCR)
ARN total fue extraído a partir de células y tejidos utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real cuantitativa son los siguientes:
SALL3
: 5'-CAAAGCGAGCTCAGAAACAG-3 '(hacia adelante), 5'-CCTGATGCTCCAACTTCAAA-3' (hacia atrás);
GAPDH
:
5 '
-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' (hacia adelante), 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '(hacia atrás). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos y 60 ° C durante 30 segundos. Se utilizó el ciclo umbral (CT) como el punto representativo. La expresión relativa de
SALL3
mRNA en cada grupo (pliegue de cambio comparado con el control) se calculó utilizando la fórmula: RQ = 2
- △△ Ct. Cada reacción se realizó por triplicado.
Análisis estadístico
Todos los datos fueron analizados con el programa SPSS versión 18.0.Consecutive datos se analizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, prueba de Kruskal-Wallis H o de uno El análisis ANOVA manera. Los datos categóricos se compararon mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson. Todas las pruebas estadísticas fueron de 2 caras, y las diferencias en el
p
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Detección del estado de metilación de las regiones promotoras de
SALL3 Hoteles en líneas celulares de cáncer de cuello uterino
metilación del ADN se produce siempre en zonas que son ricos en las islas CpG como regiones promotoras. Una causa común de muchos tumores malignos es hipermetilación anormal o hipometilación del promotor islas CpG, lo que resulta en la represión de la transcripción de muchos genes supresores de tumores o la reactivación de oncogenes. Se utilizó el software en línea "MethPrimer" para perfilar una isla CpG en la región que se encuentra desde -1859 a -54 pb aguas arriba del ATG, el sitio de inicio de transcripción (TSS) en el
SALL3
promotor (Figura 1A ). Un par de cebadores fue diseñado para amplificar el
SALL3
región promotora. Para identificar el estado de metilación de esta región en líneas celulares de cáncer de cuello uterino, se utilizó PCR específica de metilación (MSP) para determinar el
SALL3
estado de metilación en las células SiHa, C33A y HeLa. Los resultados mostraron que esta región en las células SiHa fue completamente metilada, mientras que esta región era completamente no metilado en C33A y parcialmente metilado en células HeLa (Fig 1B).
(A) las islas CpG en la región promotora del predicho
SALL3
. Los números indican las posiciones en pb en relación al sitio de inicio de la transcripción. La región azul representa las islas CpG y las barras verticales rojas son los loci CpG en estas secuencias de entrada. (B) Detección de
SALL3
estado de metilación por MSP en SiHa, C33A y líneas de células HeLa. (M: metilado; T: no metilado) guía empresas
demethylates tratamiento con 5-azacitidina
SALL3
región promotora y revierte la expresión de
SALL3
En la mayoría de los casos, la metilación del ADN es un proceso reversible. Para identificar si el estado de metilación de la región promotora regula la expresión de nuestro gen de interés en el nivel de transcripción, se detectó la expresión de
SALL3 Hoteles en líneas celulares en las que el
SALL3
promotor es fuertemente metilado (SiHa y HeLa) después del tratamiento con 5-azacitidina (5-Aza), que puede causar la desmetilación del ADN. Se midió la metilación por MSP y en tiempo real Q-PCR. Los resultados mostraron que la intensidad de la metilación de la
SALL3
promotor en ambas líneas celulares SiHa y HeLa disminuyó, mientras que la no metilación de
SALL3
aumentó gradualmente a medida que la concentración de 5-Aza aumentó (Fig 2). Por otra parte, se encontró que la expresión de
SALL3
mRNA en las células SiHa y HeLa se incrementó significativamente de una manera dependiente de la dosis después de la administración de 5-Aza (
p
& lt; 0,05); el aumento de la expresión que se observó en las células SiHa fue más notable que la observada en células HeLa (Tabla 1, Fig 3). Estos resultados sugieren que la expresión de
SALL3
fue revertido por la 5-Aza, que demethylated el
SALL3
promotor y promovido la expresión de la
SALL3
génica a nivel transcripcional .
(M: metilado; T: no metilado)..
