Extracto
Claro células de cáncer de ovario es una histotype cáncer de ovario epitelial que es menos sensible a la quimioterapia y lleva peor pronóstico que histotypes serosas y endometrioide. A pesar de esto, los pacientes con estos tumores se tratan de una manera similar a todos los otros tipos de cáncer de ovario. el análisis genómico anterior ha sugerido que los cánceres de células claras representan un subtipo de tumor único. Aquí hemos generado la primera expresión genómica conjunto de perfiles utilizando componente epitelial de los cánceres ováricos de células claras y las muestras de la superficie del ovario normales aisladas por microdisección de captura por láser. Todos los arreglos fueron analizados utilizando el software ArrayTools BRB y PathwayStudio para identificar las vías de señalización. vías identificadas validaron utilizando, líneas celulares de cáncer de células serosas claras y la tecnología del RNAi.
in vivo
validaciones realizadas utilizando un modelo de ratón ortotópico y encapsulado en liposomas ARNsi. de células claras derivados de los pacientes y los tumores de ovario seroso se injertaron bajo la cápsula renal de ratones NOD-SCID para evaluar el potencial terapéutico de la vía identificado. Se identificaron las principales vías activadas en células claras que involucran en el crecimiento de células hipóxicas, la angiogénesis y el metabolismo de la glucosa no se ve en otros histotypes. Desmontables de genes clave en estas vías sensibilizadas líneas claras de células de ovario de células de cáncer a la hipoxia privación /glucosa.
in vivo
experimentos con tumores de pacientes derivada demuestran que los tumores de células claras son exquisitamente sensibles a la terapia antiangiogénesis (es decir sunitinib) en comparación con los tumores serosos. Hemos generado una firma específica histotype gen asociado con el cáncer de ovario de células claras que identifica importantes vías activadas crítica por sus características clínico-patológicas. Estos resultados proporcionan una base racional para un tratamiento radicalmente diferente en los pacientes de células claras de ovario
Visto:. Stany MP, Vathipadiekal V, L Ozbun, Piedra RL, Mok SC, Xue H, et al. (2011) La identificación de nuevas dianas terapéuticas en microdissected células claras de ovario. PLoS ONE 6 (7): e21121. doi: 10.1371 /journal.pone.0021121
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: February 2, 2011; Aceptado: 19-may de 2011; Publicado: 6 Julio, 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud (MJB) y OvCaRe (una iniciativa del hospital general de Vancouver y la Fundación Universidad de BC hospital y la BC Cancer Foundation) (YZW), la BC Cancer Foundation y Pfizer Canadá (iniciada por el investigador del proyecto, LES y YZW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Pfizer Canadá es una compañía de salud. LES y YZW recibieron financiación de proyectos iniciados por el investigador de Pfizer Canadá. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Claro células de cáncer de ovario (CCOC) fue descrito originalmente como una ovarii mesonefroma en 1939 por Schiller debido a su apariencia similar al carcinoma de células renales [1]. Estudios adicionales desde entonces, ha proporcionado pruebas de que estos tumores son de origen ovárico [2], [3], [4], [5], [6] CCOC representa 4-14% de todos los cánceres ováricos epiteliales y su comportamiento clínico difiere de la de los otros histotypes epiteliales [4], [6], [7]. Los pacientes con estadio I CCOC tienen un riesgo un 27% de recurrencia [8] con unas tasas de supervivencia de cinco años para los de 60% en comparación con el 80%, para los tumores serosos [8]. Los pacientes con enfermedad en etapa tardía también tienen un peor pronóstico en comparación con los pacientes con cáncer de ovario seroso etapa avanzada [8]. Esto probablemente refleja la tasa más baja de CCOC de respuesta a la quimioterapia tradicional basada en taxano platino /, informó que entre el 11-45% durante el tratamiento de primera línea [8], [9]. CCOC pacientes también tienen mayores tasas de eventos tromboembólicos en comparación con pacientes con otras histotypes cáncer epitelial de ovario [10].
