Extracto
Antecedentes
Los marcadores que pueden discriminar entre tumores de próstata son indolentes y agresivos necesario. Se estudió la metilación de genes en el tejido no neoplásico adyacente al tumor de próstata (NTAT) en asociación con la mortalidad por cáncer de próstata.
Métodos
A partir de dos cohortes de pacientes con cáncer de próstata consecutivos diagnosticados en una sala de patología en Turín, Italia, se seleccionaron 157 pacientes con NTAT disponibles y los siguió durante más de 14 años. Se obtuvo el ADN de NTAT en los tejidos tumorales de próstata incluidos en parafina y sonda utilizada PCR en tiempo real para analizar la metilación de la glutatión S-transferasa (GSTP1) y los promotores del gen poliposis adenomatosa coli (APC).
la prevalencia de la APC y la metilación GSTP1 en el NTAT está entre el 40 y el 45%. Se asocia con la metilación en el tejido del tumor de próstata de los mismos dos genes, así como con una alta puntuación de Gleason. La razón de riesgo (HR) de mortalidad por cáncer de próstata fue de 2,38 (intervalo de confianza del 95%: 1,23 a 4,61) para APC metilación, y 2,92 (1,49-5,74) para la metilación GSTP1 en NTAT. Se cambió a 1,91 (1,03-3,56) y 1,60 (0,80-3,19) tras ajustar por puntuación de Gleason y la metilación en el tejido del tumor de próstata. Comparación de 2 vs 0 genes metilados en NTAT reveló un CR de 4,30 (2,00-9,22), que disminuyó a 2,40 (01/15 a 05/01) después del ajuste. Los resultados fueron más fuertes en los primeros 5 años de seguimiento (HR ajustada: 3,29, IC del 95%: 1,27 a 8,52).
Conclusiones
Los cambios en la metilación del gen son un evento temprano en la próstata carcinogénesis y puede desempeñar un papel en la progresión del cáncer. metilación de genes en NTAT es un posible marcador pronóstico para ser evaluado en estudios clínicos
Visto:. Richiardi L, Fiano V, C Grasso, Zugna D, L Delsedime, Gillio-Tos A, et al. (2013) La metilación de GSTP1 APC y en el tejido no neoplásico adyacente al tumor de próstata y la mortalidad por cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e68162. doi: 10.1371 /journal.pone.0068162
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: November 26, 2012; Aceptado: 29-may de 2013; Publicado: 9 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Richiardi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue parcialmente apoyado por la Asociación italiana para la Investigación del cáncer (AIRC), y la región del Piamonte. Los donantes no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación, análisis e interpretación de datos, en la redacción del manuscrito, y en la decisión de enviar el manuscrito para su publicación
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
el cáncer de próstata es el tumor más frecuente en hombres en muchas poblaciones, con una incidencia bruta de 120-130 por cada 10
5 en Europa y los Estados Unidos [1]. Más del 65% de los cánceres de próstata se diagnostica después de 70 años de edad, y la mayoría de estos pacientes morirán de los acontecimientos que compiten. La incidencia del cáncer de próstata ha aumentado dramáticamente desde la introducción de la prueba del antígeno prostático específico (PSA) al final de la década de 1980 [1]. revisión basada en PSA oportunista para el cáncer de próstata está muy extendida, aunque todavía se está debatiendo su capacidad para disminuir la mortalidad. Las conclusiones de un estudio reciente realizado por el Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de los Estados Unidos no apoyaron revisión basada en PSA ya que los beneficios no fueron juzgados supera los daños [2].
La alta prevalencia de cáncer de próstata indolente y el uso revisión basada en PSA de oportunista para el cáncer de próstata puede conducir a un exceso de tratamiento. Actualmente no hay un consenso sobre si la prostatectomía radical o la vigilancia activa se deben ofrecer como el tratamiento de elección, especialmente cuando se trata de pacientes con un cáncer de próstata de bajo riesgo [3], [4]. Por tanto, es necesario para comprender mejor los determinantes de la progresión del cáncer de próstata, y para identificar marcadores de pronóstico para el cáncer de próstata agresivo que puede ser detectado en el momento de una primera biopsia diagnóstica. Un número de grupos, incluido el nuestro, han investigado los cambios epigenéticos en el tejido del tumor de próstata en un esfuerzo por identificar posibles marcadores de pronóstico [5] - [8]. En particular, varios estudios han evaluado la presencia de la isla CpG (agrupaciones de dinucleótidos de una citosina y una guanosina) metilación en el promotor de algunos genes específicos en asociación con recurrencia bioquímica o la mortalidad por cáncer de próstata. En nuestro estudio anterior, encontramos que la APC (poliposis adenomatosa coli) metilación en el tejido del tumor de próstata se asoció con un aumento del riesgo del 50% de la mortalidad por cáncer de próstata. Unos pocos estudios apoyan esta conclusión [9] - [12], y otros encontró un papel pronóstico para la metilación en otros genes [13], [14]. La metilación de GSTP1 (glutation S-transferasa), el promotor es el investigó más extensamente cambio epigenético en el cáncer de próstata. Se puede encontrar en más de 80% de los cánceres de próstata, con una prevalencia menor en el tejido benigno [15]; que está fuertemente asociado con una puntuación de Gleason pero su papel pronóstico independiente de la puntuación de Gleason es claro [5].
