1
Extracto
La acumulación de pruebas indica que una pequeña población de células madre del cáncer (CSC) está implicada en resistencia intrínseca al tratamiento del cáncer. El microambiente hipóxico es un importante nicho de células madre que promueve la persistencia de células madre cancerosas en tumores. Nuestro objetivo era para dilucidar el papel de la hipoxia y células madre cancerosas en la resistencia a gefitinib en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) con la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico mutación (EGFR). líneas celulares de cáncer, PC9 y HCC827, que expresan los
EGFR
exón 19 mutaciones por deleción, fueron expuestos a altas concentraciones de gefitinib en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia. Siete días después de la exposición a gefitinib, se detectó una pequeña fracción de células viables, y éstos se conoce como "persisters gefitinib resistentes" (GRPs). CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, y ALDH1A1-todos los genes implicados en stemness-fueron altamente expresado en los GRPs en PC9 y HCC827 células, y PC9 GRP exhibieron un alto potencial de tumorigenicidad
in vivo
. La expresión del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1) también se upregulated y receptor IGF1 (IGF1R) se activó el GRP. Es importante destacar que la exposición hipóxica aumentó significativamente la formación de esfera, lo que refleja la capacidad de auto-renovación, y la población de CD133- y GRPs Oct4-positivos. Además, la hipoxia aumentó la expresión de IGF-1 a través del factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α), y marcadamente promovió la activación de IGF1R en GRP. Desmontables expresión de IGF-1 redujo significativamente GRP-IGF1R expresar fosforilados en condiciones de hipoxia. Por último, la inhibición de HIF1α o IGF1R por inhibidores específicos disminuyó significativamente la población de CD133- y GRPs Oct4-positivas, las que fueron ampliadas por la hipoxia en el PC9 y HCC827 células. En conjunto, estos resultados sugieren que la hipoxia aumenta la población de células madre cancerosas de pulmón resistentes a gefitinib en
EGFR
mutación positiva del NSCLC mediante la activación de IGF1R. Orientación de la vía IGF1R puede ser una estrategia prometedora para la superación de la resistencia a gefitinib en
EGFR
mutación positiva del NSCLC inducida por células madre cancerosas de pulmón y los factores del microambiente tales como la hipoxia tumoral
Visto:. Murakami A, Takahashi F , Nurwidya F, Kobayashi I, Minakata K, Hashimoto H, et al. (2014) La hipoxia cáncer de pulmón aumenta gefitinib resistente a las células madre a través de la activación de la insulina factor de crecimiento similar 1 receptor. PLoS ONE 9 (1): e86459. doi: 10.1371 /journal.pone.0086459
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de julio de 2013; Aceptado: 13 de diciembre de 2013; Publicado: 28 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Murakami et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica No. 23591906 (Fumiyuki Takahashi) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la adquisición de resistencia a los medicamentos contra el cáncer sigue siendo un obstáculo fundamental para mejorar el pronóstico de los pacientes con cáncer. La resistencia a fármacos puede ocurrir a través de una variedad de mecanismos, incluyendo la salida del fármaco a partir de células cancerosas, el metabolismo de fármacos aumentada, las mutaciones secundarias en el objetivo de drogas, y el compromiso de las vías de supervivencia alternativas [1]. Estos mecanismos de resistencia adquirida son causadas generalmente por alteraciones genéticas en las células tumorales, que persisten durante el tratamiento del cáncer. Sin embargo, estudios recientes también han puesto de manifiesto los mecanismos no mutaciones de resistencia a los medicamentos, incluida la existencia de la pequeña población de células madre del cáncer (CSC) [2]. CSC, que también se conocen como células iniciadoras de tumores y las células cancerosas de tallo como, marcadores expresas de células madre, incluyendo CD133, ABCG2, Bmi-1, y Oct4, y puede formar esferas flotantes en medio libre de suero, de una propiedad asociada con el vástago las células [3] - [5]. aumento de la evidencia indica que pequeñas poblaciones de células madre cancerosas son intrínsecamente más refractario a una variedad de fármacos contra el cáncer y son responsables de la resistencia al tratamiento del cáncer, que a menudo acompaña a la recaída del tumor [6]. Por lo tanto, las CSC de orientación pueden mejorar los resultados del tratamiento y conducir al desarrollo de nuevas terapias para pacientes con cáncer.