células de vista histológico, CCOC son "claras", debido al alto contenido de glucógeno citoplasmática que es un artefacto de H &erio; E tinción [11], [12]. CCOC se ha encontrado que tienen similitud ultraestructural para borrar el carcinoma de células de la vagina y endometrio. Esta similitud ultraestructural se traslada a la similitud genética también. Zorn et al. Se han encontrado perfiles de expresión de genes similares de tumores de células claras de ovario, endometrio, riñón y con el uso de una matriz de 11.000 probeset [13]. Esta superposición genética, sin embargo, no se extendía a la comparación de histotypes serosas y endometrioide de origen ovario y de endometrio. Otro perfil de expresión génica de CCOC utilizando una matriz de conjuntos de sonda 7129 demostró ser muy distinto de los otros histotypes [14]. Estos estudios sugieren que existen vías similares que conducen a la histotype de células claras, independientemente del órgano de origen.
En este estudio, se presentan los resultados del primer conjunto de perfiles de expresión del genoma de muestras CCOC microdissected. Gene ontología y la vía de análisis identificado principales vías activadas implicadas en el crecimiento de hipoxia celular, la angiogénesis, y el metabolismo de la glucosa. La hipótesis de que estas vías pueden proporcionar un mecanismo para la naturaleza agresiva de CCOC clínica. Se demuestra que las líneas celulares de cáncer de células claras sobreviven mejor que las líneas de células serosas en condiciones de hipoxia y las condiciones de glucosa privados y esto es en parte debido a estas vías activadas implican HIF1 α y enolasa.
in vivo
experimentos utilizando tejidos de pacientes derivada demuestran que xenoinjertos de tumores de células claras son exquisitamente sensibles a la terapia antiangiogénesis (sunitinib) en comparación con los tumores serosos. La terapia de combinación de sunitinib y RNAi para HIF1α y enolasa demuestra la actividad sinérgica contra el tumor. Estos resultados proporcionan una base racional para la terapia específica en estos pacientes.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El cáncer de ovario muestras de tejido se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de los pacientes sometidos bilateral salpingooforectomía en el hospital general de Vancouver siguiendo un protocolo aprobado por la Universidad de clínica Junta de Ética de Investigación de la Columbia británica, Canadá. Las muestras utilizadas para el perfilado se recogieron bajo los protocolos aprobados por las juntas de revisión institucional de la Brigham y Hospital de Mujeres (Boston, MA, EE.UU.) y se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de los pacientes. cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y la aprobación por parte de la Universidad de British Columbia - Junta Ética de Investigación British Columbia Cancer Agency (UBC BCCA REB) (Número: H04-60131) y el MD Anderson Cancer Center Institucional de Cuidado y Uso de Animales Comité, EE.UU. (Número IACUC: 12-02-18233).
las muestras de tejido, la microdisección, el aislamiento de ARN y la amplificación
Diez especímenes de cáncer de ovario de células claras se obtuvieron a partir de los tumores primarios de no tratados previamente pacientes con cáncer de ovario en el hospital Brigham y de Mujeres (Boston, MA). Un conjunto de 10 epitelio superficial del ovario (OSE) especímenes normales cytobrushing también se obtuvo de los ovarios normales de los pacientes en el momento de la cirugía por indicaciones benignas. Las secciones congeladas (7 m) se fijaron en portaobjetos de marco (Leica, Wetzlar, Alemania), fijados en alcohol al 70% durante 30 segundos, teñidos de verde de metilo al 1%, se enjuagaron en agua desionizada y se secaron al aire. Microdisección se realizó usando un microscopio láser microdissecting LMD MD (Leica). Las células tumorales (~5,000) se diseccionaron para cada caso. Se aisló el RNA, se extrajo y se purificó como se describe anteriormente [15]. Con el fin de generar suficiente ARNc para el análisis de microarrays, se utilizó un protocolo de amplificación de dos tiempos (Affymetrix) que se ha descrito anteriormente [16].