En el presente trabajo se investigó si los cambios de metilación en el tejido no neoplásico adyacente al tumor de próstata (NTAT) están asociados con el pronóstico del cáncer de próstata. Los tumores de próstata son a menudo multifocal, y un número de estudios observaron cancerisation campo (es decir, alteraciones en el tejido normal adyacente al tumor) en el cáncer de próstata. Los estudios que comparan NTAT con tejido de la próstata benigna y /o tejido de cáncer de alteraciones identificadas en la expresión de genes [16] - [20], el contenido de ADN de los telómeros [21], el ADN mitocondrial [22], y la prevalencia de la metilación en algunos genes, incluyendo APC [23 ], GSTP1 [24], [25] y RARβ2 [23], [24]. Los mecanismos que subyacen a estas alteraciones no se conocen del todo (ya sea de efectos carcinógenos, la expansión lateral del tumor, o la influencia del tumor en el tejido adyacente extendida), pero cancerisation terreno que tiene relevancia clínica. Sin embargo, pocos de los estudios anteriores sobre este tema incluyen el seguimiento de la mortalidad, lo que dificulta la evaluación de la importancia pronóstica de alteraciones en NTAT. Este estudio se centra en la metilación de GSTP1 y APC en el tejido no neoplásico. Su objetivo es evaluar si estos cambios moleculares son candidatos potenciales como marcadores de pronóstico mediante la evaluación de su asociación con la mortalidad por cáncer de próstata.
Pacientes y métodos
Población de estudio
El estudio es anidado en dos cohortes de un total de 459 pacientes consecutivos con cáncer de próstata que se sometieron a una biopsia, prostatectomía radical o resección transuretral de la próstata (RTUP) entre 1982 y 1988, o entre 1993 y 1996, en la sala de patología del hospital de San Juan Bautista, en Turín , Italia. Los detalles de estas dos cohortes se han publicado anteriormente [5]. Se obtuvo el ADN de los tejidos tumorales de próstata incluidos en parafina almacenados para todos los 459 pacientes. El ADN se analizó para APC, GSTP1 y RUNX3 (factor de transcripción relacionado con Runt-3) la metilación de genes utilizando modificación con bisulfito y PCR específica de metilación [5]. La información sobre la edad, el origen del tejido del tumor de próstata, la residencia y el grado tumoral se disponía de informes de patología. Todas las diapositivas originales de diagnóstico correspondientes a los PET utilizadas en los análisis moleculares fueron identificados y re-evaluados por un único uropathologist (LD) con el fin de asignar un grado de Gleason uniforme de acuerdo con las directrices actuales. No teníamos información sobre los niveles de PSA u otras características clínicas. Inicialmente, las dos cohortes fueron seguidos hasta 2007 [5], pero, para el presente estudio, se extendieron el seguimiento hasta el 8 de agosto de 2010. Se utilizó la información de los certificados de defunción para clasificar la causa de la muerte, ya sea como el cáncer de próstata, o otras causas.