"nichos" de células madre se definen como lugares o microambientes particulares que mantienen las propiedades de las células madre auto-renovación y multipotencia [ ,,,0],7], [8]. Los tumores sólidos a menudo contienen regiones con entrega insuficiente de oxígeno, una condición conocida como hipoxia, y varios informes recientes han sugerido que la hipoxia promueve la persistencia de células madre cancerosas en tumores [9]. Este nicho hipóxica es responsable del mantenimiento de CSC y desempeña un papel en la promoción de la resistencia terapéutica [10]. Por lo tanto, la orientación del microambiente hipóxico puede ser otra estrategia prometedora para el control efectivo de las CSC [9].
El cáncer avanzado de pulmón no microcítico (CPNM) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [11]. Las mutaciones somáticas en el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tales como una mutación por deleción en marco en el exón 19, están asociados con una respuesta favorable a los inhibidores de tirosina quinasa de EGFR (EGFR-TKIs), gefitinib y erlotinib [12]. mutaciones en el dominio quinasa de EGFR producen con una frecuencia significativamente mayor en los tumores de pacientes asiáticos orientales en comparación con los no asiáticos [13]. Sin embargo, en la mayoría de los informes, la supervivencia libre de progresión de los pacientes no supere los 12 meses, y la mayoría de los pacientes desarrolló resistencia adquirida [14]. Además, el 25-30% de los pacientes son intrínsecamente resistentes a EGFR-TKI ya que sus tumores se diagnostican como albergar mutaciones activadoras en
EGFR
[15], [16]. Los principales mecanismos de resistencia identificados hasta la fecha incluyen mutaciones secundarias y un "botón de quinasa oncogén." El
EGFR
cuentas de mutación T790M para el 50% de los casos, y
MET
amplificación puede detectarse en el 20 % de pacientes con
EGFR TKI
-mutant NSCLC resistentes [17]. Sin embargo, los mecanismos responsables de la resistencia intrínseca y otra resistencia adquirida a EGFR-TKI, así como la cuestión de si células madre cancerosas y nichos de hipoxia contribuyen a la resistencia a EGFR-TKI, no se entienden completamente.
IGF1R es un transmembrana receptor de la tirosina quinasa responsable de la proliferación celular y la supervivencia [18]. IGF1R se expresa en muchos tipos de células cancerosas, incluyendo NSCLC [18], y el aumento de la activación de IGF1R está implicada en la resistencia a la quimioterapia y terapias dirigidas tales como EGFR-TKI [19], [20]. Varios informes recientes han sugerido que IGF1R juega un papel crítico en la supervivencia de algunas células madre cancerosas [21]. células de cáncer colorrectal quimiorresistente fueron enriquecidas para células madre cancerosas y aumento de la sensibilidad a la inhibición IGF1R [21]. Según Sharma et al., La subpoblación tolerante-fármaco después de la exposición al fármaco letal parecía tener el fenotipo CSC y expresó IGF1R fosforilada en varios modelos de líneas celulares probadas, incluyendo la línea de células PC9 NSCLC. El cotratamiento de las células PC9 con EGFR-TKI más IGF1R inhibidor impidió aparición del fenotipo tolerante a las drogas CSC [2]. hallazgos colectivos sugieren un posible papel de IGF1R señalización en la tolerancia a las drogas de los CAC a EGFR-TKI. Sin embargo, la correlación entre la hipoxia, los CAC, y la señalización en la resistencia a EGFR-TKI IGF1R no se ha aclarado.
