Extracto
El propósito de este estudio fue investigar el efecto anti-tumoral y los posibles mecanismos de administración i.p. la hipertermia en combinación con α-galactosylceramide (α-GalCer) para el tratamiento de cáncer de ovario. En este estudio, los modelos tumorales inmuno-competentes se establecieron utilizando líneas celulares de cáncer de ovario de murino y se tratan con inyecciones i.p. hipertermia combinación de α-GalCer. Th1 /Th2 perfiles de expresión de citoquinas en el suero, la citotoxicidad de células NK y las actividades fagocíticas de células dendríticas (DC) se ensayaron. También se analizó el número de CD8
+ /IFN-γ
+ células T citotóxicas específicas de tumor, así como el crecimiento del tumor basado en el agotamiento de los linfocitos sub-población. El efecto terapéutico sobre los tumores de ovario se controló mediante un sistema de imagen luminiscente no invasiva. Intra-peritoneal hipertermia inducida significativa la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, y se mantiene la respuesta de NK y los DC inducida por el tratamiento α-GalCer. El tratamiento de combinación mejora la respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL) en modelos de cáncer de ovario dos ratón. Esta nueva modalidad de tratamiento mediante la combinación de hipertermia y glicolípido proporciona una respuesta inmune anti-tumor pronunciada y una mejor supervivencia. En conclusión, la hipertermia intra-peritoneal aumentó la actividad de secreción de citoquinas pro-inflamatorias y fagocítica de las DC estimuladas por α-GalCer. La posterior respuesta inmune CTL inducida por α-GalCer se reforzó aún más mediante la combinación con i.p. hipertermia. Tanto inmunidades innata y adaptativa participaron y dieron lugar a un efecto terapéutico superior en el tratamiento del cáncer de ovario
Visto:. Wu C-C, Chuang Y-T, Hsu Y-T, Huang J-T, Wu T-C, Hung C-F, et al. (2013) intra-peritoneal hipertermia combinación α-galactosylceramide en el tratamiento del cáncer ovárico. PLoS ONE 8 (7): e69336. doi: 10.1371 /journal.pone.0069336
Editor: Moriya Tsuji, Centro de Investigación de SIDA Aaron Diamond con la Universidad Rockefeller, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Febrero, 2013; Aceptado: 7 Junio 2013; Publicado: 23 de julio 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC 98-2314-B-195-008-MY3). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de cáncer de ovario representa sólo el 3% de todos los cánceres en las mujeres, es la neoplasia ginecológica más letal en todo el mundo [1]. Debido a la ausencia de síntomas o signos específicos y la falta de modalidades de detección fiables en la enfermedad temprana, el cáncer de ovario, se diagnostica en una etapa avanzada [2] - [4]. En la actualidad, el tratamiento inicial estándar para el cáncer epitelial de ovario consiste en una cirugía de citorreducción máxima seguida de quimioterapia adyuvante con régimen de combinación de platino-taxano. Aunque las tasas de respuesta son aproximadamente 70-80%, la mayoría de estos pacientes con el tiempo la recaída. A pesar del creciente número de fármacos quimioterapéuticos disponibles para la enfermedad recurrente, el curso de cáncer de ovario por lo general se caracteriza por repetidos períodos de remisión y recaída, y en la mayoría de los casos la enfermedad con el tiempo desarrollar resistencia a los agentes quimioterapéuticos y se convierten en incurables [5]. Basándose en el comportamiento biológico y el patrón de las células de cáncer de ovario difusión, varios i.p. modalidades de tratamiento se han recomendado para lograr un mejor control de la enfermedad [6]. Entre ellos, i.p. cáncer de ovario hipertermia, especialmente cuando se combina con la quimioterapia, se ha demostrado que mejora la eficacia terapéutica, ya sea para óptima o sub-citorreducción óptima, [7], [8]. Se ha informado de que la alta temperatura podría inducir citotoxicidad térmica directa y también llevar "térmica quimio-sensibilización" [9]. En general se cree que los resultados de sensibilización de aumento de la perfusión de tejido y penetración en el tejido de los agentes citotóxicos. Aunque los mecanismos básicos de la hipertermia han sido generalmente bien aceptado, la aplicación de la hipertermia terapéutica en combinación con la quimioterapia para los pacientes es mucho más complejo [10]. la quimioterapia hipertérmica (42-43 ° C) ha sido conocido por estar asociado con una mayor citotoxicidad a las células cancerosas. Sin embargo, hay algunos inconvenientes que limitan su uso en el tratamiento del cáncer de ovario, tales como el potencial de mala curación de anastomosis intestinal, riesgo de contaminación metabolitos quimioterapéuticos para el personal quirúrgico a través de fluido corporal o la inhalación de evaporación agentes de quimioterapia [11]. Además, no se puede aplicar repetidamente sin exploración de la cavidad peritoneal.
