Extracto
Hay estudios que investigan los efectos de la radiación infrarroja de banda ancha (IR) de la célula de cáncer, mientras que las influencias del medio infrarrojo de la radiación (MIR) son todavía desconocidos. En este estudio, un emisor de MIR con la banda de longitud de onda de emisión en la región de 3-5 micras fue desarrollado para irradiar las células de adenocarcinoma de pulmón A549. Se encontró que la exposición MIR inhibe la proliferación celular y cambios morfológicos inducidos por la alteración de la distribución celular de los componentes del citoesqueleto. El uso de PCR cuantitativa, se encontró que los MIR promovió los niveles de expresión de ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia-telangiectasia y Rad3-relacionado y relacionado con Rad3), TP53 (proteína tumoral p53), p21 (CDKN1A, quinasa dependiente de ciclina 1A inhibidor) y GADD45 (detención del crecimiento y daño de ADN inducible), pero disminuyeron los niveles de expresión de la ciclina B de codificación de genes, CCNB1 y CCNB2, así como CDK1 (quinasa dependiente de ciclina 1). La reducción de los niveles de expresión de proteínas de Cdc25C, la ciclina B1 y la fosforilación de CDK1 en Thr-161 sugieren en conjunto G
arresto 2 /M se produjo en células A549 por MIR. la formación de focos de reparación del ADN de ADN de doble filamento se rompe (OSD) de γ-H2AX marcadores y sensor de 53BP1 fue inducida por el tratamiento MIR, que implica el MIR inducida G
2 detención del ciclo celular /M resultó de OSD. Este estudio pone de manifiesto un posible papel para el uso de los MIR en la terapia del cáncer de pulmón mediante el inicio de OSD y el bloqueo de la progresión del ciclo celular
Visto:. Chang HY, Shih MH, Huang HC, Tsai SR, Juan HF, Lee SC ( 2013) La radiación infrarroja Medio induce G
2 celular /M del ciclo de detención en A549 Las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (1): e54117. doi: 10.1371 /journal.pone.0054117
Editor: Jasti Rao, Universidad de Illinois Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de septiembre de 2012; Aceptado: 6 de diciembre de 2012; Publicado: 15 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC 100-2120-H-002-014, NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3) y Nacional de Taiwán Proyecto de la Universidad la investigación de vanguardia de dirección (10R70602C3 y 101R4000). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
neoplasia es la principal causa de muerte en el mundo, y el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer [1]. A medida que el hábito de fumar disminuye, la incidencia de cáncer de pulmón se ha deteriorado en muchos países de acuerdo con [2]. A excepción de fumar, otros factores como el asbesto, el radón o exposiciones metales pesados también contribuyen al cáncer de pulmón [3]. Estadísticas datos de la Agencia Internacional de 2008 para la Investigación del Cáncer (IARC) evaluación del riesgo indica que el cáncer de pulmón mata a cerca de 1,4 millones de personas al año en todo el mundo [4]. Debido a la alta incidencia y mortalidad del cáncer de pulmón, la terapia relacionada está progresando para resolver estos problemas.
de rayos x La radiación electromagnética procedente de la radiación solar se puede dividir en varias regiones, incluyendo γ-ray,, ultravioleta (UV), luz visible, infrarrojo (IR), microondas y ondas de radio. Entre la radiación solar, la luz IR con longitudes de onda que van desde 0,76 hasta 1000 micras se puede dividir en tres regiones, en el infrarrojo cercano (NIR, 0,76-1,5 micras), infrarrojo medio (MIR, 1.5 a 5.6 micras) y del infrarrojo lejano ( FIR, 5,6 a 1.000 micras). Aplicaciones de IR han sido ampliamente establecida en usos diarios y propósitos clínicos, incluyendo la microcirculación cutánea, cicatrización de heridas, sensores de gas, y la medición de temperatura a distancia [5].