En este estudio, hemos examinado el papel de la hipoxia en la persistencia de las células madre cancerosas de pulmón en la resistencia a gefitinib en el CPNM con la activación
EGFR
mutaciones. El NSCLC líneas celulares PC9 y HCC827, que lleva un activador
EGFR
mutación, fueron expuestas a una alta concentración de gefitinib en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia. Se encontró que la hipoxia aumentó células madre cancerosas de pulmón resistente a gefitinib en
EGFR
mutación positiva de NSCLC mediante la activación de IGF1R. Se investigó la importancia biológica de la hipoxia de la persistencia de células madre cancerosas resistentes a gefitinib y una mayor activación de IGF1R.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y reactivos
Las líneas celulares de cáncer PC9 y HCC827, que expresan
EGFR
exón 19 mutaciones por deleción (ΔE746-A750), se utilizaron en este estudio. Se establecieron células PC9 en la Universidad Médica de Tokio (Tokio, Japón), como se describe anteriormente [22], y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Kazuto Nishio (Departamento de Biología del Genoma de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kinki, Osaka). Se obtuvieron HCC827 células de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las líneas celulares fueron verificadas para ser libres de micoplasma. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japón) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina, y estreptomicina (100 U /ml y 100 mg /ml, respectivamente), y se cultivaron en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C en una incubadora, en la que se llevó a cabo la tensión de oxígeno en cualquiera de 21% (normoxia) o 1% (hipoxia). Gefitinib se adquirió de JS Investigación Química Trading (Wedel, Alemania). YC-1 y AEW541 fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y Selleck Químicos (Houston, TX, EE.UU.), respectivamente.
Generación de persisters resistentes a gefitinib (GRP)
Un total de 2 × 10
5 células se sembraron en diez placas de 10 cm y se dejaron adherir durante 24 horas. Las células fueron entonces tratados con gefitinib a una concentración de 1 mM, que es 30-50 veces el establecido IC
50 valores, y se incubaron en normoxia (21% O
2) o hipoxia (1% O
2). Se reemplazó el medio con medio fresco que contenía gefitinib cada 3 días. Las células viables que quedaban adjuntos en el plato en el día 7 en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia se consideraron persisters gefitinib resistente (GRPs) o gefitinib persisters resistente hipóxicas (GRPs hipóxicas), respectivamente, y se recogieron para su análisis. La identidad genética de GRP con las células parentales se confirmó mediante el GenomeLab humano STR conjunto de cebadores de Beckman Coulter (Fullerton, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuantitativo PCR en tiempo real
ARN totales se extrajeron a partir de líneas celulares usando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). El ADNc se genera a partir de 1 o 2 g de ARN usando el kit First-Strand cDNA Synthesis (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) se realizó utilizando Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [22]. El programa siguiente se llevó a cabo: mantenimiento a 95 ° C durante 20 seg, a través de la amplificación de 40 ciclos de desnaturalización (95 ° C durante 3 segundos, hibridación, y extensión a 60 ° C durante 30 seg), con el análisis de fusión curva concurrente. Se evaluaron once genes de mantenimiento (
ACTB, GAPDH, UBC, B2M, YWHAZ, SF3A1, 28S rRNA, EIF4A2, SDHA, TOP1, España y
ATP5B
) en las muestras experimentales para identificar los más establemente control de los genes expresados utilizando el software geNorm (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). beta actina (
ACTB
) y complejo succinato deshidrogenasa, subunidad A flavoproteına (
SDHA
) fueron identificados como los genes de limpieza más estables de nuestros modelos celulares mediante análisis qPCR; Por lo tanto,
ACTB
o
SDHA
se utilizaron como controles internos
Los cebadores que eran específicas para los genes fueron los siguientes:.