sí ha sido demostrado que ejercen una serie de efectos celulares y moleculares, especialmente en la obtención de las alteraciones inmunológicas complejas en el huésped [12] La hipertermia, [ ,,,0],13]. En particular, la hipertermia es capaz de regular por incremento la expresión de la proteína de choque térmico en las células tumorales, y que están asociados con la presentación de antígeno, la presentación cruzada y la inmunidad anti-tumor [14]. Todos estos datos proporcionan la lógica en la mejora de los efectos antitumorales de la hipertermia mediante la combinación con agentes inmunomoduladores.
glicolípidos, tales como α-galactosylceramide (KRN7000, α-GalCer, un glicoesfingolípido) se ha demostrado que inhibir el crecimiento tumoral y prolongar la supervivencia en algunos modelos tumorales de ratón a través de la activación de la respuesta inmune innata y adaptativa [15], [16]. Varios ensayos clínicos han documentado también su seguridad y efectos biológicos en pacientes con tumores sólidos a través de la administración parenteral [17], [18]. Este compuesto en sí mismo no es un agente citotóxico, pero se puede presentar a las células NKT por CD1d [19], [20]. α-GalCer activados por se informó de las células NKT de secretar grandes cantidades de citoquinas, incluyendo IFN-γ e IL-4, y activando de este modo otras células efectoras, tales como células NK, células T, células B, DCs y macrófagos [16]. La administración de α-GalCer en animales también podría inducir la producción de otras citoquinas, tales como IL-2, IL-6, IL-12 y GM-CSF, que también podría reforzar el sistema inmunológico [21].
la hipótesis de que la hipertermia no sólo es citotóxico, pero también es capaz de revelar la inmunogenicidad de las células tumorales, dirigir la respuesta inmune durante el microambiente de las dos vías Th1 /Th2. Hemos propuesto que la adición de α-GalCer puede inducir la activación de células NKT, así como la maduración de las CD. Tras el tratamiento con α-GalCer, una fuerte cascada de citocinas se suscitó posteriormente, impulsando así la interferencia entre las respuestas inmunitarias antitumorales innata y adaptativa.
En este estudio, se utilizaron diferentes células del cáncer ovárico como murinos modelos para poner a prueba nuestras hipótesis y para investigar el efecto anti-tumoral y los mecanismos subyacentes de la IP hipertermia combinado con α-GalCer en el tratamiento de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
ratón y la línea celular
C57BL /6 ratones y BC3F1 (C57BL /6 × C3H F1) ratones se adquirieron de BioLASCO, Taiwan. Los animales fueron atendidos en condiciones libres de patógenos específicos. El ovario línea celular de cáncer de ratón MOSEC-luc (C57BL /6 origen y la expresión por ingeniería de la luciferasa de luciérnaga), ID8-luc (derivado de MOSEC-luc con VEGF sobre-expresión), y HM-1 (origen BC3F1) se cultivaron en RPMI1640 medio (Gibco) suplementado con 10% FBS (Industrial Biológica, Israel), 100 U /ml de penicilina (Gibco) y 100 pg /ml de estreptomicina (Gibco) en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2/95% de aire en 37 ° C.
Declaración de Ética
Todos los experimentos siguieron las directrices en relación con el bienestar animal experimental y se les permitió por IUAUC del Memorial hospital Mackay (MMH-AS-97030).
intra-peritoneal hipertermia y el tratamiento α-GalCer
Para realizar ip hipertermia, laparotomía exploratoria se llevó a cabo después de que los ratones fueron anestesiados con Zoletil (VIRBAC, Francia) y Rompun (Bayer Vital GmbH, Leverkusen) en primer lugar. La cavidad peritoneal de cada ratón fue constantemente llena de 45 ° C 1 × PBS. Climatizada PBS fue rellenado para reemplazar PBS enfriado por la frecuencia de 20~30 seg /ciclo para un total de 10 minutos. En el grupo de tratamiento combinado, se añadieron 2 g de α-GalCer (ciencia Enzo Vida, EE.UU.) en la cavidad peritoneal inmediatamente después de la finalización de la hipertermia. La cavidad peritoneal también se abrió durante 10 minutos en el grupo de control de ratones. Los ratones se mantienen calientes bajo luces del calentador hasta que se recuperaron de la anestesia.