(*
p Hotel & lt; 0,05)
la desmetilación del
SALL3
promotor podría inhibir la proliferación de células de cáncer cervical
se utilizó un ensayo de MTT para explorar si la capacidad de proliferación de las células SiHa y HeLa se efectuó por
SALL3
metilación. Después del tratamiento con 5-Aza, la viabilidad celular tanto de las células SiHa y HeLa se debilitó en una forma dependiente de la dosis (
p
& lt; 0,05) (Fig 4), lo que demuestra que la desmetilación de la
SALL3 Hoteles en la región promotora podría aumentar la expresión de
SALL3
y dar lugar a una disminución de la viabilidad y capacidad de proliferación de las células de las líneas celulares de cáncer de cuello uterino SiHa y HeLa.
el
SALL3
región promotora se hypermethylated en tejidos de cáncer de cuello uterino
Para confirmar aún más el estado de metilación de la región promotora del
SALL3
en tejidos de cáncer de cuello uterino, se realizó en 23 MSP tejidos de cáncer de cuello uterino, 23 tejidos pericarcinomatous emparejados y 17 tejidos normales del cuello uterino. Como se muestra en la Tabla 2, en tejidos de cáncer de cuello uterino, 15 se metilado (65,21%) y 8 eran no metilado (34,78); en los tejidos pericarcinomatous, 15 se metilado (65,21%) y 8 eran no metilado (34,78%); en los tejidos normales del cuello uterino, 5 se metilado (29,41%) y 12 eran no metilado (70,59%). La diferencia entre los grupos fue significativa (
p
& lt; 0,05) (Tabla 2) excepto que no se observó ninguna diferencia significativa entre el cáncer y tejidos pericarcinomatous (p & gt; 0,05). Sin embargo, el nivel medio de escala de grises fue mayor en los tejidos cancerosos (datos no mostrados). Estos resultados demostraron que el
SALL3
promotor se hypermethylated en tejidos de cáncer, lo que podría desempeñar un papel en la carcinogénesis del cáncer de cuello uterino (figura 5).
La hipermetilación del
SALL3
promotor inhibe la expresión génica en el nivel transcripcional
Hemos detectado la expresión de
SALL3
ARNm en los 23 tejidos de cáncer de cuello uterino, 23 tejidos pericarcinomatous emparejados y 17 tejidos normales del cuello uterino por tiempo real de Q-PCR. En comparación con el cuello uterino normal, la expresión relativa promedio de
SALL3
fue menor en los tejidos de cáncer de cuello uterino (
p Hotel & lt; 0,05) y los tejidos pericarcinomatous (
p Hotel & lt; 0,01 ), pero no se observó diferencia significativa entre los tejidos tumorales y tejidos pericarcinomatous (
p
& gt; 0,05) (Fig 6A)
Estos datos están representados por la mediana con un rango intercuartílico (. *
p
. & lt; 0,05) guía empresas
Además, se separaron estas muestras en dos grupos. Un grupo consistió en los tejidos donde
SALL3
fue metilado la región promotora de, y el otro consistía en los tejidos en los que la región era no metilado. La expresión relativa media de
SALL3
mRNA en los tejidos metilados fue menor que en los tejidos no metilados (
p
& lt; 0,05) (Fig 6B). Estos resultados demostraron que la hipermetilación de
SALL3
inhibido
SALL3
la expresión génica a nivel de transcripción.
infección por VPH de alto riesgo se asoció positivamente con la hipermetilación del
SALL3
región promotora en el cáncer cervical
Dado que la infección por VPH de alto riesgo está implicado en la etiología del cáncer de cuello uterino, que estudiarse más a fondo la relación entre la infección por VPH y la hipermetilación del
SALL3
promotor región en el cáncer cervical. En los tejidos de cáncer de cuello uterino, 14 muestras de 18 VPH-positivos se metilado (77,78%), y 4 fueron metilado (22,22%); 1 de 5 muestras de VPH negativo fue metilado (20,00%), y 4 fueron metilado (80,00%). En los tejidos normales del cuello uterino, 2 de las muestras 6 HPV-positivos se metilado (33,33%), y 4 eran no metilado (66,67%); 3 de 11 muestras de VPH-negativo fue metilado (27,27%), y 8 eran no metilado (72,73%). Los resultados estadísticos combinados se muestran en la Tabla 3. La diferencia entre estos dos grupos fue significativa (
p
& lt; 0,05). Además, se encontró una relación positiva entre la infección por VPH y la hipermetilación del
SALL3
región promotora en los tejidos del cuello uterino (p = 0,010, r = 0,408) (Tabla 3), lo que demuestra que la infección por VPH-AR tiene una cerrar relevancia con la metilación de los
SALL3
regiones promotoras.
