Extracto
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), una tirosina quinasa receptor que promueve la proliferación celular y la supervivencia, se sobreexpresa anormalmente en numerosos tumores de origen epitelial, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC). EGFR anticuerpos monoclonales han demostrado aumentar la supervivencia media y están aprobados para el tratamiento del cáncer colorrectal. desacetilasas de histonas (HDAC), frecuentemente sobreexpresados en el cáncer colorrectal y varios tumores malignos, otros son objetivos atractivos para la terapia del cáncer. Varios inhibidores de HDAC (HDACi) se desarrollan y exhiben potentes capacidades antitumorales. En este estudio, las células de cáncer colorrectal humano tratados con HDACi exhibieron reducen la expresión de EGFR, por lo tanto perturbado ERK inducida por EGF y la fosforilación de Akt. HDACi también disminuyó la expresión de SGLT1, un transportador de glucosa activo que se encuentra para ser estabilizado por EGFR, y suprime la absorción de glucosa de las células cancerosas. HDACi suprime la transcripción de EGFR y las HDAC de clase I se demostró estar implicado en este evento. análisis de inmunoprecipitación de la cromatina mostró que HDACi causó la disociación de SP1, HDAC3 y el CBP a promotor de EGFR. Nuestros datos sugieren que HDACi podría servir como agente único para bloquear los receptores EGFR y HDAC, y puede traer más beneficios para el desarrollo de la terapia CRC
Visto:. Chou CW, Wu MS, Huang WC, Chen CC ( 2011) la inhibición de HDAC disminuye la expresión de EGFR en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (3): e18087. doi: 10.1371 /journal.pone.0018087
Editor: Chris Chan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 23 Agosto, 2010; Aceptado: February 24, 2011; Publicado: 25 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Chou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una beca de investigación del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
EGFR (también conocido como ErbB-1 /HER1), que pertenece a la familia ErbB de receptores tirosina quinasa, comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un solo dominio transmembrana hidrófobo y un dominio citoplásmico que contiene tirosina quinasa [1]. induce la unión del ligando homo o hetero-dimerización de receptor y la posterior activación de las vías incluyendo Ras /Raf /MEK /ERK y PI3K /PDK1 /Akt [1]. La mayoría de cáncer colorrectal (CRC) se caracteriza con la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y predijo con alto riesgo de metástasis y la recurrencia [2]. Orientación de EGFR parece ser un enfoque prometedor para el tratamiento CRC. De hecho, cetuximab, un anticuerpo quimérico IgG1 humano-ratón se une al dominio externo del EGFR, ha sido aprobado por la FDA en 2004 para el tratamiento de cáncer colorrectal metastásico [3]. Después de eso, un anticuerpo completamente humanizado, panitumumab, también está aprobado para el tratamiento de CCR [4]. Sin embargo, las evidencias que se acumulan demuestran que los efectos de la orientación de EGFR en el cáncer colorrectal se limitan en gran parte debido a la situación de la mutación KRAS [5]. Los mutantes KRAS evitan EGFR para activar las señales Ras /Raf /MEK /ERK, y significativamente debilitar el efecto terapéutico de cetuximab [6]. El examen del estado de KRAS es ahora un requisito previo para el uso de cetuximab [7]. A pesar de ~ 60% de los pacientes con CRC expresó KRAS no mutado, pero sólo la mitad de ellos se beneficia de cetuximab. Por lo tanto, el estado de KRAS no es el único determinante de la eficacia de la terapia diana EGFR [8]. Por lo tanto, el tratamiento con un amplio espectro de antecedentes genéticos se necesitan con urgencia y se beneficiaría mayoría de los pacientes insensible a las terapias basadas en cetuximab.