Estudios previos han indicado que NIR provocó una respuesta de señalización mitocondrial retrógrada resultante ROS matriz mediada por metaloproteinasa-1 (MMP-1) a través de la producción de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) vía [6]. También mostró que NIR protegida de fibroblastos dérmicos humanos de la citotoxicidad inducida por UV mediante la inducción de Hsp27 que impide apoptosome montaje, un evento inicial de apoptosis [7], [8].
in vivo
estudios demostraron que NIR aumentó el factor de crecimiento angiogénico inductor vascular endotelial y la disminución de la inhibidor angiogénico trombospondina-2, iniciando la angiogénesis dérmica en la piel humana [9]. Por otra parte, la exposición de FIR promovió la angiogénesis en las células endoteliales microvasculares humanas junto con la activación de p38 y la señal extracelular regulada señalización quinasa [10], la circulación mejorada de sangre en la piel [11], [12] y que ejerce una actividad anti-inflamatoria en el endotelio vascular [13]. Asimismo, informó que FIR inhibe la proliferación celular a través de la mejora de la expresión del factor de AMP cíclico que dependen de la transcripción (ATF) 3 en las células cancerosas cuya basal nivel de expresión de la proteína de choque térmico (HSP) 70A fueron bajos [14], [15].
Los efectos del MIR en las células cancerosas, sin embargo, siguen siendo desconocidos. Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de la MIR con la banda de longitudes de onda en los regímenes 3-5 micras en las células cancerosas altamente proliferado. Con este fin, hemos desarrollado un emisor MIR y constreñidos a la longitud de onda MIR 3 a 5 micras. Dado que el molecular C-H, enlaces N-H y O-H pueden ser excitados para generar vibraciones de tensión de 3-5 micras de infrarrojos, se espera que la reacción bioquímica importante se verá afectada por la irradiación de infrarrojos con longitud de onda en este rango de [16]. Hemos puesto de manifiesto que los MIR redujo la viabilidad celular, provocó cambios significativos en el arreglo del citoesqueleto, e indujo G
2 detención del ciclo celular /M que podría ser aportado por la inducción de roturas de los filamentos dobles (OSD) en el ADN a lo largo del /ATR-p53 ATM -p21 eje.
resultados
la longitud de onda del MIR se vio limitada a 3-5 micras y la temperatura del medio de cultivo fue consistente a 37 ° C
el cuerpo negro banda ancha fuente fue fabricado para proporcionar banda ancha MIR y situado en una cámara de metal para evitar la alteración del medio ambiente (Figura 1). Con el aumento de la temperatura de calentamiento, la potencia de emisión de sustrato de silicio fue elevado correspondientemente. La intensidad de la radiación se fijó a 3 mW /cm
2 mediante el ajuste de la temperatura de calentamiento y la medición de la magnitud por metro poder THORLAB PM100D. Para eliminar los efectos del calor del MIR, fijamos la máquina de reciclaje refrigerador a 28 ° C para enfriar el aire en la cámara donde indicación de la fuente MIR de este modo mantener la temperatura del medio de cultivo a 37 ° C. La disposición del aparato se muestra en la Figura 1B
.
(A) La vista lateral de la fuente de banda amplia de cuerpo negro. (B) Diagrama esquemático que muestra la configuración para el experimento de irradiación MIR. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se cultivaron en una incubadora con un 100% de humedad, a 37 ° C y con un 5% de CO
2.
La proliferación celular de células A549 se mantuvieron sin cambios en el MIR expuesto Medium
para distinguir si los efectos de MIR se produjeron directamente sobre las células cultivadas o indirectamente a través de la alteración de la medio celular, el medio de cultivo se expuso a MIR durante 48 horas antes de su adición al cultivo celular. Después de las células A549 (2 × 10
4 células por pocillo) se sembraron en una placa de 12 pocillos, sustituimos el medio de cultivo con medio expuesto-MIR o no expuesta durante 48 horas y luego se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT. Hemos observado que la proliferación celular de las células A549 no se alteró de manera significativa en medio expuesto-MIR en comparación con medio no expuesto (Figura S1). A partir de aquí, se aplicó un período de 48 horas de exposición a las células para todos los experimentos a no ser que se especifique lo contrario.