por otra parte, la expresión relativa de
SALL3
ARNm en los tejidos de VPH-positivo fue menor que la de los tejidos de VPH-negativos (Fig 7). Los resultados de los tipos de HPV de muestras de tejido del cuello uterino 40 se muestran en la Tabla S1
Estos datos están representados por la mediana con un rango intercuartílico (*
p
& lt; 0,05)..
Discusión
a escala mundial, la tasa de incidencia de cáncer cervicouterino representa el 13% de todos los tumores malignos en mujeres y es sólo superada por el cáncer de mama [14, 15]. Aunque el VPH genital se ha encontrado que tienen una estrecha relación con la etiología del cáncer de cuello de útero, ya pesar del uso generalizado de métodos de detección y vacunas [16], la incidencia y la tasa de mortalidad siguen siendo altas, sobre todo en los países menos desarrollados [17-19 ]. Por lo tanto, la elucidación de la patogénesis del cáncer de cuello de útero es de gran importancia.
Metilación
El ADN es la forma más común de modificación epigenética y es esencial para diversos procesos de desarrollo a través de su regulación de la expresión génica, la impronta genómica, y la herencia epigenética [20]. Estudios recientes han demostrado que la metilación del ADN aberrante en las regiones promotoras (e islas de CG en particular) está estrechamente relacionado con la génesis de muchos tipos de cáncer debido a una reducción en la metilación de todo el genoma o de la hipermetilación de regiones promotoras de genes supresores de tumores afecta a la expresión de genes [21, 22]. Como consecuencia, la metilación anormal de genes relacionados con el tumor juega un papel importante en la carcinogénesis [23]. El descubrimiento de marcadores de metilación específicos de diferentes tipos de cáncer podría tener un profundo impacto.
SALL3
es miembro de la familia SAL localiza en 18q23 [24], un gen esencial en el desarrollo del cuerpo humano . La deleción de 18q23 causó la pérdida de audición, problemas del corazón, retraso mental, retraso del crecimiento, deformidad de las extremidades y así sucesivamente [7, 24] .Para los últimos años, los científicos dirigido a la relevancia entre
SALL3
expresión y la carcinogénesis . Yu
et al
[25] había encontrado
SALL3
hypermethylated promotor en las regiones ricas en CG dinucleótido en líneas celulares de cáncer de vejiga y tejidos, que podría ser un nuevo marcador de metilación del ADN en la detección de la vejiga cáncer. Lo que es más, los promotores de
SALL3
fueron hypermethylated en la línea celular H719 [26]. Además, Yang
et al
[27] descubrió que la hipermetilación de
SALL3
contribuyó a la disminución de
SALL3
ARNm en el CHC.
nuestro estudio, hemos explorado la posibilidad de detectar hypermethylated
SALL3 Hoteles en regiones promotoras como método de cribado para el cáncer de cuello uterino. En líneas celulares de cáncer de cuello uterino SiHa y HeLa, las cuales fueron ambas líneas celulares positivas de HPV, se metilado en
SALL3
regiones promotoras pero en C33A, una línea de células VPH negativa,
SALL3
fue metilado en la región promotora. Mientras tanto, en los tejidos de cáncer de cuello uterino, emparejado tejidos pericarcinomatous y tejidos cuello uterino normal, los resultados mostraron hipermetilación de
SALL3
en el cáncer cervical y los tejidos pericarcinomatous en comparación con en los tejidos del cuello uterino normal (
p
& lt; 0,05 ) .Nuestro resultado fue consistente con Shikauchi
et al
[8] y el Yang
et al
[27].