Aunque EGFR es un receptor tirosina quinasa y entrega señales después de la conjugación de ligando, su efecto puede ser prosurvival independiente de la actividad quinasa. Por ejemplo, los ratones que carecen de EGFR son embriones letal pero esos mutantes que albergan quinasa-inactiva sólo se muestran algunos defectos epiteliales [9], [10]. Además, la pérdida de actividad de la quinasa EGFR desacelera proliferaiton celular, pero la pérdida de su expresión arruina la captación de glucosa y conduce a la muerte celular [11] - [13]. Por lo tanto, la inhibición de la expresión de EGFR puede ser una mejor estrategia para la terapia CRC
.
desacetilasas de histonas (HDAC), que elimina los grupos acetilo de las histonas para silenciar la transcripción de genes son altamente expresado en diversos tumores [14], [15 ]. HDAC se han convertido en uno de los objetivos emergentes para la terapia contra el cáncer, y los inhibidores de HDAC (HDACI) muestran prometedoras actividades contra el cáncer [15]. Entre las diversas HDACi, SAHA (vorinostat) había sido aprobado con éxito para el tratamiento de linfoma de células T cutáneo (CTCL). la familia HDAC se puede subdividir en cuatro clases y la clase I HDACs, que incluye HDAC1, HDAC2, HDAC3 y HDAC8, se han notificado a ser altamente expresado en el cáncer de colon [16]. Los efectos pro-proliferativos de HDAC están conectados a la represión transcripcional de cdk-inhibidor, p21, y desmontables de HDAC 1, 2 y 3 reducido el crecimiento de varias células de cáncer de colon [17]. Por lo tanto, HDAC puede servir como un objetivo potencial para la terapia CRC, y SAHA había entrado en ensayos clínicos para el tratamiento de CRC [18].
En este estudio, hemos demostrado que la señalización de EGF en las líneas celulares mutantes KRAS, HCT116 y SW480, fue interrumpido por HDACi través de la represión transcripcional de la expresión de EGFR, lo que indica que HDACi sirvió como un único agente para bloquear EGFR y HDAC simultáneamente. La pérdida de EGFR contribuyó parcialmente al efecto citotóxico de los inhibidores de HDAC. Además, la expresión de SGLT1, un transportador de glucosa activo que se estabiliza por EGFR, también se redujo en HDACi y condujo a la reducción de la captación de glucosa en las células de cáncer de colon. El mecanismo subyacente a la represión transcripcional de EGFR por HDACi participó en el hypoacetylation histonas y la disociación de SP1, HDAC3 y el CBP a promotor de EGFR. Nuestros datos sugieren que HDACi podría servir como agente único para bloquear simultáneamente ambos EGFR y HDAC, y puede aportar beneficios a los pacientes con CCR con una gama más amplia de fondos genéticos.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Todas las muestras derivadas de pacientes se recogieron y se archivan bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Investigación del hospital de la Universidad Nacional de Taiwán y apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán. Una explicación verbal completo del estudio fue dado a todos los participantes. Ellos dieron su consentimiento para participar de forma voluntaria.
Materiales
TSA se adquirió de Sigma y SAHA se obtuvieron de Merck. Los Myc-etiquetados HDAC1, 2 y 3 fueron proporcionados por el Dr. WM Yang (Nchu, Taiwán). Los anticuerpos específicos para EGFR, p21, HDAC3, y la actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. anticuerpos H3, H4, y SP1 anti-Ac-histonas se obtuvieron de Upstate. anticuerpo anti-SGLT1 fue adquirido de Abcam.
Cultivo de células
HCT-116 (de Van Dyke MW, el MD Anderson) y SW480 (de TH Leu, NCKU) células de carcinoma de colon humano se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%; A431 (células de carcinoma epidermoide humano) y MDA-MB-468 (células de adenocarcinoma de mama humano) obtenidas de la ATCC se mantuvieron en RPMI suplementado con 10% FCS.