CD133
adelante, 5'-GGCCCAGTACAACACTACCAA-3 '
inversa, 5'-CGCCTCCTAGCACTGAATTGATA-3'
Oct4
adelante, 5'-3-GAGTGAGAGGCAACCTGGAG '
inversa, 5'-GCCGGTTACAGAACCACACT-3'
Sox2
adelante, 5'-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3 '
inversa, 5'-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG -3 '
Nanog
adelante, 5'-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3'
inversa, 5'-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3 '
CXCR4
adelante, 5'-ACGCCACCAACAGTCAGAG-3 '
inversa, 5'-AGTCGGGAATAGTCAGCAGGA-3'
ALDH1A1
adelante, 5'-GCACGCCAGACTTACCTGTC-3 '
inversa, 5'-CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG-3 '
IGF1
adelante, 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3'
inversa, 5'-3-CGACTGCTGGAGCCATACC '
inmunofluorescencia
PC9 o HCC827 células fueron cultivadas en cámara de Lab-Tek II diapositivas (Nunc, Rochester, NY, EE.UU.) con o sin 1 M o 2 M y gefitinib en condiciones de normoxia o hipoxia condiciones de 72 h, se fijaron con 8% de paraformaldehído durante 20 min, y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 para 3 min. Después de bloquear con suero de cabra al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 min a temperatura ambiente, las células se incubaron a 4 ° C durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), IGF1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), y pIGF1R (Sigma-Aldrich). Las proteínas se visualizaron por incubación con anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 de IgG de cabra anti-conejo o Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los portaobjetos se montaron utilizando medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las imágenes se obtuvieron en un Axioplan 2 de formación de imágenes (Zeiss, Oberkochen, Alemania) con software AxioVision (Zeiss). Las imágenes utilizadas para la comparación de las diferentes células y /o tratamientos fueron adquiridos con los mismos ajustes del instrumento y los tiempos de exposición y se procesaron de manera similar. Se contó el número de CD133-, Oct4-, y las células de IGF1R-positivo fosforilados; la proporción de células positivas se calculó en cinco campos para cada experimento.
Esfera ensayo de formación de
cultivos en suspensión de una sola célula se prepararon a densidades de 2,5 × 10
3 células por pocillo en medio libre de suero DMEM /F12 (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con comercial B27 mezcla hormonal (Gibco), EGF (20 ng /mL; Gibco), FGF (20 ng /mL; Invitrogen), y heparina ( 2 mg /ml), y se sembraron en placas de 6 pocillos de unión ultrabaja (Corning, Corning, NY, USA). células parentales y GRPs PC9 se incubaron en condiciones de normoxia, mientras que los GRPs PC9 hipóxicas se incubaron en condiciones de hipoxia. El medio de cultivo fue reemplazado cada 3 días; el número y tamaño de las esferas se registraron y se realizaron análisis de inmunofluorescencia de 7 días después del inicio del período de cultivo [23].
ARN de interferencia
Los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) focalización IGF1 ( Seleccione el sigilo RNAi siRNA) fueron sintetizados por Invitrogen encargo. Un control negativo también se adquirió de Invitrogen. células PC9 o HCC827 se transfectaron con 2 siRNAs específicas diferentes y 1 de control no específica usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las células se separaron y se diluyeron en medio de crecimiento completo sin antibióticos y después en placas en cada uno de los pozos. RNAi dúplex y Lipofectamine RNAiMAX se mezclaron en Opti-MEM®I (Gibco) medio reducido de suero y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. complejos de RNAi duplex-Lipofectamine ™ RNAiMAX se añadieron a los pocillos que contienen células. Las células se incubaron durante 48 horas a 37 ° C
Las secuencias de siRNA contra el IGF1 fueron los siguientes:.
IGF1#1:5'-ACACCAUGUCCUCCUCGCAUCUCUU-3
'
IGF1#2:5'-UGCUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUAA-3 '
Colonia Ensayo de inhibición
PC9 células (2 × 10
5) o HCC827 células (4 × 10
5) se sembraron en placas de 10 cm y se dejaron adherir durante 24 h. Las células fueron incubadas con gefitinib 1 M o 2 M, y con o sin 0,01 M, 0,1 M, o 1 M AEW541 en condiciones hipóxicas durante 18 días para las células PC9 o 11 días para HCC827 células. Después de la incubación, se contaron los números de colonias.
En vivo
tumorigenicidad Estudio
/Shi-SCID /IL-2Rcnull (NOG) los ratones NOD (7-semana- edad, sexo femenino) se adquirieron en el Instituto central de Animales experimentales (Kanagawa, Japón). Todos los ratones fueron enviados a la Universidad Juntendo y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Los animales fueron alojados en una habitación a temperatura controlada (25 ° C), humedad e iluminación (12 h de luz /oscuridad ciclo).