Multiplex suero de citoquinas Detección
La sangre venosa cosechado de la cola de cada ratón se incubó a 37 ° C durante 30 min después se centrifugó a 1500 × g durante 10 min. El suero sobrenadante se transfirió a otro tubo limpio y se almacenó a -20 ° C antes del análisis. La concentración de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, INF-α, y TNF-α en el suero de cada ratón se detectó por BD citométricos de bolas kit Array (BD Bioscience) como se describe por el fabricante.
el aislamiento de células primarias y Detección NK /NKT célula
Para el aislamiento de las células blancas de la sangre (WBC), se recogió la sangre periférica de la vena de la cola de ratones. Los glóbulos rojos en la sangre se retiraron mediante tampón de lisis ACK (Invitrogen) y de los glóbulos blancos se resuspendieron en RPMI 1640 antes del análisis. Para aislar las células dentro de la cavidad peritoneal, los ratones fueron sacrificados por CO
2 eutanasia. Las células dentro de la cavidad peritoneal se recogieron mediante lavado peritoneal con 3% de BSA en frío 1 × PBS. Las células recuperadas de lavado se lavaron y se resuspendieron en medio RPMI 1640. Las células fueron teñidas por FITC-anti-CD3 y el anticuerpo PE-anti-NK1.1 como fabricación descrito (eBioscience). Las poblaciones de células NK y NKT se detectaron mediante citometría de flujo. (Calibur, BD Bioscience). Los resultados se analizaron mediante FACS Software Express.
Detección de Cáncer de células de la apoptosis
Un millón de células ID8-luc fueron inyectados por vía intraperitoneal a cada ratón C57BL /6 en el grupo experimental. Tres días más tarde, i.p. hipertermia fue dado en los ratones portadores de tumores como se describe anteriormente. Ninguna intervención se realizó en el grupo de control de ratones excepto apertura /cierre de la cavidad peritoneal. Un día después, los ratones fueron sacrificados por CO
2 eutanasia. Las células dentro de la cavidad peritoneal se lavaged y se tiñeron con Anexina V-APC y yoduro de propidio (PI, BD Bioscience), y después se sometieron a análisis por citometría de flujo.
citotoxicidad de células peritoneales de Efectos
Veinte miles de células ID8-luc se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo redondo como células diana. Esas placas se sellaron con parafina y se ponen en la superficie del líquido de 42 ° C baño de agua y se incubaron durante 20 min. A continuación se añadieron las células lavaged (de grupo de control o grupo tratado con α-GalCer de ratones) como células efectoras en la célula ID8-luc que contiene bien con los efectores /diana (E /T) relación de 05:01 y 10:01 , y se cultivaron a 37 ° C durante la noche. Después de añadir luciferina (Caliper), la cantidad de células ID8-luc sobrevivido se presentó como la intensidad de quimioluminiscencia detectado por el sistema de formación de imágenes IVIS. (Xenogen).
La fagocitosis de células dendríticas Ensayo
in vitro
Dos microgramos de α-GalCer fueron por vía intraperitoneal inyectada en ratones C57BL /6 y dejó toda la noche. Los ratones con y sin tratamiento α-GalCer fueron sacrificados y los bazos fueron transferidos a medio RPMI 1640. Los esplenocitos se aislaron por la rotura de los bazos de filtro de células 100 micras de 6 cm plato contienen 5 ml de medio RPMI1640. Las células suspendidas se lavaron y los RBC se retiraron mediante tampón de lisis ACK (Invitrogen). Las DCs en los esplenocitos se purificaron mediante perlas magnéticas anti-CD11c (MACS, Alemania). Para el ensayo de fagocitosis, las células ID8-luc se tiñeron con 25 M de CFSE (Sigma) y luego se les dio un tratamiento térmico como se describe anteriormente. DC purificadas de grupo de control o α-GalCer-tratadas grupo de ratones fueron co-cultivadas con 1 × 10
5 de cualquiera de las células ID8-luc teñidas con CFSE calentadas o no calentadas durante 6 horas. DCs eran etiquetado por tinción con anticuerpo APC-anti-CD11c (eBioscience). El porcentaje de países en desarrollo CFSE-positivos se analizó mediante citometría de flujo con la compuerta de células positivas CD11c.