aislamiento de ARN, RT-PCR y PCR en tiempo real
ARN total fue aislado de las células HCT116 utilizando reactivo Trizol (Life Technology). reacción de transcripción inversa se realizó usando 2 g de ARN total, transcripción inversa en cDNA utilizando oligo dT primer. cDNA fue sometido a RT-PCR y se amplificó 30 ciclos usando dos cebadores de oligonucleótidos derivados de EGFR publicado o la secuencia de GAPDH, incluyendo 5 'TGGAGCTACGGGGTGACCGT-3' y 5'-GGTTCAGAGGCTGATTGTGAT-3 '(EGFR), 5'-AAGCCCATCACCATCTTC-CAG- 3 'y 5'-AGGGGCCATCCACA-GTCTTCT-3' (GAPDH) y 5'-TGAC-GGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3 'y 5'-CTAGAAGCATTTGCG-GGGACGATGGAGGG-3' (actina). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. PCR en tiempo real se realizó con muestras de ADNc utilizando el sistema ABI Prism 7900 de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores fueron los siguientes: EGFR (cebador directo, 5'-TTCCTCCCAGTGCCTGAAT-3 'cebador inverso, 5' GGTTCAGAGGCTGAT-TGTGAT-3 '); Actina (cebador directo, 5'-CCAACCG-CGAGAAGATGA-3 '; cebador inverso, 5'-TCCATCACGATGCCAGTG-3'). Los datos se normalizaron por la detección limpieza de genes de actina.
La proliferación celular
Para el análisis de inhibición del crecimiento, las células HCT116 se sembraron a una densidad de 3 x 10
3 células por pocillo en 96 -Bueno placas. Después de la siembra, el medio de cultivo se reemplazó con medio que contenía la concentración indicada de TSA. Después de 3 días, el crecimiento celular se midió usando 3- bromuro de (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (Sigma, St. Louis, MO) método colorimétrico. ciclo celular se determinó por citometría de flujo utilizando un tampón de tinción de yoduro de propidio y se analizaron en un BD FACS Calibur citómetro con el software Cellquest.
Medición de glucosa intracelular
Antes de la cosecha, cultivos adherentes de control y células tratadas con TSA en DMEM que contiene 1 o 4,5 mg /ml de glucosa se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) y después se lisaron con ion-Freeh
2O para 5 min en hielo. El contenido de glucosa se midió con el kit de medición de D-glucosa (GAHK-20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Actividad de luciferasa
Transfección transitoria y ensayo
El plásmido promotor EGFR que contiene una luciferasa de luciérnaga se transfectó transitoriamente en células HCT116 con reactivo de transfección Arrestin. Brevemente, 0,9 mg de ADN plásmido, 0.1 g de luciferasa de Renilla, y 5 ul reactivos de transfección se mezclaron, y el protocolo de transfección se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Seis horas después de la transfección, las células se cultivaron en medio completo normal para otra 16 h. A continuación, las células transfectadas se sometieron a ensayo de luciferasa. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la de la luciferasa de Renilla.
Preparación e infección de shHDAC-expresión de lentivirus
Brevemente, 6 g pCMV-dR8.91, 3 g pMD2.G, y 9 g pLKO-shLuciferase, pLKO-shHDAC1, pLKO-shHDAC2 o pLKO-shHDAC3 se cotransfectaron en células HEK293T utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contienen shLuciferase infecciosa, shHDAC1, shHDAC2 o shHDAC3 lentivirus se recogieron en el día 3 después de la transfección y se almacenaron a -80 ° C. Para la infección por lentivirus, 2 × 10
5 células HCT116 se infectaron con shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 o lentivirus shHDAC3 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1.