Microarray análisis
Todos los datos de la matriz es la información mínima sobre un Microarray Experiment (MIAME) conformes y los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME (GEO, el Número de Acceso: GSE29450)
la normalización de datos
normalización global en un valor objetivo de. 500 se aplicó a todos los 20 de las matrices planteados bajo de gene Chip de software operativo (Affymetrix). Los datos normalizados se cargan en Base de Datos de análisis de microarrays del Instituto Nacional del Cáncer (MADB) para la detección y el control de calidad de colación antes de los análisis posteriores (http://nciarray.nci.nih.gov/index.shtml). Rama de Investigación Biométrica (BRB) ArrayTools software de la versión 3.2.2 desarrollado por los Dres. Richard Simon y Amy Peng Lam de la Rama de Investigación Biométrica del Instituto Nacional del Cáncer se utilizó para filtrar y completar el análisis estadístico de los datos de la matriz. BRB-ArrayTools es un multifuncional Excel add-in que contiene utilidades para el procesamiento y análisis de datos de microarrays utilizando el entorno de la versión R 2.0.1 (Core Development Team R, 2004). La hibridación de control de conjuntos de sonda y los conjuntos de sonda marcados como ausente en α1 = 0,05 o marginal (M) en α2 = 0,065 fueron excluidos. Además, se evaluaron sólo aquellas transcripciones presentes en más del 50% de las matrices y que muestran una variación en el percentil 50 superior.
Comparación de clase, la ontología de genes, y la vía de análisis.
permutación de prueba multivariante en BRB ArrayTools se utilizó para identificar los genes expresados diferencialmente. Se obtuvo 10% de falsos positivos en una confianza del 95% después de un total de 2.000 permutaciones; una lista de probesets que contienen. & lt La expresión diferencial se consideró significativo un valor de p-valor de & lt; 0,001. Una variación aleatoria
t
prueba y la evaluación global se realizó como se ha descrito previamente [16].
Con el fin de identificar determinadas categorías funcionales de los genes que son altamente enriquecido en CCOC, identificamos la ontología de genes ( GO) categorías que fueron estadísticamente significativas en la lista de genes regulados diferencialmente. Se realizó una prueba de Hotelling T-cuadrado para identificar las categorías importantes GO. Con el fin de identificar las vías de señalización implicadas en CCOC, la lista de genes que se generó a partir del análisis de microarrays se ha importado al software de PathwayStudio (Ariadna Inc, Rockville, MD).
RT-PCR cuantitativa
cuantitativa en tiempo real PCR se realizó durante las 10 muestras de células claras de ovario y cáncer de las 10 muestras de OSE. 50 ng del producto de doble amplificado se utiliza a partir de los 20 muestras utilizando conjuntos de cebadores específicos para 12 genes seleccionados y los genes de mantenimiento de GAPDH, GUSB, y cyclophillin. Un Sistema de iCycler iQ Real-Time PCR de detección (Bio-Rad, Hercules, CA) se utilizó en conjunción con el One-Step QRT-PCR con el kit SYBR Green (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA) de acuerdo con se describe anteriormente las condiciones del ciclo [17]. Para el cálculo de la expresión relativa de cada gen, se utilizó el 2
método -ΔΔCT promediando los C
valores de T para los tres genes de limpieza.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
las líneas de células claras de ovario de células de cáncer humano ES-2, TOV21G, y RMG1, y las líneas de células serosas Ovča 420 y 432 Ovča se mantuvieron en una mezcla 01:01 de medio 199 (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA) y medio 105 (Sigma, St. Louis, MO), complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de L-glutamina. Las líneas celulares de cáncer de ovario seroso humanos SK-OV-3 y OVCAR-3 se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies) suplementado con 10% de FBS y 1% de L-glutamina. 429 células Caov3 y Ovča se mantuvieron en DMEM (Invitrogen Life Technologies) suplementado con 10% de FBS y 1% de L-glutamina. ES-2, las líneas celulares TOV21G, SKOV3, OVCAR3 Caov3 y RMG1 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection y colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación. OVCAR 420, 432 y OVCAR OVCA 429 se obtuvieron del Laboratorio de Oncología Ginecológica del Hospital Brigham y de la Mujer [18].
condiciones de privación de Hipoxia /glucosa
Las células de células claras y orígenes de ovario seroso se sembraron y se coloca en las condiciones de normoxia con DMEM, 10% FBS, 1% de L-glutamina o hipoxia con DMEM libre de glucosa, 10% de FBS, 1% de L-glutamina (Invitrogen Life Technologies). La hipoxia fue producido por el lavado de una incubadora (Thermo Forma Series II, Thermo Fischer Scientific, Inc., Waltham, MA) con nitrógeno para conseguir una mezcla de 1% de O
2, 5% de CO
2, y 94% nitrógeno. La incubadora se mantiene a 37 ° C.