La fagocitosis de células dendríticas Ensayo
in vivo
Un millón de CFSE-manchado (25 M) células ID8-luc fueron ip se inyecta en ratones C57BL /6. En los próximos días, todos los ratones se dividieron en 4 grupos y se les i.p. hipertermia y /o 2 g de a-GalCer. Los ratones recibieron una laparotomía solamente (sin tratamiento farmacológico) fue establecido como grupo de control. Después de 24 horas, se lavaron las células intraperitoneal y se tiñeron con PE-anti-ratón CD11b y CD11c anticuerpos APC-anti-ratón (eBioscience). El porcentaje de países en desarrollo CFSE-positivos se analizó mediante citometría de flujo mediante la selección de CD11b
+ /CD11c
+ células positivas.
Tumor específico CD8
+ T Cell Inmunoensayo
Un millón de células HM-1 fueron ip se inyectan en ratones B6C3F1 y 3 × 10
5 de las células ID8-luc se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones C57BL /6. Tres días después, los ratones fueron anestesiados y i.p. tratados con o sin α-GalCer. Después de una o tres semanas, los ratones fueron sacrificados para el aislamiento de los esplenocitos. Los esplenocitos (1 × 10
7) se cultivaron con o sin 1 × 10
5 de las células cancerosas syngenetic (los que habían sido inyectados en la cavidad peritoneal de los ratones) con 1 g de Golgi-tapón (BD Pharmingen ) en placas de 24 pocillos. En el día siguiente, las células se tiñeron con la rata anti-ratón monoclonal APC conjugado CD8a (eBioscience) durante 20 minutos, y se fijaron con kit Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen), seguido de tinción con la rata conjugado con FITC anti-interferón del ratón -γ (eBioscience) como fabricación descrito. El número de células positivas CD8 /interferón gamma se analizó mediante citometría de flujo.
no invasiva crecimiento tumoral Medición
Un millón de células MOSEC-luc eran i.p. se inyecta en ratones C57BL /6. Después de una semana, i.p. hipertermia se realizó con o sin tratamiento α-GalCer. El crecimiento del tumor de células MOSEC-luc en ratones se detectó por quimioluminiscencia sistema de imagen no invasiva (IVIS, Xenogen).
El agotamiento de las subpoblaciones de linfocitos
Un millón de células MOSEC-luc fueron por vía intraperitoneal se inyecta en ratones C57BL /6. Cinco días después, los ratones se dividieron en 4 grupos y recibieron i.p. inyección de cualquiera de 100 g anti-ratón CD4 (clon GK1.5), anti-ratón CD8 (clon TIB210) o anticuerpos de control IgG de rata (Millipore) en un intervalo de 2 días. Todos los ratones se les administró i.p. la hipertermia se combina con 2 g de α-GalCer una semana después de la inoculación del tumor. El crecimiento del tumor se midió por el sistema de formación de imágenes IVIS no invasiva como se ha descrito anteriormente.
Estadísticas
Todos los resultados fueron representados por la media ± SE (error estándar) de al menos dos experimentos independientes. Las comparaciones entre los diferentes puntos de datos se realizaron utilizando la prueba de ANOVA o la prueba de la t de Student. La supervivencia fue representada por la curva de Kaplan-Meier y se compararon mediante el uso de análisis de largo rango.