Pacientes y Preparación de Muestras
las muestras de tejido tumoral y tejido normal adyacente de dos puntos se obtuvieron de 14 pacientes que han sido diagnosticados patológicamente cáncer de colon y fueron sometidos a resección quirúrgica en el hospital de la Universidad Nacional de Taiwán. Las muestras de tejido se trituraron y luego se sometió a ultrasonidos en el tampón de lisis (Tris-HCl, pH 7,4, EGTA 1 mM, NaCl 150 mM, 50 5% de Triton X-100) con inhibidores de la proteasa. Las muestras se microcentrifugaron para eliminar los restos más grandes y se sometieron a análisis de Western.
cromatina ensayo de inmunoprecipitación
Las células fueron tratadas con 5 M SAHA durante 6 horas y reticulado con 1,42% de formaldehído durante 15 min. Las células en dos placas de 10 cm se rasparon en 1 ml de PBS frío, se centrifugaron, y se lisaron en 1 ml de tampón IP (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, EDTA 5 mM, 0,5% Nonidet P-40 y 1% de Triton X-100) que contiene inhibidores de proteasa (1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, leupeptina 1 mM y 1 mM de aprotinina). El sedimento nuclear se resuspendió en tampón de IP y se sonicó para cizallar la cromatina. Los lisados sonicados se immunoprecipited con anticuerpos contra SP1, AcH3, ACH4, H3K4me2, CBP y HDAC3, respectivamente y los complejos inmunes fueron recuperados con proteína A-Sepharose (Roche). El ADN del ADN y la entrada inmunoprecipitadas se extrajo mediante incubación con 100 l de 10% Chelex (Bio-Rad), hirviendo para invertir la reticulación, y centrifugando para eliminar suspensión Chelex. PCR en tiempo real se realizó con el ADN purificado utilizando los siguientes cebadores: A: 5 'GTGAAAAACCCCACCGTTC-3' y 5'-TCTGAAGGGGAGCAACCTTA-3 '; B: 5'-AAGCTTCCGCGAGTTTCC-3 'y 5'-GAGGCTAAGTGTCCCACTGC-3'; C: 5'-ACCCTGGCACAGATTTGG-3 'y 5'-TGAGGAGTTAATTTCCGAGAGG-3'; D: 5'-CCAGTATTGATCGGGAGAGC-3 'y 5'-TTCCTCCAGAGCCCGACT-3'; E:. CTGAGGAAGGAACCCAAAAA 5'-3 'y 5'-GGGAGGTCCTCTCAGAA AGC-3'
El análisis estadístico
experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se presentan como media ± SE. Se utilizó la prueba t de dos el de Student para calcular la significación estadística entre el grupo
Resultados
inhibidores de HDAC interrumpen el EGF señalización a través de silenciamiento de la expresión del receptor de EGF (EGFR)
Para examinar el efecto antitumoral de HDACi en el cáncer colorrectal, el tipo salvaje KRAS (WiDr y HT29) y células mutantes KRAS (HCT116 y SW480) se trataron con SAHA o cetuximab durante 48 horas, y se midió la viabilidad celular. SAHA redujo la supervivencia de estas células en una forma dependiente de la dosis (Fig. 1A), lo que sugiere la independencia del estado de KRAS en la actividad antitumoral de HDACi. Por el contrario, cetuximab tuvo poco efecto en la viabilidad celular (Fig. 1A). Este resultado es consistente con el estudio previo que células de cáncer colorrectal tratados con cetuximab murieron más eficientemente por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) que está ausente en
vitro
sistema en [19]. Desde EGFR desempeña un papel importante en la CRC, la capacidad de su ligando para activar la señal de aguas abajo en las células mutantes KRAS se examinó. EGF activa tanto Akt y ERK fosforilación en células HCT116 y la activación de ERK inducida en células SW480 (Fig. 1B), lo que indica que la mutación KRAS no tiene plenamente sobre la activación de ERK mediada por ligando y también impling la importancia de EGFR en células mutantes KRAS . Por otra parte, el tratamiento previo con inhibidores de HDAC TSA, SAHA y, interrumpe la ERK estimulada por EGF y la fosforilación de Akt en células HCT116 y la fosforilación de ERK en las células SW480 (Fig. 1C). Puesto que los inhibidores de HDAC bloquearon ambos fosforilaciones Akt y ERK, el componente muy proximal de la señalización EGF podría ser el blanco de HDACi. Por lo tanto, la expresión del receptor de EGF se examinó en primer lugar. Después del tratamiento con TSA, la expresión de EGFR se redujo en HCT116, SW480, y las células HT29. Para identificar si esto es un fenómeno común, se utilizaron células originadas a partir de diferentes órganos. Después del tratamiento con TSA, la expresión de EGFR reducida también fue visto en la piel humana (A431) y de mama (MDA-MB468) las células cancerosas (Fig.1D).