Ad libitum
acceso a los alimentos y TAP se permitió agua durante todo el período de estudio. Para evaluar la
in vivo
potencial tumorigénico, 1 × 10 células o 1 × 10
2 células de las células parentales PC9 y normoxia y GRPs PC9 hipóxicas se mezclaron con Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) y se inyectaron en ambos flancos de los ratones NOG. La formación de tumores se evaluó 22-50 días después de la inyección.
Ética
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices fundamentales para la correcta realización de experimentos con animales y actividades afines en instituciones académicas de investigación bajo la jurisdicción del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (Nota N ° 71, 2006) y fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Juntendo con la aprobación Nº 240182.
Análisis estadístico
Los valores fueron comparados utilizando de Student de dos colas
t-test
. Para comparar varios grupos, se aplicó un análisis de una sola vía de la prueba de varianza (ANOVA). El análisis estadístico de tamaño de la esfera se realizó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Las diferencias entre las medias se consideraron estadísticamente significativas cuando p. & Lt; 0,05
Resultados
Aislamiento y análisis de expresión génica de gefitinib resistente persisters (GRPs) derivado de CPNM líneas celulares que albergan una Activación
La mutación de EGFR
La línea de células PC9 NSCLC, que lleva un activador
EGFR
mutación, se trató con 1 M gefitinib. Como se describe en un informe anterior [2], una pequeña fracción de células viables podría sobrevivir y permanecer 7 días más tarde, mientras que la mayoría de las células habían muerto a los pocos días (Figura 1B). Nos referimos a estas células como persisters gefitinib resistente (GRPs). Aunque GRP eran extremadamente quiescente, GRP reanudó la proliferación bajo la alta concentración de gefitinib (Figura 1C) y, finalmente, mostró la proliferación normal (Figura 1D). Una población análoga de GRP se detectó en la otra línea celular de NSCLC probado, HCC827 que alberga un sensible
EGFR
mutación, mediante el tratamiento con gefitinib 1 M (datos no mostrados).
En primer lugar, 2 × 10
5 células PC9 se sembraron en placas de 10 cm y se dejaron adherirse durante 24 h (a). Las células se trataron a continuación con 1 M gefitinib. gefitinib que contiene el medio fresco se reemplazó cada 3 días. Siete días después de la exposición gefitinib, una pequeña fracción de células viables se mantuvo (B), se reanuda la proliferación de 18 días después (C), y continuaron proliferando incluso 30 días después (D). A. Representante imagen microscópica de las células PC9 parentales. B, C, D. imágenes representativas de GRP PC9 expuesto a 1 M gefitinib durante 7, 18, y fueron fotografiados 30 días, respectivamente.
La identidad genética de la GRP con las células parentales fueron confirmados usando un análisis basado en PCR (GenomeLab humano STR conjunto de cebadores de Beckman Coulter) que interroga a un conjunto de 12 repeticiones en tándem cortas. Análisis de ADN genómicos a partir de células y GRPs de PC9 parentales y HCC827 células se muestra en la Figura S1 en la información S1. STR perfiles de las células de los padres y GRPs son iguales. Además, GRP de PC9 y HCC827 células conservan la
EGFR
exón 19 mutación de deleción (ΔE746-A750), según la evaluación de la secuenciación directa (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos hallazgos confirman que los GRPs no surgió de las células contaminantes. Ni el
EGFR T790M
mutación ni
MET
amplificación de genes se observó en GRP, tanto en el PC9 y HCC827 células (datos no mostrados). La tirosina quinasa Src no se activó en los GRPs de ambos PC9 y HCC827 células en comparación con las células parentales no tratados (figura S2 S1 en la información). EGFR y HER3 se activan en las células PC9 y HCC827 de los padres, sino expresiones se suprimieron notablemente en los GRP de ambas líneas celulares (Figura S2 en la información S1).