Resultados
intra-peritoneal hipertermia Enhanced la secreción de citoquinas pro-inflamatorias inducidas por α-GalCer
los efectos principales anti-tumorales de α-GalCer se cree que son a través de la modulación de las cascadas inmunes aguas abajo mediante la estimulación de la producción de citoquinas Th1 /Th2 por las células NKT. A excepción de IL-5, i.p. hipertermia mejora aún más la secreción de estas citoquinas seis inicialmente provocada por i.p. a-GalCer tratamiento. Primero examinamos si la adición de i.p. hipertermia es capaz de influir en la expresión de estas citocinas estimuladas por la instalación α-GalCer. Figura 1 muestra que i.p. hipertermia por sí sola no alteró los niveles de citoquinas Th1 /Th2, mientras que i.p. administración a-GalCer desencadena la secreción de varias citoquinas, que alcanzó su nivel más alto en diferentes puntos temporales. Los niveles de IL-2 (p = 0,0003, α-GalCer
frente
control), IL-4 (p = 0,0012, α-GalCer
frente
control), IL-6 (p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
de control), y el factor de necrosis tisular alfa (TNF-α) (p = 0.0007, α-GalCer
frente
control) alcanzó su punto máximo en 6 horas, mientras que la IL 5 e IL-13 alcanzó su punto máximo en 12 horas (p = 0,0013, α-GalCer
frente
control para IL-5; p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
control para IL-13) . Tomó hasta 24 horas para que el IFN-γto alcanzar su nivel máximo (p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
control). Excepto IL-5, i.p. hipertermia mejora aún más la secreción de estas citoquinas cinco inicialmente provocada por i.p. α-GalCer tratamiento (p = 0,0056, por IL-2; p = 0,0041, por IL-4; p & lt; 0,0001 para IL-6; p = 0,0058, por IFN-γ y p = 0,018 para el TNF-α). Este modo de tratamiento también aumentó la secreción de IL-13 (p & lt; 0,0001, hipertermia, más α-GalCer frente a α-GalCer solo) que alcanzó antes en 6 horas después de tratamiento. Estos resultados indican que α-GalCer podría inducir respuesta inmune anti-tumor más fuerte principalmente a través de la mejora de Th1 /Th2 citoquinas expresión mediante la combinación con i.p. hipertermia.
ratones C57BL /6 fueron divididos en 4 grupos con 5 ratones de cada grupo y se tratan con inyecciones i.p. hipertermia sólo a 43 ° C durante 10 min, i.p. añadido 2 g de α-GalCer, y la combinación de ambos. Los ratones del grupo de control sólo se llevaron a cabo laparotomía exploratoria durante 10 minutos. suero de ratón se recogieron a las 6, 12, y 24 horas después de tratamiento. IL-2, IL-4, IL-5, interferón-γ, TNF-α, IL-6 y IL-13 concentraciones de suero fueron detectados por kit CBA multiplex. Algunos niveles de citoquinas se incrementaron en un α-GalCer y alcanzaron un máximo de 6 horas después del tratamiento (IL-2, p = 0,0003, α-GalCer solos
frente
control), (IL-4, p = 0,0012, α -GalCer solos
frente
control), (IL-6, p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
control), (TNF-α, p = 0,0007, α-GalCer
frente
control); Algunos llegaron a un máximo de 12 horas después del tratamiento (IL-5, p = 0,0013, α-GalCer
frente
control) (IL-13, p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
control); uno alcanzó su punto máximo a las 24 horas después del tratamiento (INF-γ, p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
control). A excepción de IL-5, los niveles de citoquinas Th1 /Th2 fueron mayores en el grupo de tratamiento combinado de a-GalCer solo grupo (IL-2, p = 0,0056; IL-4, p = 0,0041; TNF-α, p = 0,018; INF -γ, p = 0,0058). El nivel de pico de IL-13 se alcanzó antes en el grupo de tratamiento combinado y su nivel fue mucho mayor que la de α-GalCer sola (p & lt; 0,0001). Estos resultados implicaron que el tratamiento con α-GalCer podría desencadenar la respuesta inmune hacia la ruta Th1 /Th2 y la hipertermia podría mejorar aún más este efecto. (# P & lt; 0,05; * p & lt; 0,01; ** p & lt; 0,001; *** p & lt; 0,0001).
α-GalCer tratos que exhibe efectos citotóxicos sinérgicos contra las células de un cáncer ovárico climatizada
se ha demostrado que los principales efectos anti-tumorales inducidas por α-GalCer son a través de la liberación de ciertas citocinas, que aumentan las actividades de las células NK o T. Para investigar si el tratamiento con α-GalCer tiene un impacto en la actividad de las células NK, que supervisó la población de células NK en diferentes puntos de tiempo después por vía intraperitoneal a-GalCer tratamiento. En la sangre periférica, la población de células NK no cambió significativamente en primera 24 hr. Sin embargo, el porcentaje de células NK aumentó dramáticamente de 72 horas después del tratamiento (Figura 2A; p & lt; 0,001, 72 hr
frente gratis en otras puntos de tiempo). Dentro de la cavidad peritoneal, la población de células NK aumentó en 3 horas después de la administración α-GalCer, y la adición de i.p. hipertermia no afectó a los incrementos (Figura 2B).