HCT116, SW480, WiDr y células HT29 (A) se mantuvieron en DMEM con 1 mg /ml de glucosa y se trató con 0,1, 1, 10 mg /cetuximab ml o 1, 3, 5 M SAHA la supervivencia celular se midió por el ensayo MTT después de 48 horas de tratamiento las células HCT116 y SW480 (B) eran privaron de suero durante 24 horas y después se estimularon con 1 M EGF para, 1, 5, 15, 30 y 60 minutos. células HCT116 y SW480 (C) se pre-incubaron con 0,5, 1 TSA M o 5 M SAHA durante 24 horas y después se estimularon con EGF durante 5 minutos. (D) HCT116, SW480, células A431 y MDA-MB468 se trataron con 1 mM TSA durante 24 o 36 horas lisado de células enteras se preparó y se sometió a análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para fosfo-Akt, fósforo-ERK, Akt y Erk .
inhibidores de HDAC reducen la expresión de SGLT1 y disminuyen la glucosa intracelular
Además de la señalización EGF, el EGFR se ha informado de que participen en el transporte de glucosa mediante la asociación y estabilización de la transportador de glucosa activo, SGLT1 [13], [20]. Dado que la expresión de EGFR se redujo en HDACi en las células de CRC, también se examinaron los niveles de expresión SGLT1 y glucosa intracelular en respuesta a HDACi. Como era de esperar, TSA redujo la expresión SGLT1 (figura 2A) y la concentración de glucosa intracelular (Fig. 2B). la reposición de glucosa retuvo la glucosa intracelular (Fig. 2C) y células rescatados de la muerte celular inducida por la TSA (Fig. 2D). Estos datos sugieren que la pérdida de EGFR y su socio, SGLT1, podría estar involucrado en el efecto citotóxico de los inhibidores de HDAC.
células HCT116 (A) fueron tratados con 1 mM TSA durante 24, 36 o 48 horas. lisado de células enteras se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para SGLT1, EGFR y actina. (B) Las células se cultivaron en DMEM con 1 mg /ml y se trató con 1 M TSA durante 24 horas. El contenido de glucosa se midió como se describe en Material y método (muestras por triplicado fueron utilizados en cada grupo el asterisco indica una diferencia significativa con p & lt;... 0,05 barras de error indican la media ± SE) (C) Las células fueron cultivadas en DMEM con 1 mg /ml o 4,5 mg /ml de glucosa y se trató con 1, 3 o 5 mM TSA durante 24 horas. Se midió el contenido de glucosa. (D) Las células se cultivaron en DMEM con 1 mg /ml de glucosa y se trataron con 1 o 3 mM TSA. Después de 24 o 48 horas de tratamiento, la glucosa se ajustó a 4,5 mg /ml. La supervivencia celular se midió por el ensayo MTT después de 72 horas de tratamiento con TSA. Los resultados se expresaron como media ± SE de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
Pérdida de EGFR está implicado en la HDAC inhibidor de la citotoxicidad mediada por
inhibidores de HDAC se muestran para ejercer la actividad antitumoral de detener el ciclo celular y la activación de la apoptosis [15]. Consistentemente, SAHA aumentó la población sub-G1 del 7,72% al 17,23% de la población y G2 /M del 16,6% al 24,4% (figura 3A). Para dilucidar el papel de EGFR en la actividad antitumoral de HDACi, las células fueron transfectadas con myc-EGFR y luego tratados con SAHA durante 24 hrs. La sobreexpresión de EGFR-myc etiquetados disminuyó la población sub-G1 y G2 /M población (figura 3A). expresión de p21 inducida por SAHA también fue atenuada por la expresión ectópica de EGFR (figura 3B). Estos datos indicaron que la expresión de EGFR reducido SAHA contribuyó a la detención de la apoptosis y el ciclo celular inducida por SAHA.