Tomados estos juntos, la infección de VPH podría participar en el mecanismo de
SALL3
carcinogénesis relacionada con la metilación. El VPH de alto riesgo (VPHar) inducida por la inmortalización y transformación maligna se acompañan de la metilación del ADN de los genes del huésped. Schütze
et al
[28] encontró que la inmortalización inducida por el VPH se asoció con un incremento secuencial y progresiva en la metilación del promotor de un subconjunto de genes, incluyendo hTERT, mir124-2, PRDM14 y así sucesivamente, que era en su mayor independiente de la capacidad de inmortalización viral. En nuestro estudio, sorprendentemente, mediante el análisis de la relación entre la infección por VPH y
SALL3
estado de metilación en los tejidos del cuello uterino, los resultados demostraron que la hipermetilación genómica y la expresión de ARNm más baja en el nivel de transcripción de
SALL3
en tejidos de cáncer de cuello uterino VPH positivas en comparación con los tejidos de VPH-negativos (
p Hotel & lt; 0,05) y la infección por VPH-AR asociado positivamente con la hipermetilación de
SALL3
región promotora (
p Hotel & lt; 0,05, r = 0,408), que era consistente con Schütze y nuestro estudio anterior en líneas celulares de cáncer de cuello uterino, nos trae nuevas pruebas de que la infección por VPH no han participado en la carcinogénesis del cáncer de cuello uterino. Sin embargo, en nuestro estudio, el orden de los dos eventos-HR-HPV infección y
SALL3
producido metilación y si tenían una interacción directa (con E6 /E7 u otro loci de genes) aún sigue siendo desconocido. Vamos a seguir en la búsqueda de los mecanismos de la carcinogénesis inducida por la infección por el VPH y la metilación del ADN en las siguientes investigaciones
.
Con el fin de verificar aún más la relación entre la metilación y la expresión génica, se trataron SiHa y HeLa, que eran fuertemente
SALL3
metilado en la región del promotor, con 5-azacitidina, un agente podría desempeñar un papel en la desmetilación del ADN en un genoma de gran escala. Los resultados sugieren que cuando la concentración de 5-Aza elevado general, el nivel de metilación de
SALL3
dejó así como la expresión no metilado aumentó significativamente en SiHa y HeLa (
p
& lt; 0,05 ). Al mismo tiempo, la expresión relativa de ARNm de
SALL3 Hoteles en SiHa y HeLa aumentar también, y el aumento de la medida en
SALL3
línea celular totalmente metilado SiHa fue más notable que en HeLa, la em
SALL3
línea celular-metilado parcial, lo que sugiere que la desmetilación de
SALL3
podría revertir eficazmente su expresión en el nivel de transcripción. Luego, el ensayo de MTT mostró que después se trató con 5-Aza, la viabilidad celular y la proliferación de SiHa y HeLa debilitado significativamente que ilustra una función de inhibición de cáncer de
SALL3
en células de cáncer de cuello uterino. En muestras de tejido, los resultados Q-PCR indicaron que la expresión del ARNm de
SALL3
fue mayor en el cáncer y tejidos pericarcinomatous que en los tejidos del cuello uterino normal (
p Hotel & lt; 0,05), que compartió el similares idea con estudios anteriores [27]. Además, el análisis estadístico de la expresión de ARNm entre los tejidos metilados y no metilados reveló que en
SALL3
tejidos metilados, el ARNm de
SALL3
fue mayor que en los tejidos no metilados (
p
. & lt; 0,05) .Taken conjunto, los resultados demostraron
SALL3
hipermetilación contribuyó a la baja regulación de la expresión génica en el nivel de transcripción en el cáncer de cuello de útero
en conclusión, nuestro estudio demostró por primera vez que la promotor de
SALL3
era de hipermetilación, y debido a este mecanismo regulado por la expresión de ARNm y se aceleró el crecimiento de células en tejidos de cáncer de cuello uterino y líneas celulares. la infección por VPH de alto riesgo como una etiología del cáncer de cuello de útero participó en
SALL3
metilación. Este estado de metilación aberrante en toda la escala del genoma inactivado su función como un supresor de tumores y contribuyó a la carcinogénesis del cáncer de cuello uterino.
Apoyo a la Información sobre Table S1. los tipos de HPV de muestras de tejido del cuello uterino 40
doi: 10.1371. /journal.pone.0145700.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Esta investigación fue apoyada por un Nacional de Ciencias Naturales Fundación de China (No.81472428).