Para identificar el mecanismo subyacente a la resistencia a gefitinib en nuestro modelo de celular, primero analiza la expresión génica en células de los padres y GRPs utilizando qPCR. El pulmón putativo CSC marcador CD133 fue altamente expresado en GRP en PC9 y HCC827 células (Figura 2A), lo que sugiere un fenotipo stemness. A fin de determinar si los GRPs podrían revelar las características de células madre cancerosas en nuestros modelos de células, se evaluó la expresión de los genes que regulan y mantienen el fenotipo de células madre. Curiosamente, la expresión de genes de Oct4, Sox2, y Nanog, que también se sabe que están implicados en el ratón reprogramación o células somáticas humanas a las células madre indiferenciadas, pluripotentes, se incrementaron significativamente en GRP en células PC9, mostrando incrementos de 3,4 veces, 5,4 -fold, y 6,9 veces, respectivamente, sobre las células PC9 parentales (Figura 2A). Además, la expresión de CXCR4 y ALDH1A1, también demostrado que se asocia con el fenotipo CSC, se upregulated (Figura 2A). Se obtuvieron resultados similares para HCC827 GRP (Figura 2A). Otros genes de células madre conocidas como ABCG2, Bmi-1 y CD117 (c-kit), no estaban regulados por incremento en GRP (datos no mostrados).
A. RT-PCR cuantitativa se realizó con cebadores específicos para CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, y ALDH1A1, que son genes stemness en PC9 o HCC827 células parentales y GRPs. B. RT-PCR cuantitativa se realizó con cebadores específicos para IGF1 y IGF1R en PC9 o HCC827 células parentales y GRPs. Los datos se normalizaron a la expresión de actina. * P & lt; 0,01, ** p & lt; 0,001, *** p & lt;.
0,0001
Un informe anterior también mostró que era IGF1R fosforilada y activada en las células EGFR-TKI-tolerantes en las células y que PC9 un inhibidor de IGF1R, AEW541, podría prevenir la aparición de estas células tolerantes [2]. Se examinó la expresión de IGF1 y IGF1R mediante qPCR en nuestro modelo celular. expresión IGF1 se upregulated dramáticamente en PC9 GRP en comparación con células parentales PC9, que muestran un aumento de 49,8 veces (Figura 2B). expresión de IGF1R se incrementó ligeramente en GRP (Figura 2B). Se obtuvieron resultados similares para los GRPs en HCC827 células (Figura 2B).
En su conjunto, estos hallazgos sugieren que la pequeña población de células de NSCLC que fueron altamente enriquecido para la expresión de genes de troncalidad y IGF1 sobrevivió y se podrían reanudar la proliferación en virtud tratamiento de una alta concentración de gefitinib.
Capacidad y tumorigenicidad de GRP se upregulated y formación de esferas por GRP aumentó después de la exposición a hipóxicas Condiciones
a fin de evaluar la troncalidad de GRP, esfera- de formación de esferas formando ensayos que reflejan la actividad de auto-renovación y
in vivo se llevaron a cabo estudios de carcinogénesis
. La capacidad para formar esferas fue significativamente mayor en PC9 GRP que en las células parentales (figura 3A). Es importante destacar que la hipoxia aumentó notablemente el número de esferas de PC9 GRP (Figura 3A). tamaño de la esfera de PC9 GRP en condiciones de hipoxia fue significativamente mayor que la de las células parentales (Figura 3B). resultados de inmunofluorescencia mostraron que las esferas de GRP fueron positivos para CD133, Oct4 y IGF1R fosforilada (Figura 3C). Además, se inyectó 1 x 10 células o 1 × 10
2 células de células PC9 de los padres y de normoxia y GRPs hipóxicas en ambos flancos de los ratones NOG y comparado el potencial tumorigénico
in vivo
. la incidencia de tumores de normoxia e hipoxia GRP en los ratones eran más altos que los de las células parentales (tabla 1). Notablemente, GRP normoxic hipóxica y forman tumores en dos y cinco de 16 ratones NOG en 1 x 10 células /inyección, respectivamente, aunque las células parentales no forman tumores (Tabla 1). La diferencia en la formación de tumores entre el grupo celular parental y el grupo GRP hipóxicas con la inyección de 1 x 10 células fue estadísticamente significativa (* p = 0,040). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que los GRPs enriquecidos para marcadores stemness tienen rasgos característicos del fenotipo de células madre y que el microambiente hipóxico upregulated y mantiene las propiedades de células madre de GRP, tales como la capacidad de formación de esferas y tumorigenicidad.