Ensayos de proliferación celular
El cáncer de líneas celulares fueron sembradas en placas de 96 pocillos en 8 repeticiones (ES-2, TOV21G, Ovča 420, SK- OV-3, OVCAR-3, OVCA-420, OVCA-429: 5 × 10
2 células por pocillo, Caov3, OVCA-432, RMG1: 1 × 10
3 células /pocillo) y se coloca en cualquiera condiciones de normoxia con medios que contienen glucosa normal (NN) o hipoxia privación /glucosa (HG) para 24, 48, y 72 horas. Después de estos períodos, los números relativos de células viables se midieron usando el fluorométrico, la célula basada en resazurina ensayo de valoración azul (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante en 560
Ex /590
Em nm en un Victor3 contador de multi-etiqueta (PerkinElmer, Alemania). tiempos de duplicación de cada línea celular en cada condición se calcularon usando Prism 4.02 Software (GraphPad, San Diego, EE.UU.). Doble cambio en el tiempo de privación hipoxia /glucosa en comparación con las condiciones normales de duplicación y se calculó un promedio para cada línea celular más de dos experimentos. media veces el cambio se calculó para las líneas de células serosas y líneas de células claras y se compara.
ciclo de las células de ensayo
El estado del ciclo celular de las células ES-2 y OVCA 420 se compararon en las condiciones de normoxia e hipoxia /privación de glucosa por citometría de flujo. En pocas palabras, el 7,5 × 10
4 ES2 células y 2,0 x 10
5 OVCA420 células fueron sembradas en 60 mm
2 placas por triplicado, y se dejó incubar durante la noche. El medio se cambió en el día siguiente, y se colocaron las células en las condiciones anteriores. Después de 48 horas de incubación (normoxia a 37 ° C o hipoxia privación /glucosa a 37 ° C), se recogieron los medios de comunicación y las células adherentes y se centrifuga a 1500 χg durante 5 minutos. El sedimento se lavó en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugó a 1500 χg durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en 200 l de PBS frío. se añadieron 2 ml de helado de etanol 70%, y las células se incubaron en hielo durante 30 minutos para permeabilizar. Las células se centrifugaron a 1500 χg durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y se utilizó 900 l de PBS a temperatura ambiente resuspender las células. (/Ml, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ 10 mg) y 10 l de yoduro de propidio se añadieron (1 mg /ml, Sigma) 100 l de RNAsa A, y los tubos se incubaron a continuación a 37 ° C durante 30 minutos , evitando la luz. contenido de ADN se determinaron por citometría de flujo (FACSCalibur, Becton, Dickinson, and Company, Franklin Lakes, NJ) y los histogramas de contenido de ADN se analizaron utilizando FlowJo 7,2 (árbol de la estrella, Inc., Ashland, OR) para caracterizar las fracciones de población en cada fase del ciclo celular.
caspasa-3 ensayo
las mediciones directas de la actividad de caspasa 3 se hicieron usando un kit fluorométrico-caspasa-3 (Invitrogen Life Technologies). En pocas palabras, 2,0 × 10
5 OVCA420 Las células fueron sembradas en 60 mm
2 placas y se dejó incubar durante la noche. En el Día 0, se reemplazó el medio y las placas se colocaron en las condiciones de normoxia /glucosa normal o hipoxia /privación de glucosa. Las células se recogieron a las 24, 48, y 72 horas. Las células se recogieron, se sedimentaron, se resuspendieron en 50 l de tampón de lisis de la célula refrigerada, y se incubaron en hielo durante 10 minutos. La concentración de proteína se determinó mediante ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Se añadieron 50 l de 2 x tampón de reacción y DTT 10 mM a cada alícuota de 50 l de lisado celular. 5 l de sustrato 1 mM DEVD-AFC después se añadieron a cada muestra, evitando la luz. Las muestras se incubaron a continuación a 37 ° C durante 1 hora en la oscuridad. Se utilizaron células MEF (60 mm de placa, 80% confluentes) tratados con 10 l de cicloheximida y 30 ng TNFa como un control positivo. La fluorescencia se evaluó a continuación, en un entorno multi-etiqueta de contador Victor3 (PerkinElmer, Alemania) con 405
Ex /535 filtros
Em nm. El aumento veces en la actividad Casase-3 se determinó por fluorescencia relativa por g de proteína.