MIR inhibió la proliferación celular y una alteración de la morfología de las células A549
Para investigar el efecto del MIR en las células cancerosas, se utilizaron células de adenocarcinoma de pulmón A549 para evaluar la citotoxicidad de los MIR y los fibroblastos pulmonares normales MRC-5 se ensayaron para la comparación. Las células (2 × 10
4) se sembraron en placas de cultivo de 12 pocillos durante la noche antes de la exposición MIR. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT y azul recuento de células basado tripano después de la exposición MIR. Los resultados indicaron que la proliferación de las células A549 se suprimió significativamente por la exposición MIR durante 48 horas (figura 2A), mientras que el crecimiento y la morfología de células MRC-5 no se vieron afectados por el tratamiento MIR (Figura S2A, S2B). Curiosamente, se reveló cambios morfológicos en las células A549 tras la exposición MIR. Hemos observado que las células A549 expuestas-MIR eran más redondeada en forma, ampliada en tamaño, y formamos un delantal radial en virtud de contraste de fase examen microscópico (Figura 2B). Los resultados implican que MIR podría regular la dinámica del citoesqueleto que determina la morfología de las células.
(A) El número de células se midieron a 0, 24 y 48 horas después de la exposición MIR mediante el uso de azul tripán y un hemocitómetro. El número de células medios de control (no expuesta) y tratamientos de exposición MIR se expresaron como medias ± SD de tres experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0,01. (B) Las imágenes de células fueron observadas por microscopía de contraste de fase después de 48 horas de exposición MIR. Las flechas indican los delantales radiales de células agrandadas. La barra de escala representa 50 micras.
MIR exposición activado la reorganización de la actina del filamento, Vinculina y microtúbulos
El citoesqueleto juega un papel importante en la regulación de la forma celular [17], [18] , son conocidos y ambos filamentos de actina y los microtúbulos para afectar a la formación y distribución de células adhesiones focales [17] que determinan la morfología celular y la motilidad. Para distinguir los efectos de MIR en citoesqueleto, se realizó tinción de inmunofluorescencia para examinar si los dos componentes importantes del citoesqueleto, los filamentos de actina y los microtúbulos, así como la focal vinculina molécula de adhesión implicada en este cambio morfológico. Los resultados mostraron que MIR indujo una disminución significativa en la F-actina que contiene fibras de estrés tal como se determina mediante tinción con faloidina marcada con rodamina (Figura 3). Además, los filamentos de actina mostraron una densa malla de arreglo no polarizada y la vinculina se agregan alrededor de la periferia de la célula en las células expuestas-MIR (Figura 3), lo que implica que MIR puede inhibir la migración celular mediante la regulación de la reorganización de los filamentos de actina y la distribución de vinculina [ ,,,0],19]. Por otro lado, los microtúbulos se distribuyeron en las regiones citoplásmicas perinuclear después del tratamiento MIR (Figura 4). Esta distribución específica de fragmentos irregulares microtúbulos sugiere que podría causar MIR G
2 detención del ciclo celular /M como se ha demostrado anteriormente [20], [21].
Las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en placas de 12 pocillos , expuestos a MIR durante 48 horas, se fijaron para la tinción y se visualizó por microscopía de fluorescencia. Los filamentos de actina fueron marcadas con faloidina marcada con rodamina (rojo), vinculina se marcó con anticuerpo anti-ratón vinculina y la correspondiente FITC anticuerpo secundario conjugado anti-IgG de ratón (verde), y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). La barra de escala representa 10 micras. Las flechas indican la posición de vinculina.
Las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en placas de 12 pocillos, se expone a MIR durante 48 horas, fijado para la tinción y se visualizaron por microscopía de fluorescencia. Los microtúbulos se marcaron con anticuerpo α-tubulina y la FITC-conjugado correspondiente anticuerpo secundario (verde), y los núcleos se marcaron con DAPI (azul). La barra de escala representa 10 micras.