células PC9 parentales, GRP, y GRPs hipóxicas se prepararon a densidades de 2,5 × 10
3 células por 2 ml por pocillo en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento y se sembraron en placas de 6 pocillos de fijación ultra-bajas. células parentales y GRPs PC9 se incubaron en condiciones de normoxia, mientras GRP PC9 hipóxicas fueron cultivadas bajo condiciones de hipoxia. El medio de cultivo se alimentó cada 3 días. El número y tamaño de las esferas se registraron y de inmunofluorescencia se llevó a cabo 7 días después del comienzo del período de cultivo. Esferas se fijaron y se incubaron con anticuerpos primarios contra CD133, Oct4, o IGF1R fosforilada (pIGF1R), y luego con el anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (rojo) o Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de conejo (verde) . Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Las imágenes se obtuvieron en un sistema de imágenes Axioplan 2 con software AxioVision. A. El número de esferas fue significativamente mayor en comparación con el PC9 GRP en células de sus padres, y se incrementó aún más en los GRPs hipóxicas PC9. * P & lt; 0,01,#p & lt; 0,05. tamaño B. Esfera de PC9 GRP hipóxicas fue significativamente mayor que la de las células parentales.#P & lt; 0,05. C. imágenes de inmunofluorescencia de las células de control de PC9 (izquierda) y esferas de GRP (derecha) para CD133, Oct4 y pIGF1R.
Población de CD133- y GRPs Oct4-positivos fueron: Aumento bajo hipóxicas condiciones
Para investigar el papel de la hipoxia sobre la generación y persistencia de la población de células madre resistentes a gefitinib, se evaluó CD133- y GRPs Oct4-positivos en condiciones de normoxia y condiciones de hipoxia mediante inmunofluorescencia. Como se muestra en la figura 4A y 4B, la hipoxia aumentó significativamente la población de CD133- y GRP Oct4-positivas en PC9 y HCC827 células.
A, B. PC9 o HCC827 células, que crecen en portaobjetos de cámara Lab-Tek con o sin 1 o 2 gefitinib mu M y en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia durante 72 h, se fijaron, y se incubaron con los anticuerpos primarios contra CD133 (A) y Oct4 (B), y luego con el anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 594 de cabra anti-ratón IgG (rojo). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Las imágenes se obtuvieron en un sistema de imágenes Axioplan 2 con software AxioVision. Las imágenes utilizadas para comparar las células parentales, GRP, y GRPs hipóxicas fueron adquiridos utilizando los mismos ajustes del instrumento y los tiempos de exposición y se procesaron de manera similar. Los números de CD133 y células Oct4-positivas se contaron, y la relación de estas células se calculó en cinco campos de cada experimento. ** P & lt; 0,001, * p & lt; 0,01,#p. & Lt; 0,05
IGF1R se activó el GRP bajo condiciones hipóxicas Condiciones y Derribo de IGF1 Disminución de la Población de CD133- y GRPs hipóxicas Oct4-positivos
Para investigar el efecto de la hipoxia sobre la activación de IGF1R, hemos examinado la expresión génica de IGF1 en GRP por qPCR, así como la fosforilación de IGF1R en GRP utilizando inmunofluorescencia en condiciones de normoxia y condiciones de hipoxia. Como se muestra en la Figura 5A, la expresión de mRNA IGF1 fue mucho mayor en PC9 GRP que en las células parentales y PC9 se upregulated por la exposición a condiciones de hipoxia. Es importante destacar que, IGF1R fosforilada se expresó en PC9 GRP, y la exposición a la hipoxia marcadamente upregulated la población de fosforilados GRP PC9 que expresan IGF1R (Figura 5B).