Necrosis ensayo
Con el fin de ensayar la presencia de necrosis, la CytoTox-ONE ™ ensayo de integridad de la membrana homogénea se utilizó como se recomienda por el fabricante (Promega). Este ensayo mide la liberación de LDH de las células con membranas dañadas. Brevemente, 5 × 10
3 OVCA-420 células se sembraron en una placa de 96 pocillos por triplicado. El medio se cambió el día siguiente, y se colocaron las células en las condiciones de o bien normal de oxígeno /glucosa normal o hipoxia privación /glucosa. 48 horas más tarde, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a 22 ° C. Con el fin de generar un control de la liberación máxima de LDH, se añadieron 2 l de solución de lisis a los pocillos de control colocados en oxígeno a la glucosa normal /normal. se añadieron 100 l de CytoTox-ONE ™ reactivo a cada pocillo. Después de 10 minutos de incubación a 22 ° C, se añadieron 50 l de solución de parada a cada pocillo. Las placas se agitaron durante 10 segundos. De cada pocillo, 100 l se transfirió a una placa opaca y la fluorescencia se registró a 560
Ex /590
Em nm en un multi-etiqueta de contador Victor3 (PerkinElmer, Alemania). Después de restar el fondo medio de cultivo, el porcentaje de citotoxicidad se calculó mediante la división de la fluorescencia experimental por la fluorescencia máxima de LDH Release.
El tratamiento de líneas celulares con oligonucleótidos de ARNsi
Desmontables de α HIF1 y enolasa 1 se realizó utilizando oligonucleótidos siRNA (Qiagen, Inc). Un protocolo de transfección inversa se realizó usando Oligofectamine (Invitrogen Life Technologies, Inc) según lo recomendado por el fabricante en un formato de placa de 96 pocillos. Para cada pocillo, 50 nM de ARNsi y 0,5 l de reactivo de transfección Oligofectamine se diluyó en 50 l de DMEM libre de suero y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. ES-2 células, células TOV-21G, y células RMG-1 se sembraron en una placa de 96 pocillos a 1,0 × 10
4 células, 2,0 × 10
4 células, y 5,0 × 10
4 células por pocillo, respectivamente. Revueltos siRNA se utilizó como control negativo. 48 horas después de la transfección, el medio se reemplazó con DMEM libre de glucosa, y se colocaron las células en las condiciones de hipoxia. El crecimiento se evaluó a las 0 y 24 horas por la célula ensayo de valoración azul (Promega). Los ensayos de proliferación de líneas celulares de ES2 y TOV21G se realizaron con 75 nM siRNA para el 24, 48 y 72 horas después de la transfección.
En vivo
reducción en ENO1 o HIF1 α utilizando siRNA-DOPC con o sin sunitinib inhibe la progresión del tumor CCOC en ratones desnudos atímicos
Femenino ratones desnudos atímicos fueron adquiridos de la Instituto Nacional del cáncer, Cancer Research Center Frederick y Desarrollo (Frederick, MD). se tripsinizaron células ES2, se lavaron y se resuspendieron en solución salina equilibrada de Hanks (Gibco, Carlsbad, CA) y se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones (1 × 10
6 células /ratón). Con el fin de regular a la baja enolasa y HIF1 α in vivo, se empleó el respectivo siRNA. No la focalización, la secuencia no específica 5'-ATT TCT CCG AAC GTG TCA CGT-3 'se utilizó como control, mientras que las secuencias específicas de humanos fueron utilizados para enolasa (5'-GCG CAT TGG AGC AGC AGA GGT TTA3') y HIF -1 α (5 'CAG TTG TCA CCA TTA GAA A-3'). Estos siRNAs específicos diana se adquirieron de Sigma-Aldrich y se prepararon como se describe anteriormente [19], [20]. El liofilizado DOPC incorporado siRNA se hidrata con PBS y se inyecta por vía intraperitoneal dos veces por semana siguiendo nuestros protocolos publicados anteriormente [21] en 5,0 mg siRNA /200 ml de suspensión. El mismo volumen de PBS inyectado intraperitoneal se usó como un control.