Regulado MIR Exposición La expresión de mRNA de Nivel G
2 /M genes regulados en células A549
Dado que la distribución del citoesqueleto implican un posible papel de MIR en la regulación de la progresión del ciclo celular, es fundamental para examinar la expresión de genes implicados en G
transición 2-M se selecciona adicionalmente para ser validado. El control del ciclo G
2 células /M responde al daño del ADN e implica la activación de la ataxia-telangiectasia mutada (ATM) y la ataxia-telangiectasia y relacionados con Rad3 (ATR), las proteínas [22]. Tanto ATM y ATR activan p53 por la fosforilación de Ser15 en respuesta al daño del ADN, lo que aumenta la transcripción de la detención del crecimiento y el gen inducible daños en el ADN (GADD45) y p21, que se requiere para inhibir la expresión de los reguladores clave de la G
transición 2 /M, la quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1) y ciclina B [23], [24], [25], [26]. La expresión de genes implicados en la inducción de G
2 /M detención se incrementaron en las células A549 tratadas con MIR, incluyendo ATM, ATR, p53, GADD45A, GADD45B, y p21 (Figura 5A). En contraste, los niveles de expresión de ARNm de CDK1, CCNB1 y CCNB2 se redujeron después de la exposición MIR (Figura 5A). Los resultados demuestran que la exposición MIR activa las expresiones de ATM, ATR, p53, p21 y genes en respuesta al daño del ADN y regula los genes para controlar G
2 progresión del ciclo celular /M.
Las células se expusieron a MIR durante 48 h, y se recogieron para el ARN y la extracción de proteínas. (A) La expresión génica de los genes implicados en la regulación del G
2 /M transición (eje x). El eje Y indica las cantidades de transcripción relativos calculados utilizando el método ΔΔCt con GAPDH como el gen de referencia amplificado a partir de cada muestra. Los datos se presentan como media ± S.D. (
n
= 3). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,001. (B) Proteína niveles de expresión fueron examinados por Western blot con actina como control interno. Todos los experimentos fueron repetidos tres veces. Análisis de citometría de (C) de flujo del contenido de ADN. Las células se expusieron a MIR para 48 h. Las células de seis experimentos independientes se recogieron para el análisis de la distribución del ciclo celular. (D) El porcentaje de células en cada fase se obtuvo mediante análisis de ciclos múltiples.
MIR exposición abolido la expresión de ciclina B1 y Cdc25C, y la disminución de la fosforilación de CDK1
La célula la progresión del ciclo de la G
2 a la fase M está regulada por la activación de CDK1, cuya actividad es dependiente de la coordinación con la ciclina B [27], [28]. La activación del complejo CDK1 /ciclina B se mantiene a través de la fosforilación en Thr161 y desfosforilación en Thr14 y Tyr15 de CDK1 [27], [28]. La desfosforilación de los residuos Thr14 y Tyr15 en CDK1 es catalizada por la fosfatasa Cdc25C. Está pensado como un paso limitante de la velocidad para G
2 la entrada en mitosis [27], [29]. Teniendo en cuenta el papel del complejo B CDK1 /ciclina y Cdc25C en la regulación de G
2 a transición de fase M, se evaluó si la exposición MIR alteró la expresión de la proteína de CDK1, ciclina B1, y Cdc25C, así como la fosforilación de CDK1. Los resultados mostraron que la fosforilación de la proteína CDK1 en Thr161 y los niveles de ciclina B1 y Cdc25C fueron todos reducida en las células tratadas con MIR (Figura 5B). Se indica que la exposición MIR indujo una típica G
arresto 2 /M del ciclo celular en las células A549 mediante la regulación de ciclina B1 y la expresión Cdc25C, y la fosforilación de CDK1.
MIR exposición dio lugar a la detención del ciclo celular en G
2 /M fase
a continuación examinó si la distribución del ciclo celular de A549 se ve afectada por la irradiación MIR. Para obtener el contenido de ADN, se realizó la citometría de flujo para analizar las células PI marcado. Los resultados mostraron que las células en G
2 población /M se incrementaron bajo exposición MIR. Coordinadamente, el G
2 /M reguladores se activan tanto en sus transcripcional, traduccional y post-translacional niveles, lo que lleva a la acumulación de células en G
2 /M fase.