A. RT-PCR cuantitativa se realizó con cebadores específicos para IGF1 en PC9 o HCC827 células parentales, GRP, y GRPs hipóxicas. Los datos se normalizaron a la expresión de actina. ** P & lt; 0,001. PC9 células B., cultivadas en portaobjetos de cámara Lab-Tek con o sin 1 mM gefitinib y en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia durante 72 h, fijos, y se incubaron con los anticuerpos primarios contra IGF1R fosforilada (pIGF1R) y después con anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de conejo (verde). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Las imágenes se obtuvieron usando un sistema de formación de imágenes Axioplan 2 con el software AxioVision. Imágenes utilizaron para comparar las células parentales PC9, GRP y GRP hipóxicas fueron adquiridos con los mismos ajustes del instrumento y tiempos de exposición, y se procesaron de manera similar. Se contó el número de células pIGF1R-positivas, y la relación de estas células se calculó en cinco campos de cada experimento. ** P & lt; 0,001. C. expresión de IGF1 fue derribado en el PC9 o HCC827 GRP de hipoxia mediante el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA) en portaobjetos de cámara Lab-Tek. Después se realizó la tinción de inmunofluorescencia para pIGF1R, CD133, o Oct4. Se utilizaron dos siRNAs específicos y un control no específico. Los números de pIGF1R-, CD133- y células Oct4-positivas se contaron, y la relación de estas células se calculó en cinco campos para cada experimento. ** P & lt; 0,001, * p & lt;.
0,01
Para aclarar la importancia biológica de IGF-1 en la resistencia a gefitinib en nuestro modelo de células hipóxicas, derribaron la expresión de IGF-1 en los GRPs hipóxicas de PC9 y HCC827 células usando dos diferentes siRNAs específicos (# 1 y#2, Figura S3 Información S1). Como se muestra en la Figura 5C, la caída de IGF1 redujo significativamente GRP IGF1R-expresión de fosforilados, y la disminución de CD133- y GRP Oct4-positivos bajo condiciones de hipoxia. Estos hallazgos sugieren que IGF1 juega un papel en la activación de IGF1R y el mantenimiento de células madre cancerosas gefitinib-resistente.
hipoxia regula la expresión de IGF1 a través HIF1α, y la inhibición de HIF1α o IGF1R Disminución CD133- y GRP Oct4-positivos en condiciones de hipoxia
Para investigar más a fondo los efectos de la hipoxia en la regulación al alza de IGF1 y la activación de IGF1R, que downregulated la expresión del factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) en GRP hipóxicas utilizando el inhibidor específico HIF1α YC-1. El tratamiento con YC-1 inhibió la expresión HIF1α significativamente tanto en PC9 y HCC827 células bajo la hipoxia en una forma dependiente de la dosis (Figura S4 en Información S1). Como se muestra en la Figura 6A, la inhibición de la HIF1α por tratamiento YC-1 también suprimió la expresión de IGF1 en GRP hipóxicas, y redujo significativamente la fosforilación IGF1R en GRP en virtud de la hipoxia. Por otra parte, YC-1 tratamiento disminuyó significativamente la población de CD133- y Oct4- GRP hipóxicas positivos. Finalmente, el tratamiento con el inhibidor de IGF1R AEW541 disminuyó significativamente la población de CD133- y GRP Oct4-positivos de una manera dependiente de la dosis después de la exposición gefitinib en condiciones de hipoxia (Figura 6B). Además, el número de colonias que constan de GRP se suprimió significativamente por AEW541 en condiciones de hipoxia (Figura 6C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la hipoxia regula la expresión de IGF1 a través HIF1α, y que IGF1 upregulated induce la activación de IGF1R y aumenta las células madre cancerosas resistentes a gefitinib en
EGFR
mutación positiva de células de NSCLC bajo la hipoxia.
A. HIF1α expresión fue suprimida en PC9 o HCC827 GRP hipóxicas por tratamiento con 50 m, 100 m, y 200 mM YC-1 en portaobjetos de cámara Lab-Tek. La tinción de inmunofluorescencia para IGF1, se realiza entonces IGF1R fosforilada (pIGF1R) CD133, y Oct4. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4.