se analizaron las diapositivas de diagnóstico de los pacientes en las dos cohortes para identificar NTAT. Se excluyeron los
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pacientes desde la década de 1980, cuya diapositivas de diagnóstico incluido el tejido neoplásico y principalmente fueron asociados a problemas técnicos considerables en el aislamiento de NTAT sin contaminación a partir de tejido del tumor de próstata. Todas las otras fuentes de tejido, a saber turps (n = 11) y prostatectomías radicales (n = 23) a partir de la década de 1980, y biopsias (n = 164), turps (n = 45) y prostatectomías radicales (n = 34) a partir de la década de 1990, fueron incluidas en la presente evaluación. El uropathologist identificó y puso de relieve un área de NTAT en cada diapositiva de diagnóstico. Se excluyeron las áreas de neoplasia intraepitelial prostática. Si más de un área de NTAT estaba presente, el patólogo eligió el más alejado del tumor. Si había más de un área que se cumple este criterio, se eligió el área más grande. Las porciones seleccionadas de NTAT tenían al menos 1,5 mm de distancia de las células tumorales, de acuerdo con estudios previos sobre efecto de campo de la epigenética en el cáncer de próstata [23]. Esta distancia mínima se mantiene también cuando el material de tejido era relativamente pobre (es decir, en las biopsias); de lo contrario el paciente fue excluido del estudio. Para diapositivas incluyendo fragmentos separados físicamente del tejido (97 pacientes), ambos de los NTAT y tejido tumoral, la distancia en vivo entre los fragmentos era desconocida, aunque lo más probable era más grande que 1,5 mm. Para algunos pacientes, algunas de las diapositivas incluidas NTAT solamente; estas diapositivas fueron incluidos en el estudio.
Al final de este proceso, NTAT se identificó en 157 pacientes, todos los cuales fueron incluidos en el presente estudio. El proceso de selección de los originales 459 pacientes actuado de manera diferente dependiendo de la fuente del tejido tumoral y en la cohorte (1980 o 1990 cohortes). En concreto, se seleccionaron 91% de los pacientes originales que se sometieron a una RTU o una prostatectomía radical en cualquiera de las dos cohortes, el 33% de los que se sometieron a una biopsia en la cohorte de 1990 y, de manera coherente con nuestros criterios a priori, ninguna de las personas que se sometió a una biopsia en la cohorte de 1980. Esta selección, siendo al inicio del estudio (es decir, antes de la ocurrencia del resultado), es poco probable que haya introducido un sesgo en las estimaciones de asociación ([26]).
Cuatro y cinco fueron cortados (10 micras de espesor) secciones secuenciales del tejido incluido en parafina de los 157 diapositivas de diagnóstico seleccionados. Las rodajas se superponen exactamente con las diapositivas en la que el uropathologist destaca la zona NTAT seleccionado. Ellos fueron disecados manualmente, la eliminación de la porción de NTAT con una hoja delgada desechable, que fue cambiado entre cada sujeto. El ADN se extrajo con éxito para todos los sujetos del estudio
El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital San Juan Bautista -. hospital CTO /CRF /María Adelaida de Turín (Prot N. 0.021.727, el 19 de marzo de 2007. ). datos anónimos sobre la metilación de genes están disponibles bajo petición a los investigadores calificados para el propósito de la investigación académica, no comercial.
Los análisis moleculares
El QIAamp comercial ® Kit de ADN de tejidos FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania) se utilizó para la extracción y purificación de ADN genómico. La adecuación de ADN se comprobó mediante la amplificación por PCR del gen de β-globina de limpieza [27].
Las muestras de ADN genómico, incluidos los controles positivos para el estado metilado y no metilado, fueron sometidos a modificación con bisulfito usando Epitect bisulfito Kit (Qiagen , Hilden, Alemania).
Después de la modificación con bisulfito, un ensayo de PCR con sondas específicas para determinar el estado de metilación de APC y promotores GSTP1 se utilizó. Este ensayo permite la detección de la citosina metilada con una alta sensibilidad (1 citosina metilada de 10.000 citosinas no metiladas [28]). Cada reacción de PCR contenía: 1 x tampón de PCR, 5.5 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, 600 Nm de ambos cebadores, 200 nm y 80 nm de la sonda específica para la metilación de la APC y promotores GSTP1, respectivamente, 5 U de Taq, 2 l de ADN modificado con bisulfito de sodio y agua destilada
2O para obtener un volumen final de 25 l. La reacción se lleva a cabo en un termociclador (iCycler, BioRad, CA, EE.UU.) con las siguientes condiciones de PCR: 1,30 minutos a 95 ° C, 15 segundos a 95 ° C, 1 minuto a una temperatura de recocido-cebador específico (60 ° C ) durante 50 ciclos, y 10 minutos a 72 ° C. El ADN CpGenome universales metilado (Intergen Co., Oxford, Reino Unido) se utilizó como control positivo. Controles negativos se incluyen en todas las reacciones.
Los cebadores y sondas fueron elegidos en base a secuencias publicadas (Tabla 1) [29], [30]. Las sondas dirigidas cuatro islas CpG en cada gen.