SU11248 /sunitinib malato (Sutent, Pfizer) se suspendió en la formulación de vehículo de carboximetilcelulosa, que contiene carboximetilcelulosa sódica (0,5% peso /vol), NaCl (1,8% peso /vol), Tween 80 (0,4% peso /vol), alcohol bencílico (0,9% peso /vol), y ósmosis inversa de agua desionizada (añadido al volumen final) y se ajustó a pH 6,0 como se describe anteriormente [22]. la estructura y la actividad de sunitinib han sido previamente informado [23]. alícuotas de drogas se prepararon una vez por semana y se mantuvieron en la oscuridad a 4 ° C. Los ratones se trataron con 40 mg /kg en 200 l de vehículo por sonda una vez al día. alimentación forzada diaria con vehículo solo se utilizó como control. Siete días después de la inyección de células ES2, los ratones se dividieron al azar y se trataron con control, enolasa o HIF1 α siRNA-DOPC ± sunitinib (n = 10 /grupo). El tratamiento se continuó durante 3 semanas, momento en el cual, todos los ratones en el experimento se sacrificaron y se practicó la necropsia, y se recogieron los tumores. El peso del tumor y el recuento de nódulos se registraron. El tejido tumoral se congeló en los medios de temperatura óptima de corte (OCT) para preparar diapositivas congeladas para su posterior tinción con CD31.
La tinción inmunohistoquímica para CD31
La tinción inmunohistoquímica para el antígeno CD31 se realizó en las diapositivas congeladas para evaluar el tumor densidad de los microvasos (MVD). Las láminas fueron fijadas en acetona fría durante 10 minutos. La peroxidasa endógena se bloqueó con 3% de H
2O
2 en metanol y epítopos no específicos se bloquearon con 5% de suero de caballo normal y 1% de suero de cabra normal. Los portaobjetos se incubaron después con anti-ratón CD31 (1:800 dilución, PharMingen San Diego, CA) a 4 grados durante la noche. Después de lavar con PBS, se añadió el anticuerpo secundario conjugado a HRP apropiado en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se desarrollaron con 3, "-diaminobenzidine 3 (DAB) cromógeno (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se contratiñeron con Gil No. 3 hematoxilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). MVD se calculó mediante la visualización de 10 representativos 200 × campos por portaobjetos en cada grupo de tratamiento y contar el número de microvasos por campo. A los microvasos se definió como un lumen abierto con al menos una célula CD31-positivo inmediatamente adyacente a la misma.
efecto diferencial de sunitinib en tumores de cáncer de ovario derivados del paciente trasplantables
Seis a ocho semanas los ratones NOD-SCID hembra de edad fueron criados por el Centro de Investigación del cáncer aC Centro de recursos Animales, BC Cancer Agency, Vancouver, Canadá. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos, en jaulas de filtro-top estériles en bastidores con ventilación de alta eficiencia con aire filtrado de partículas, y recibieron pienso para roedores estéril y agua. muestras de tejido de cáncer de ovario se obtuvieron con el consentimiento informado de los pacientes sometidos a salpingooforectomía bilateral en el Hospital General de Vancouver. En resumen, para desarrollar líneas de tejido de cáncer trasplantables, tejido tumoral fresco se cortó en trozos pequeños y se injerta en el sitio de la cápsula subrenal de los ratones NOD-SCID hembra para el trasplante en serie posterior y la caracterización como se describió anteriormente [24], [25]. Un panel de modelos de xenoinjerto de tejido de cáncer de ovario, es decir, (http://livingtumorlab.com/PDC_Ovarian.html), se utilizó tres líneas serosas tejido de carcinoma (LTL237, 247 y 259) y una línea de tejido de carcinoma de células claras (LTL175).