MIR exposición disparada colocalización de 53BP1 y γ-H2AX focos nucleares en respuesta a las especies reactivas del oxígeno (ROS) daño del ADN mediada por
Desde MIR activa el eje /ATR-p53-p21 ATM que es la vía de daño en el ADN puesto de control, es fundamental para investigar si el MIR causó daño del ADN en las células A549. Estudios anteriores demostraron que la proteína de unión supresora de tumores p53 (53BP1) y γ-H2AX participar en el ADN vía ATM dependiente de daño de señalización y formar focos nuclear en respuesta a la radiación ionizante causaron daños del ADN [30], [31]. Para examinar esto, las células A549 se fijaron con acetona y se tiñeron para 53BP1 y γ-H2AX después de la exposición MIR. Hemos expuesto que 53BP1 (Figura S3 A) y γ-H2AX (Figura S3 B) se localizaron de forma dispersa en los núcleos de las células no expuestas, sino que formaban numerosos focos subnuclear distinguido en respuesta a MIR. Se demostró además que los focos 53BP1 y γ-H2AX se colocalized en nucei del MIR expuesto células. La formación y la colocalización de 53BP1 focos /γ-H2AX se disminuyeron en el pretratamiento o tratamiento concomitante de 10 mM ROS scavenger NAC (Figura 6). Podemos postular que MIR inducida G
2 detención del ciclo celular /M podría resultar de ROS daño del ADN mediada de los cuales se observaron los marcadores de daño 53BP1 y gamma-H2AX focos en este estudio.
Las células se sembraron en el cubreobjetos de vidrio en placa de 12 pocillos, exposición MIR durante 48 horas en presencia o ausencia de 10 mM de N-acetil-cisteína (NAC). Las células fueron tratadas con NAC durante 1 h antes de la exposición MIR (NAC 1 H) o cotreated durante toda la exposición durante 48 h (NAC). Las células se fijaron para la tinción y se visualizaron por microscopía de fluorescencia. 53BP1 se marcó con anticuerpo de conejo anti-53BP1 y correspondía conjugado con FITC anticuerpo IgG anti-conejo (verde), γ-H2AX se marcó con anticuerpo anti-γ-H2AX ratón siguiente correspondido anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con PE (rojo), y los núcleos se marcaron con DAPI (azul). La barra de escala representa 10 micras.
Discusión
Debido a las alteraciones moleculares implicados en la regulación de progresión del ciclo celular se acompañan de un fracaso para detener la proliferación de las células cancerosas, la inhibición de la proliferación celular mediante la interferencia con el ciclo celular es un enfoque prometedor para la terapia contra el cáncer. En este estudio, se observó que la exposición MIR puede inhibir la proliferación de células A549 (Figura 2A), y también llevar a una, delantal radial ampliada y la morfología celular de la forma redondeada (Figura 2B) al afectar la disposición y distribución de los filamentos de actina (Figura 3), la adhesión focal (Figura 3), y los microtúbulos (Figura 4). La distribución fragmentada perinuclear de los microtúbulos es consistente con la morfología celular observados durante G
detención del ciclo celular 2 /M, que fue validado por el análisis de la distribución del ciclo celular, la regulación de la expresión de genes y proteínas de los reguladores del G
2 /M puesto de control (Figura 5). En avanzada, también hemos demostrado que MIR podría inducir la formación de y colocalización 53BP1 y focos nucleares γ-H2AX (Figura 6) en respuesta al daño del ADN que normalmente activa vía de ATM /ATR-p53-p21 resultante G
2 /célula M la detención del ciclo.