La información sobre APC, GSTP1 y la metilación de RUNX3 en el tejido del tumor de próstata que ya estaba disponible en nuestro estudio anterior [5]. Sin embargo, en los análisis de la anterior utilizamos PCR específica de metilación en lugar de la sonda de PCR en tiempo real. Puesto que este último método tiene una sensibilidad superior, vuelto a probar todas las muestras de tejido del tumor de próstata en los que APC o GSTP1 fue metilado, para que los resultados de tejido del tumor de próstata y NTAT más comparables. La metilación de RUNX3 no fue re-evaluado porque analiza en el NTAT sólo interviene APC y GSTP1 y el potencial efecto de confusión adicional de metilación de RUNX3 en el tejido tumoral que se espera sea limitado. En consonancia, la metilación del tejido tumoral en RUNX3 no se ha considerado más adelante en este documento.
Análisis estadísticos
El uso de regresión logística multivariable, se estimó el odds ratio de prevalencia de APC o metilación GSTP1 en NTAT para seleccionar características (puntuación de Gleason, la metilación en el tejido del tumor de próstata).
El efecto de NTAT metilación en cada uno de los dos genes sobre la mortalidad acumulada de cáncer de próstata se investigó teniendo en cuenta los riesgos de la competencia, y las diferencias en la mortalidad se evaluaron con prueba de Gray [31]. Utilizamos modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox para estimar la razón de riesgo (HR) de la mortalidad por cáncer de próstata en asociación con la metilación en NTAT. la duración del seguimiento fue utilizado como la escala de tiempo y la edad al momento del diagnóstico se introdujo como una variable continua. Tanto los controles gráficos y pruebas formales, basados en residuos de Schoenfeld (p & gt; 0,14), indicaron que se cumplió el supuesto de riesgos proporcionales. APC y GSTP1 metilación en NTAT se analizaron en modelos separados, así como en un modelo de investigar el número de genes metilados, de 0 a 2. Todos los modelos se llevaron a cabo tanto no ajuste, y ajustar por puntuación de Gleason y la presencia de GSTP1 o APC . metilación en el tejido del tumor de próstata
Desde marcadores de pronóstico se necesitan principalmente para tumores de riesgo bajo e intermedio, y en el momento del diagnóstico antes de decidir acerca de la prostatectomía, se realizaron dos análisis de subgrupos limita a: i) los sujetos de estudio con una puntuación de Gleason de 7 o menos, o ii) los sujetos que fueron sometidos a biopsia. También se evaluó la asociación de metilación en NTAT con la mortalidad a corto plazo mediante la realización de análisis separados restringidas a los primeros 5 años de seguimiento.
Resultados
Características seleccionadas de los 157 sujetos de estudio son reportado en la Tabla 2. la mayoría de los sujetos fueron diagnosticados en la década de 1990, con una supervivencia media de 6,79 años. De los 128 sujetos que murieron durante el seguimiento, 43 hombres murieron de cáncer de próstata. La fuente de tejido fue distribuido en partes iguales entre la biopsia, la RTUP y la prostatectomía radical. Hubo una alta prevalencia de la metilación de APC (82,2%) y la metilación GSTP1 (84,1%) en el tejido del tumor de próstata.
La metilación prevalencia en NTAT fue del 43,9% para APC y el 42% para GSTP1. Como se resume en la Tabla 3, el patrón de metilación en NTAT correlacionada con la que en el tejido tumoral de próstata: la metilación en cualquiera de los dos genes en el tejido de tumor de próstata se asoció con la metilación del mismo gen en NTAT. Gleason fue también un determinante importante de la APC y la metilación GSTP1 en NTAT.
Como se muestra en la Figura 1 NTAT metilación tanto en APC (Fig. 1a) y GSTP1 (Fig. 1b) se asocia con un mayor riesgo de mortalidad a largo plazo de cáncer de próstata. Las razones de riesgo para la presencia de metilación se incrementaron en cerca de tres pliegues (Tabla 4). Estos se atenuaron después del ajuste de la metilación en el tejido del tumor de próstata, y después del ajuste para la puntuación de Gleason (HR = 1,91 IC del 95%: 1,03 a 3,56 para APC y HR = 1,60; IC del 95%: 0,80 a 3,19 para GSTP1). El análisis por número de genes metilados en NTAT reveló una asociación positiva con la mortalidad por cáncer de próstata (valor de p para la tendencia = 0,001): HR bruta de mortalidad por cáncer de próstata durante 2 vs 0 genes metilados fue IC 4,30 (95%: 2,00 -9,22), que disminuyó a CI 2,40 (95%: 01/15 hasta 05/01) después de ajustar por tanto la metilación de genes en el tejido del tumor de próstata y la puntuación de Gleason (Tabla 5). Asociaciones similares fueron encontrados cuando los análisis se limitan a estudiar sujetos con puntuación de Gleason de 7 o menos. No se encontró evidencia de efecto modificación introducida por fuente de tejido tumoral (valor de p = 0,37). Resultados restringido a los sujetos que se sometieron a biopsia se presentan en la Tabla 5. Tabla 5 también muestra los resultados de los análisis restringidos a los primeros 5 años de seguimiento. La comparación de 2 vs 0 genes metilados dio un HR crudo de 5,71 (IC del 95%: 2,23 a 14,6) y 3,29 (IC del 95%: 1,27 a 8,52) después del ajuste de la metilación de genes en el tejido del tumor de próstata y la puntuación de Gleason
Discusión
Se encontró una fuerte asociación entre la presencia de APC y la metilación GSTP1 en NTAT y mortalidad a largo plazo y la mortalidad a los 5 años del cáncer de próstata. La asociación se mantuvo después del ajuste para la puntuación de Gleason y en los análisis restringidos a estudiar sujetos con una puntuación de Gleason de siete o menos y en los pacientes que fueron sometidos a biopsia.