Para los estudios de eficacia de sunitinib, 96 piezas de tejido (4 x 2 x 1 mm
3) de xenoinjertos de cada línea de tejido tumoral establecida sido injertado bajo cápsula renal de ratones NOD 24-SCID hembra, como antes se describe [25]. Cuando estaban bien establecidos los implantes, alcanzando un volumen promedio de aproximadamente 20 a 50 mm
3 [24], [25], los animales se clasificaron en cuatro grupos (6 ratones /grupo; 2 injertos por riñón). las asignaciones de tratamiento fueron de sunitinib o vehículo inactivo (control negativo). Sunitinib se administró como una suspensión de carboximetilcelulosa 0,5% utilizando una dosis de 40 mg /kg de peso corporal (por vía oral, una vez al día, durante dos semanas) encontrado eficaz para una variedad de modelos de xenoinjertos de ratón, como se describe en otra parte [26]. Los ratones se les proporcionó alimentos y agua
ad libitum Opiniones y un seguimiento diario de los cambios en la salud general y signos de estrés, incluyendo la pérdida de peso corporal, diarrea, cambios en la alimentación /consumo de agua, la apariencia (postura encorvada, los ojos hundidos , dificultad para respirar) y el comportamiento (letargo). Efectos sobre el crecimiento del tumor se evaluaron mediante la medición del volumen del tumor en la necropsia usando calibradores y la fórmula: volumen (mm
3) = 0,52 x longitud x anchura x altura (en mm), como se describe anteriormente [25] y por análisis histoquímico de secciones de tejido de tumores (ver abajo).
Medición de la fosforilación de tirosina de VEGFR2 y PDGFR en xenoinjertos a través de Western Blot
Dentro de 2 h de la última administración de sunitinib en los estudios de eficacia anteriores, xenoinjertos de ratones tratados y de control se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 C para su uso posterior. Los lisados se prepararon por homogeneización de los tejidos con tampón de lisis frío (50 mM HEPES pH 7,5, NaCl 150 mM, 1,5 nM MgCl
2, 10% v /v glicerol, 1% Triton X-100, 1% de ortovanadato de sodio, 2 mM NaF, 2 mg /ml de aprotinina, 2 mg /ml de leupeptina, y 2 mg /ml de pepstatina-A) como se describe en otra parte [26]. Para la inmunoprecipitación, las cantidades de proteína se ajustaron a 500 g. Las proteínas fueron limpieza previa con proteína A-Sepharose (Cat. No. 16-125, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) durante 15 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes (1 ml) se incubaron con el conejo 4 g anti-VEGFR2 (Cat. No. 07-716) o anti-PDGFR (Cat. No. 05-825) anticuerpos (Upstate Biotechnology Inc.) durante 90 min a 4ºC y, después de la adición de 25 l 50% (v /v) de proteína a-Sepharose, se incubaron adicionalmente durante 60 min a 4ºC. Los complejos antígeno-anticuerpo en perlas se lavaron al menos tres veces con tampón de lisis, seguido de la adición de tampón de carga 25 l y hirviendo durante 1 min para la elución de proteínas. Las proteínas se separaron por 5% de gel de SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de PVDF para la detección de la tirosina fosforilado utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón para fosfotirosina (Cat. No. sc-7020, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Las membranas fueron despojados y posteriormente volvieron a sondar para la detección de VEGFR2 total y PDGFRß usando las mismas preparaciones de anticuerpos utilizados para la inmunoprecipitación.
La apoptosis detección
secciones de tejido
parafina embebido (5 m de espesor) fueron examinados por TUNEL ensayo (Kit ApopTag® apoptosis Detección, Chemicon, Temecula, CA) como se describió previamente (26). Brevemente, las secciones se incubaron durante 15 min con 20 mg /ml de proteinasa K a temperatura ambiente y después se lavaron a fondo en agua destilada. Los fragmentos de ADN producidos por el proceso de apoptosis fueron marcadas con digoxigenina nucleótidos a través de una incubación de 60 min a 37 ° C con desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) en una cámara de humedad. Las secciones se aclararon y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con anti-digoxigenina conjugado con fluoresceína. Después de contratinción con 4 '6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), los portaobjetos se examinaron para el porcentaje de células con fluoresceína etiquetado utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan-2.