MIR es la parte de la luz de la radiación solar que puede causar daños en el ADN por la excitación directa de ADN o mecanismo indirecto que implica la excitación de otros cromóforos celulares [32]. El proceso de excitación directa es causada por la radiación de longitud de onda corta, como UVB (280-315 nm) y UVC (100 a 280 nm) y en su mayoría conduce a generar dímeros y fotoproductos pirimidina ciclobutano, que son producidos por la absorción de radiación por el ADN [32 ]. Por otra parte, el mecanismo indirecto es aportado por especies reactivas del oxígeno (ROS) que se genera por los fotosensibilizadores endógenos. El daño en el ADN indirecto es causada por más tiempo la radiación de longitud de onda por encima de 320 nm, tal como UVA (315-400 nm) y cerca de la luz visible, en la que el ADN absorbe sólo débilmente [33], [34]. La radiación con longitud de onda más larga de este modo es absorbida por los fotosensibilizadores para generar ROS. Después de la absorción de la luz UVA, fotosensibilizador endógena cruzar a un estado triplete y la transferencia de energía para generar oxígeno singlete [35]. Estos UVA irradiada fotosensibilizadores incluyen flavinas [36], NADH /NADPH [37], ácido urocánico [38] y algunos esteroles [39]. Debido a la media de tiempo corto en las células, el oxígeno singlete sólo está presente después de la radiación [40]. Sin embargo, ROS puede ser presentado durante un período prolongado después de exposición a la radiación ya que el ROS adicional puede ser producido por las especies iniciales [41]. El radical anión superóxido (
• O
2
-), peróxido de hidrógeno (H
2O
2), y el radical hidroxilo (
• OH) se pertenecido al grupo de ROS, todos los cuales se pueden generar por el mecanismo endógeno como subproductos de la actividad mitocondrial normal o estrés exógeno [42]
.
Una vez que el estrés exógeno inducida nivel ROS son dramáticamente más alta que la célula puede eliminar, se produce el estrés oxidativo y resultado en daño oxidativo del ADN por reticulación de proteínas de ADN, modificación de bases y el azúcar, despurinación o deprimidination [43], [44], [45], [46], [47]. El daño oxidativo del ADN inducida por ROS puede desencadenar respuestas de control del ciclo celular, incluida la contratación de 53BP1 y γ-H2AX seguida de la degradación de Cdc25C para G
2 /M detención como hemos observado, por tanto, proporciona un tiempo adicional para la reparación del ADN [48], [49]. Por otra parte, NIR se han encontrado para generar ROS deriva de las mitocondrias, y el citocromo
c
oxidasa se han sugerido como un posible fotorreceptor [6], [50]. Las evidencias sugieren que la RI podría acelerar la reacción de fosforilación oxidativa en la mitocondria mediante la irradiación de los fotorreceptores como oxidatse citocromo c y NADH. La tasa de aumento en la fosforilación oxidativa genera más alta de este modo ROS contribuye a daños indirectos en el ADN.
En este estudio, hemos encontrado que la exposición MIR suprimió el nivel de proteínas de Cdc25C y ciclina B1, y se inhibe la fosforilación de CDK1. Regulación a la baja de Cdc25C bloquearía la activación de CDK1, dando como resultado la disociación de la ciclina B1 y la prevención de la progresión del ciclo celular de G
2 a la fase M. Además, hemos expuesto que 53BP1 andγ-H2AX forman numerosos focos subnuclear en respuesta al tratamiento MIR. 53BP1 participa en el ADN vía cajero automático que dependen daños de señalización y forma focos nucleares en respuesta a la radiación ionizante causó daños en el ADN [30], [31], mientras que γ-H2AX facilita la contratación de un número de proteínas de respuesta al daño, como por ejemplo BRCA1, MDC1 y RAD51 para la reparación del ADN [51], [52]. Es posible que la exposición MIR inducida G
2 /M detención es causada por daño en el ADN, a pesar de que la longitud de onda del MIR está cerca de NIR que es difícil de causar un daño directo en el ADN. A continuación, se postula que la exposición MIR puede ser absorbido por el fotosensibilizador endógena elevando así ROS y causando daño oxidativo del ADN.
Estudios anteriores mostraron que el peróxido de hidrógeno inducida G
2 /M detención del ciclo celular e influyeron en la organización de microtúbulos y filamentos de actina relé de la capacidad para la reducción de las proteínas del citoesqueleto oxidados o de balanza de interrupción tiol [51], [52], [53]. El peróxido de hidrógeno se incrementó tubulina monomérica, pero disminuyó la tubulina polimerizada sugiriendo peróxido de hidrógeno causada despolimerización de los microtúbulos. En este estudio, la exposición MIR causó la distribución perinuclear y la agregación de los microtúbulos densamente disminuyendo, así, las redes de microtúbulos. Esta observación es similar a microtúbulos dirigir fármacos, tales como alcaloides de la Vinca [54]. La distribución perinuclear de los microtúbulos implica que la exposición MIR podría inducir estrés oxidativo tanto, las redes de microtúbulos inquietantes.