(A) 2 g de α-ip GalCer se inyectaron en 5 ratones C57BL /6 y se recogió la sangre de la vena de la cola a las 0,5, 1, 3, 6 , 24 y 72 horas después del tratamiento. La variación proporción de células NK en sangre periférica se analizó por citometría de flujo con CD3 fluorescente y la tinción de anticuerpos NK1.1. Los resultados demostraron que α-GalCer reclutado significativamente la población de células NK en sangre periférica 72 h después del tratamiento. (P & lt; 0,001, 72 hr
frente
otras puntos de tiempo) (B) C57BL /6 ratones fueron divididos en 4 grupos y se trataron por hipertermia intraperitoneal a 43 ° C, 2 g de α-GalCer, o su combinación. Los ratones del grupo de control sólo se abrieron el abdomen durante 10 minutos. células intra-peritoneales se recolectaron mediante lavado peritoneal 3 horas después del tratamiento. Variación en las proporciones de las células NK intra-peritoneal se analizó por citometría de flujo con CD3 fluorescente y la tinción de anticuerpos NK1.1. El i.p. resultados implícita administración a-GalCer aumentó proporción local de las células NK en unas pocas horas. La combinación de la hipertermia no comprometió este efecto. (P = 0,0007, α-GalCer
frente
control; p = 0,0009, α-GalCer
frente
hipertermia; no es diferente significativa entre α-GalCer solo y tratamiento combinado) (C) del tumor ID8 llevando los ratones C57BL /6 fueron tratados con hipertermia intra-peritoneal a 43 ° C durante 10 min. Un día después del tratamiento, las células intraperitoneal se lavaron y se tiñeron con anexina V y PI. Las células cancerosas fueron cerrada y el índice de apoptosis se analizó por citometría de flujo. La proporción de las células cancerosas apoptóticas se incrementó después de la hipertermia intra-peritoneal. (P = 0.0084, hipertermia
frente
control) (D) 2 × 10
4 de células ID8-luc se sembraron en placas de botón redondo de 96 pocillos y se calienta en 42 ° C baño de agua durante 20 minutos . Diferentes proporciones de células lavaged intra-peritoneales de ratones i.p. inyectados con o sin α-GalCer se añadieron entonces en el pozo como células efectoras y co-cultivaron durante una noche con células ID8-luc calentadas o no calentadas como células diana. Se utilizaron células no calentadas ID8-luc co-cultivadas con células sin tratar lavaged α-GalCer como control. La citotoxicidad representado por la intensidad de chemoluminence era el detectado por el sistema de formación de imágenes IVIS. Los resultados mostraron que el co-cultivo de células de cáncer climatizada con células de lavado intra-peritoneales de ratones tratados con GalCer α inducidos más alta citotoxicidad de células de cáncer in vitro. (En E /T = relación de 05:01, p & lt; 0,0001, el calor, más α-GalCer
frente
control; p = 0,0162, el calor, más α-GalCer
frente al calor; p = 0,0004 , además de calor α-GalCer
frente a una
-GalCer). (# P & lt; 0,05; ** p & lt; 0,001; *** p & lt; 0,0001).
La hipertermia se ha informado para causar la muerte de las células cancerosas. En los ratones portadores de tumores ID8, se encontró que las células ID8 más apoptóticos (ip) en los ratones tratados por hipertermia que los de los ratones de control (Figura 2C; p = 0,0084, hipertermia
frente
control)
En el
ex-vivo
co-cultivo, también se encontró que las células ID8 calefacción eran más susceptibles a las células lavaged peritoneales obtenidos de los ratones tratados con α-GalCer (Figura 2D; p = 0,0004, se calienta
frente
células ID8 no calentadas de la E /T proporción 05:01). Estos resultados implicaban que i.p. administración de α-GalCer podría reclutar más células NK, lo que lleva a una mayor destrucción de células de cáncer, y la hipertermia induce un efecto citotóxico adicional a las células cancerosas.