Histología, inmunohistoquímica, y los microvasos densidad estimación
Preparación de secciones de tejido incluidas en parafina, su tinción y análisis inmunohistoquímicos se llevaron a cabo como se describe previamente (23, 24). Anti-von Willebrand anticuerpo del factor VIII (Cat. No. A0082, DAKO Diagnóstico Canadá Inc .; 1:200) se utilizó para la identificación de los microvasos. Todas las secciones de tejido fueron ligeramente counterstained con 5% (w /v) de hematoxilina de Harris (H & amp; E). Las secciones de control se procesaron en paralelo con IgG de conejo no inmune (Dako, Carpinteria, CA) que se utiliza en la misma concentración como los anticuerpos primarios. la densidad microvascular, es decir, el número de vasos sanguíneos por 400 × campo microscópico, se determinó mediante análisis microscópico de secciones de tejido factor de von Willebrand VIII-manchado.
El análisis estadístico
Los datos se expresan como medias ± SEM ANOVA se utilizó para comparar los valores medios del grupo múltiple. Shaffer estadísticas y la prueba t de Student se utilizaron para el análisis de cualquier diferencia entre dos grupos. Comparación del porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular se realizó con ANOVA de dos vías con el uso de Prism 4.02 Software (Graph Pad). Los valores se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0,05, excepto para el análisis de microarrays, donde la significación se fijó en p & lt; 0,001
Resultados
enteros perfiles de expresión del genoma de CCOC microdisecado identifica los genes expresados diferencialmente
los patrones de expresión de genes de ARN aislado de la componente epitelial de ovario de células de 10 especímenes de cáncer claras aisladas por microdisección de captura por láser se compararon con ARN aislado de manera similar a partir de 10 muestras de epitelio superficial del ovario normales usando Affymetrix U133 plus 2 matrices. Después de la normalización y el análisis inicial, 16.013 probesets informativos pasaron criterios de filtrado. Usando una prueba de permutación multivariante proporcionar confianza del 95% que el número de falsos descubrimientos no excedió de 10%, 3.288 probesets para 2.559 genes se encontraron ser regulados diferencialmente, que se define por una diferencia de 1,5 veces o mayor en la expresión con una significación estadística de p & lt ; 0,001. Representación gráfica de esta expresión diferencial de genes puede ser visto en la Figura 1a. Para validar los datos de microarrays, 12 genes que son expresados diferencialmente fueron seleccionados al azar para el análisis de QRT-PCR. Diez de los 12 genes son expresados diferencialmente en QRT-PCR, dando un índice de validación de microarrays global de 83% (Figura 1b, c y en la Tabla S1)
.
(a) Representación gráfica de conjunto de perfiles de expresión del genoma de la de células claras de ovario cáncer de la muestra (CCOC) y el epitelio superficial del ovario (OSE). (B) y (c) Comparación de los datos QRT-PCR y los datos de microarrays de los seis sobreexpresada y cuatro genes underexpressed utilizados para el análisis de validación (d) Camino de genes regulados diferencialmente identificados en el de células claras de microarrays cáncer de ovario. Los genes incluidos en el análisis fueron obligados a tener un cambio ≥1.5 veces. múltiples conjuntos de sonda se promediaron para cada gen.
Red
, gen está regulado.
Blue
, es el regulado gen.
Identificación de las vías activadas en CCOC
Con el fin de identificar las vías activadas presentes en CCOC, categorías funcionales de los expresados diferencialmente genes fueron identificados mediante análisis de genes ontología (GO). Estadísticamente categorías importantes demuestran un gran número de genes implicados en el metabolismo de los carbohidratos, metabolismo de la glucosa, glucólisis, y el desarrollo de los vasos sanguíneos (Tabla 1). Los 3.288 probesets y sus datos asociados expresión relativa en comparación a OSE se importaron en el software PathwayStudio 6.0. Vías involucradas en la angiogénesis, la coagulación, metabolismo de la glucosa, la proliferación celular, la motilidad celular y eran evidentes (Figura 1d). Por ejemplo, HSPCA, que se ha demostrado para estabilizar HIF1α (27), se encontró que se expresa sobre-.