En este estudio, hemos encontrado que la exposición MIR indujo respuesta al daño del ADN. Estudios anteriores mostraron que se encontró γ-H2AX focos nucleares que se colocalized con proteínas implicadas en la reparación de recombinación homología y unirse nonhomologousend-(NHEJ) [55]. Otras proteínas de reparación, incluyendo MCD1 /NFBD1 y 53BP1, también se documentaron para interactuar con γ-H2AX para formar focos nucleares [56]. En informes anteriores demuestran que los cambios conformacionales en 53BP1 es causada por la fosforilación de 53BP1 por ATM exponiendo así el dominio de unión a la cromatina que participa directamente en la reparación de DNA DSB mediante la activación de la ADN ligasa complejo XRCC4 IV /en NHEJ vía [57]. En este estudio, hemos encontrado que la exposición MIR formado focos nucleares de 53BP1 y γ-H2AX (Figura 6) implica que la exposición MIR inducir la reparación del ADN en respuesta al daño DAN.
En resumen, este estudio exhibición del MIR longitud de onda en 3-5 micras puede alterar la organización de filamentos de actina, microtúbulos y vinculina, y causar la inhibición de la progresión del ciclo celular a través de la activación de eje /ATR-p53-p21 ATM en respuesta al daño del ADN, también la regulación de Cdc25C vía en paralelo lo que resulta en la regulación a la baja de la desfosforilación de CDK1 y ciclina B. en particular, nuestro estudio muestra la primera evidencia sobre el efecto inhibidor del MIR en células de cáncer de pulmón y proporciona información útil para la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Medio radiación infrarroja (MIR) del emisor
la longitud de onda de MIR genera a partir de la fuente de banda ancha de cuerpo negro fue limitado en el rango de entre 3 a 5 micras utilizando una oblea de 3-5 micras de paso de banda de zafiro (SingHuang Tecnología Co., Ltd., Taipei, Taiwán) (Figura 1A). El filtro de paso de banda ancha fue diseñado para aislar 3-5 micras ventanas atmosféricas con un diámetro de 25,4 mm ± 0,1%. El recorte del 50% en /puntos de corte de transmisión se fijaron en 3,0 micras ± 4% y 5,0 micras ± 4%, respectivamente. El filtro exhibió media de transmisión en la banda de paso superior a 60% y menos de 0,1% los niveles de transmisión fuera de la banda de paso. Una película gruesa de molibdeno 300 nm fue depositado por deposición de plasma en el lado posterior de un sustrato de silicio de tipo n como una fuente de calentamiento (Figura 1A). La intensidad de la radiación se midió por medidor de potencia THORLAB PM100D a ser de 3 mW /cm
2. Para mantener la temperatura de cultivo de células, reciclar máquina refrigerador se fijó a mantener la temperatura del medio de cultivo a 37 ° C como se muestra en la Figura 1B. Las células sembradas sobre placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos (Corning Costar, Corning, Nueva York, EE.UU.) antes de las 24 h de la exposición IR se colocaron en el filtro como se indica en la figura 1B.
Cell Culture
Humano células epiteliales del pulmón A549 (ATCC, CCL-185) y células de fibroblastos de pulmón fetal humano MRC5 (ATCC, CCL-171) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las células A549 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Las células MRC5 se cultivaron en medio esencial mínimo (Gibco) suplementado con piruvato de sodio 1 mM (Gibco), ácido 0,1 mM no esencial amino (Gibco), y 10% de suero bovino fetal (Gibco). Tanto las líneas celulares estaban libres de micoplasma como se detectó por el método basado en la PCR y se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2.