tratamiento que combina i.p. La hipertermia con α-GalCer generó un efecto sinérgico sobre la PED Fagocíticas Actividades
in vitro e in vivo
Una de las actividades antitumorales de células NKT implica la activación de las DC. La principal función de las DC en la inmunidad anti-tumor es para engullir las células tumorales y antígenos tumorales presentes a las células efectoras pertinentes, tales como células T citotóxicas. Además, investigó los efectos resultantes del tratamiento con α-GalCer con la hipertermia sobre las actividades fagocíticas de los países en desarrollo. Sobre la base de co-cultivo de células de cáncer con DCs aisladas de bazo, se encuentra que las células cancerosas con calefacción eran más susceptibles a la fagocitosis DCs '(Figura 3A; p = 0,005, hipertermia
frente
control). Por otra parte, los DC aislados de ratones exhibieron actividades significativamente más altos de la fagocitosis α-GalCer-tratados (p = 0,0037, α-GalCer
frente
control). Poner juntos, co-cultivo de las células de cáncer con calefacción DCs obtenidas a partir de ratones tratados con α-GalCer demostró mucho más fagocitosis (p = 0,0002, el tratamiento combinado
frente
control; p = 0,0008, el tratamiento combinado
frente
hipertermia; p = 0,005, el tratamiento combinado
frente
α-GalCer). Estos resultados mostraron que el tratamiento con α-GalCer más hipertermia que conduce a un efecto sinérgico sobre las CD 'fagocitosis
in vitro.
Teniendo en cuenta que el tratamiento combinado se administró a las células diana con cáncer intra-peritoneal, se analizaron las actividades fagocíticas del intra DCs -peritoneal obtenidos a través de lavado peritoneal. Contando el número de CFSE-manchado CD11b
+ /CD11c
+ DCs, se observa que α-GalCer mejoró las actividades fagocíticas del i.p. DC (p = 0,0289, α-GalCer
frente
de control) e hipertermia, más α-GalCer mejorar aún más este efecto (p = .0.038, combinado
frente
α-GalCer solo). Estos resultados mostraron claramente que el tratamiento α-GalCer más hipertermia también conduce a un efecto sinérgico sobre la fagocitosis DCs 'dentro de la cavidad peritoneal.
ratones C57BL /6 (A) fueron primero i.p. inyectados con 2 g de α-GalCer. Después de 18 h, los ratones fueron sacrificados y los DC se purificaron a partir de bazos de perlas magnéticas anti-CD11c. Para el ensayo de fagocitosis de células dendríticas, las células se tiñeron primero ID8 con CFSE y se calienta en 42 ° C baño de agua durante 20 minutos. Las DCs de α-GalCer estimulados (o no estimuladas con) los ratones fueron co-cultivadas con células ID8 calentadas o no calentadas de 6 horas a la relación de 05:01. La proporción de países en desarrollo con la actividad fagocítica se representa como CFSE positivo en CD11c cerrada células analizadas por citometría de flujo que expresa. Los resultados mostraron que tanto la
in vitro
tratamiento térmico en las células del cáncer y
in vivo
estimulación de DC por α-GalCer podría potenciar la actividad fagocítica de los países en desarrollo (p = 0,005, el calor
frente
control; p = 0,0037, α-GalCer
frente
control). El efecto sinérgico surgió en el tratamiento combinado (p = 0,0002, el tratamiento combinado
frente
control; p = 0,0008 tratamiento combinado
frente al calor, p = 0,005, el tratamiento combinado
contra
α-GalCer). (B) C57BL /6 ratones fueron i.p. inyectados con 1 × 10
6 células teñidas con CFSE ID8. En el día siguiente, los ratones se dividieron en cuatro grupos con el tratamiento por vía i.p. hipertermia y /o α-GalCer como se describió previamente. Un día después, se recogieron las células intra-peritoneal a través de inyecciones i.p. células
lavado y la proporción de CFSE-CD11b positivo
+ /+ CD11c que indican las actividades fagocíticas de los países en desarrollo fueron analizadas por citometría de flujo. Se muestra que el tratamiento con α-GalCer podría aumentar la fagocitosis de los DC
in vivo
(p = 0,0289, α-GalCer
frente
control). Este efecto fue aún mayor por hipertermia adicionales (p = 0,038, el tratamiento combinado
frente
α-GalCer). (# P & lt; 0,05; * p & lt; 0,01; ** p & lt; 0,001).