(A) las células HCT116 se transfectaron con Myc-EGFR, así como su control de vectores y las células transfectadas se trataron con 5 M SAHA durante 24 horas. Las células fueron fijadas por 70% de etanol y se tiñeron con yoduro de propidio, y la fracción de ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. (B) las células HCT116 se transfectaron con Myc-EGFR, así como su control de vectores y las células transfectadas se trataron con 5 mM SAHA durante 24 horas. lisado de células enteras se prepararon y se sometieron a transferencia de Western usando Ab específico para EGFR, Myc, p21 y la tubulina.
HDACs están implicados en la transcripción de EGFR
Como la cantidad de EGFR proteína se reduce después del tratamiento con HDACi, se examinó la transcripción del gen EGFR. El nivel de ARNm del EGFR se redujo drásticamente después del tratamiento con TSA y SAHA (figura 4A), lo que sugiere HDACi transcripcionalmente regular a la baja la expresión de EGFR. Este efecto fue confirmado por los ensayos de reportero de EGFR. Nuestro resultado mostró que TSA y SAHA disminuyeron significativamente la actividad del promotor EGFR (panel superior figura 4B). Se ha informado de que HDACi disminuyó la estabilidad EGFR mRNA en células de cáncer de mama humano ER-negativo [21]. Por lo tanto, se examinó la estabilidad de EGFR mRNA. El
de novo
transcripción fue detenido por la actinomicina D y el ARNm del EGFR se midió por PCR en tiempo real. La pendiente de la degradación de EGFR mRNA no mostró una diferencia significativa entre basal y tratamiento TSA (Fig. 4B panel inferior), lo que sugiere que HDACi no afectó a la degradación de EGFR mRNA en células de cáncer colorrectal. Para aclarar aún más la participación de las HDAC en la transcripción de EGFR, HDAC1 myc-etiquetados, HDAC2 o HDAC3 se expresó ectópica en las células HCT116, y EGFR mRNA se midió mediante RT-PCR. Un aumento de EGFR mRNA se encontró en todas estas células HDAC-expresión (Fig. 4C panel superior). Por el contrario, desmontables de HDAC1, HDAC2 o HDAC3 por shRNA redujeron la expresión de la proteína EGFR (figura 4c panel inferior). Estos datos indicaron que las HDAC de clase I son cruciales para la expresión de EGFR. La correlación positiva entre EGFR y expresión HDAC3 también se observó en catorce pares de tumor de colon humano y los tejidos normales adyacentes (Fig. 4D)
.
células HCT116 (A) fueron tratados con TSA 1 M o 5 M para SAHA 1 y 8 horas. Se utilizó el ARN total (2 mg) para la RT-PCR y PCR en tiempo real como se describe. (B, panel superior) Las células se trataron con TSA 1 M o 5 M SAHA para 6 horas, a continuación, transfectadas con EGFR-Luc. Las actividades de luciferasa se midieron como se describe en "Material y Método". (B, panel inferior) Las células fueron tratadas con 1 mM TSA durante 4 h antes de la síntesis de ARN se detuvo mediante la actinomicina D (5 mg /ml) durante 0, 2, 4 o 6 h. Se preparó ARN en los puntos de tiempo indicados después de la adición de actinomicina D y los niveles de EGFR mRNA fueron medidos por PCR en tiempo real. (C, panel superior) Las células fueron transfectadas transitoriamente con Myc-etiquetados HDAC1, 2 o 3, respectivamente, y se utilizó el ARN total (2 mg) para la RT-PCR para detectar el nivel EGFR mRNA. (C, panel inferior) Las células fueron transfectadas con shLuc, shHDAC1, shHDAC2 o shHDAC3 por lentivirus como se describe en "Material y Método". Los lisados celulares se recogieron el día 5 después de la transfección y después se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para EGFR, HDAC1, HDAC2 y HDAC3. (D) Los lisados de tejidos de colon normales y malignos humanos emparejados se sometieron a transferencia de Western usando anticuerpos anti-EGFR, anti-HDAC3 y los anticuerpos anti-actina. La correlación entre los niveles de expresión de EGFR y HDAC3 se evaluó mediante los coeficientes de correlación.