Inmunofluorescencia La tinción
células A549 se sembraron en el cristal cubreobjetos en una placa de cultivo de 12 pocillos, se cultivaron durante 1 día, y expuesto por MIR o cultivados en la oscuridad durante 48 h adicionales. Las células se fijaron y se permeabilizaron con acetona preenfriar durante 5 min a -20 ° C y después se incubaron con 1% de BSA (Bioshop, Burlington, ON, Canadá) en PBS como tampón de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se marcaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-tubulina (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.; 1:1000), anticuerpo monoclonal de ratón anti-vinculina (Millipore; 1:200), anticuerpo policlonal de conejo anti-53BP1 (GeneTex, San Antonio, TX, EE.UU.; 1:500), o anticuerpo anti-γ-H2AX ratón (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.; 1:500) a 4
oC durante la noche. Después se lavó con PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween-20, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) tres veces, las células se marcaron con correspondiente secundario anti-IgG de ratón-Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1:1000 ), anti-IgG de ratón-PE (Abcam; 1:1000), o secundario anti-conejo FITC-IgG (Millipore; 1:200) durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Las células marcadas con anti-vinculina se tiñeron contador con TRITC conjugado faloidina (Millipore; 1:1000) durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron con PBST tres veces y se montaron con el reactivo ProLong® oro con DAPI (Invitrogen). Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopio de fluorescencia Leica con el plan HCX FL 100 × /1,25 objetivo aceite usando una cámara SPOT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EE.UU.) y el software avanzado SPOT (Diagnostic Instruments).
ensayo de viabilidad celular
2 × 10
4 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos por pocillo y se dejó que se unieran durante la noche antes de la exposición MIR. El polvo de MTT (3 [4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio, Sigma-Aldrich) se prepararon como valores en PBS a la concentración de 5 mg /ml y se filtró. Después expuesta por MIR durante 48 h, se añadió solución de MTT 150 l a cada pocillo. Las células se incubaron a 37 ° C durante 3 horas hasta que el cristal violar formado. cristales de formazán se disolvieron con 500 l de dimetilsulfóxido (DMSO, Scharlau Chemie, Barcelona, España) y se agita evitarse de la luz durante 15 minutos para disolver completamente los cristales. La absorbancia se midió a 570 nm en un lector de ELISA (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Todos los experimentos se repitieron tres veces.
Extracción de ARN y transcripción inversa
ARN total se aisló usando el reactivo TRIzol (Invotrogen) después de la exposición de 48 h. En resumen, se añadieron 400 l de reactivo TRIzol (Invitrogen) a cada pocillo de la placa de TC de 12 pocillos una vez que se retiró el medio. Se recogieron muestras de tres experimentos independientes y se almacenaron a -80
oC. La extracción de ARN se realizó de acuerdo con el manual, y la concentración de ARN y la calidad se determinó por NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Montchanin, DE, EE.UU.). ARNm se reverstranscripted por RevertAid ™ H Minus la primera cadena de cDNA de síntesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). 1 g de ARN total fue mezclada con oligo (dT)
18 imprimación y desnaturalizado. Posteriormente, la muestra de ARN se mezcló con tampón de reacción 5X, dNTP, RiboLock ™ RNasa inhibidor y RevertAid ™ H Minus transcriptasa inversa. La reacción de transcripción inversa se realizó a los 42
oC durante 60 min y terminó a 70
oC durante 5 min. El producto de transcripción inversa se usó directamente en la amplificación por PCR o almacenarse a -20
oC.
PCR en tiempo real
Los cebadores específicos de gen para PCR en tiempo real fueron diseñados por Beacon Designer 7 programa (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EE.UU.) y las secuencias se enumeran en la Tabla 1. cuantitativa en tiempo real PCR se realizó utilizando SYBR Green Supermix (BIO-RAD, Hercules, CA) durante 40 ciclos de amplificación en un iQ5 iCycler ™ Sistema de PCR en tiempo real de detección (Bio-Rad Laboratories). cantidades de transcripción relativas se calcularon utilizando el método ΔΔCt (ciclo umbral) con GAPDH como el gen de referencia amplificado a partir de las muestras. Todas las reacciones se realizaron por triplicado.
extracción de proteínas y Western Blot
Después de la exposición MIR durante 48 h, se extrajo la proteína total utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína se solubiliza en tampón de lisis (7 M urea (Boehringer, Mannheim, Alemania), 2 M tiourea, 4% CHAPS (JT Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.) y 0,002% de azul de bromofenol (Amersco, Solon, OH, EE.UU.)) y la concentración de proteína se determinó por el método BCA (Pierce Biotech Inc., Rockford, IL, EE.UU.).