Combinación de intra-peritoneal hipertermia y el α-GalCer suscitó un tumor-específica citotóxicos CD8
+ T Cell Respuesta inmune
Dado que el tratamiento α-GalCer puede mejorar las actividades fagocíticas de los países en desarrollo y la hipertermia puede fortalecer aún más este efecto, la siguiente pregunta sería si la combinación de IP hipertermia y tratamiento α-GalCer podrían inducir una respuesta de células T citotóxicas específicas de tumor. Para evaluar la presencia de respuesta inmune celular contra las células cancerosas, dos diferentes células de cáncer de ovario de ratón, HM-1 y ID8-luc, se utilizaron como modelos de tumores inmuno-competentes. Siete días después del tratamiento, el tratamiento de ratones HM-1-cojinete con α-GalCer solo se limiten a aumentar un pequeño número de tumor-específica CD8
+ T células dentro de los esplenocitos (p = 0,0033, α-GalCer solos
frente
control). Sin embargo, encontramos un aumento significativo en el número de tumor-específica CD8
+ células T en HM-1-cojinete de ratones tratados con inyecciones i.p. hipertermia, más α-GalCer (p & lt; 0,0001, el tratamiento combinado
frente
control; p & lt; 0,0001, el tratamiento combinado
frente
hipertermia; p = 0,0026, el tratamiento combinado
frente
α -GalCer solo, Figura 4A). En el modelo ID8-luc, tumor- CD8 específica
+ T respuesta inmune celular se pudo detectar en el grupo tratado con α-GalCer sola (p & lt; 0,0001, α-GalCer solos
frente
control). Sin embargo, se encontró que este efecto sea más significativa en el grupo tratado con la terapia combinada (p & lt; 0,0001, el tratamiento combinado
frente
otros grupos). La mejora de la respuesta CTL específicos del tumor fue disminuida por 21 días después del tratamiento (datos no muestran). Esto puede ser debido al crecimiento excesivo de las células tumorales que restringían la respuesta inmune anti-tumor inducida por único tratamiento de una sola vez. Teóricamente sería mucho eficaz si la hipertermia puede realizarse repetidamente, o el crecimiento del tumor eventualmente podría superar la respuesta inmune anti-tumor en este modelo de tumor de crecimiento rápido. Estos resultados demostraron que i.p. hipertermia puede mejorar aún más el citotóxicos CD8
+ células T respuesta inmune específica del tumor inducida por el tratamiento α-GalCer.
células (A) 1 × 10
6 de HM-1 se inyecta en IP los ratones B6C3F1 y (B) 3 × 10
5 de células ID8-luc fueron ip se inyecta en ratones C57BL /6. Los ratones se dividieron en cuatro grupos (control no tratado, hipertermia solamente, α-GalCer solos y el tratamiento con hipertermia, más α-GalCer combinados) con cinco ratones por grupo y se trataron como se ha descrito anteriormente. Después de 7 días, los esplenocitos se aislaron y se estimularon durante la noche con células ID8 o células HM-1. Los esplenocitos de cada grupo sin re-estimuladas con células ID8 o células HM-1 también se cultivaron durante la noche como control. El porcentaje de cáncer específico CTL CD8 representa como
+ /IFN-γ
+ se detectaron mediante citometría de flujo mediante la selección de 2 × 10
5 linfocitos. Se muestra que, los 7 días después del tratamiento, i.p. tratamiento α-GalCer aumentó ligeramente el número de CTL específicos del tumor (p = 0,0033, el control
frente
α-GalCer para HM-1; p & lt; 0,0001, α-GalCer
frente
control para ID8 ). La hipertermia más α-GalCer exhibió efecto más fuerte en la activación de CTL (p = 0,0026, el tratamiento específico combinado
frente
α-GalCer para HM-1; p & lt; 0,0001, el tratamiento combinado
frente
α-GalCer para ID8). (* P & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001).
intra-peritoneal hipertermia Enhanced los efectos terapéuticos de α-GalCer
in vivo
es evidente que la propiedad intelectual hipertermia mejora tanto las respuestas inmunes anti-tumorales innata y adaptativa inducidos por el tratamiento α-GalCer. Hemos validado si este tratamiento combinatorio podría resultar en un mejor efecto terapéutico
in vivo
. En MOSEC-luc tumor-teniendo ratones C57BL /6, i.p. hipertermia, más α-GalCer exhibió una inhibición más fuerte del crecimiento tumoral (Figura 5A; p & lt; 0,05, tratamiento combinado
frente
α-GalCer solo). Y este tratamiento también prolongó el tiempo de supervivencia de ratones portadores de tumores (Figura 5B; p = 0,0018, el tratamiento combinado
frente
control).