SP1 es esencial para la transcripción y EGFR inhibidor de HDAC perturba la unión de SP1 a promotor EGFR
Hay varios SP1 sitios de unión en los promotores de EGFR y nuestros estudios anteriores mostraron que HDACi afecta a la unión de SP1 a ADAMTS1or p21 promotores [22], [23]. Por lo tanto, SP1 puede participar en la expresión de EGFR mediada por HDAC. De hecho, la inhibición de SP1 por mitramicina A (MTM) y siRNA disminuyó significativamente la expresión de EGFR (figura 5A). Por otra parte, MTM reduce drásticamente la actividad del promotor de EGFR (Figura 5B), lo que indica el papel crítico de SP1 en la transcripción del gen EGFR. La unión de SP1 para el promotor de EGFR se volverá a analizar mediante inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP). Cinco pares de cebadores (A, B, C, D y E) fueron diseñados para cubrir uniformemente las regiones (-1200 a 1000 bps) alrededor del sitio de inicio de transcripción (Figura 6A). Nuestros datos muestran que la unión de SP1 a las regiones C y D se redujo significativamente después del tratamiento con SAHA (figura 6B). Además, la acetilación de la histona H3 y H4 en el promotor EGFR se redujo en gran medida, sobre todo en las regiones de sitio de inicio de transcripción en las inmediaciones (figura 6B). También se examinó el estado de metilación de las histonas como H3K4me2, H3K9me3 y H3K27me3. SAHA no cambió la residencia de estos marcadores de metilación en el promotor EGFR a pesar de enriquecido H3K4me2 fue encontrado (figura 6B y datos no presentados). Dado que la acetilación de la histona H3 y H4 se redujo drásticamente después de la inhibición de HDAC, se examinó la ocupación de histona acetiltransferasa (HAT) o HDAC en promotor EGFR. Nuestros resultados mostraron que el reclutamiento de CBP para la región D se redujo significativamente por SAHA (figura 6B). Curiosamente, la unión de la HDAC3 a la región D fue atenuada, también (figura 6B). Estos datos mostraron que la disociación de SP1, CBP y HDAC3 de promotor EGFR al mismo tiempo (figura 7), lo que implica que estas proteínas pueden influir entre sí y afectar a su unión al promotor EGFR.
(A) las células se trataron con 1 M mitramicina a (MTM) durante 18 o 36 horas, a continuación, se prepararon los lisado celular total. Las células fueron transfectadas con 0, 400 o 800 pmol SP1 siRNA, a continuación, se prepararon los lisados de células totales y se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para EGFR y SP1. (B) Las células se transfectaron con EGFR-Luc y luego tratados con 0,1, 1 o 5 M mitramicina A (MTM) durante 16 horas. Las actividades de luciferasa se midieron como se describe en "Material y Método". Los resultados se normalizaron a la actividad luciferasa de Renilla y se expresaron como la media ± SE. Durante tres experimentos independientes realizados por triplicado.
(A) Ilustración del promotor EGFR y el cebador chip. (B) Las células se trataron con SAHA durante 8 horas, después se fijaron, se sonicó y se sometieron a inmunoprecipitación de cromatina utilizando Ab específica contra SP1 y la histona H3 acetilada. Histona H4 acetilación H3K4 dimethylation, CBP y HDAC3 el promotor de EGFR se midió mediante ensayos de chip como se describe en "Material y Método".
En el estado basal, HDAC3, CBP y SP1 ambos fueron reclutados a la región promotora y responsable de la transcripción de EGFR (a).