Estos resultados apoyan la hipótesis de que la hipermetilación del ADN es un evento temprano en la carcinogénesis que pueden ser detectados antes de que el tumor se vuelve evidente morfológicamente; también apoyan la noción de cancerisation campo en el cáncer de próstata y su papel en la progresión del cáncer de próstata. El hecho de que el patrón de metilación es similar en NTAT y en tejido de tumor de próstata sugiere que las alteraciones que se encuentran en estos tejidos son la consecuencia de mecanismos similares, incluyendo una expansión o influencia del tumor o efectos difusos de los mismos carcinógenos lateral.
Se estudió la metilación de GSTP1 y APC debido a su implicación en vías de control celular pivotales cruciales. GSTP1 es un gen "cuidador", evitando el daño genómico mediada por agentes carcinógenos u oxidantes. Los defectos en los genes "vigilante" (es decir, hipermetilación) pueden favorecer la susceptibilidad al desarrollo del cáncer. Además GSTP1 puede interferir con el crecimiento o la supervivencia de las vías de señalización, al actuar como un gen supresor de tumor [32]. Análogamente APC es un gen supresor de tumores bien caracterizado, inicialmente identificado en el cáncer colorrectal, que juega un papel integral en la ruta de Wnt de señalización y en la adhesión intercelular. Interactúa con beta-catenina, una proteína implicada en la adhesión celular y la motilidad. La regulación de la beta-catenina impide que los genes que estimulan la división celular y el crecimiento excesivo de células [33].
En nuestro estudio, hemos utilizado la mortalidad por cáncer de próstata como el resultado (a diferencia de la recurrencia bioquímica) y tuvimos un tiempo muy largo el tiempo de seguimiento. Se incluyeron tanto los sujetos de estudio con un bajo riesgo de cáncer de próstata, y los que tienen cáncer de próstata más agresivo. La fuente de tejido del tumor de próstata incluye biopsias, aguarrás y prostatectomías radicales.
La prevalencia de la metilación en NTAT que hemos encontrado es similar o superior a la detectada en estudios previos, los cuales, sin embargo, muestran la variación inter-considerable estudio [23] - [25], [34], [35]. Todas estas estimaciones no son directamente comparables, ya que los estudios utilizaron protocolos diferentes para el muestreo de tejidos y técnicas moleculares diferentes. Nuestros métodos moleculares dirigidas para maximizar la sensibilidad y seguimos un protocolo sencillo para obtener rebanadas de NTAT con un menor riesgo de contaminación a partir de tejido del tumor de próstata. Aunque no podemos excluir
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que la contaminación se produjo en algunas muestras, su frecuencia era a lo sumo, limitado, lo que se demuestra por el hecho de que la asociación entre la metilación en NTAT y la mortalidad por cáncer de próstata se mantuvo prácticamente sin cambios después de ajuste para la metilación en el tejido tumoral de próstata. la presencia de metilación en NTAT había sido debido a la contaminación de metilación en el tejido del tumor de próstata, la asociación entre la metilación en NTAT y la mortalidad por cáncer de próstata habría sido fuertemente reducida después del ajuste.
La principal limitación de nuestro estudio es la falta de información clínica y patológica que no sea la puntuación de Gleason. Además se estudió una población con, en promedio, una mayor mortalidad de cáncer de próstata que serie típico paciente contemporánea. Estas limitaciones dificultan la posibilidad de evaluar el valor pronóstico adicional real de metilación en comparación con NTAT nomogramas se utilizan actualmente. Nuestro estudio es por lo tanto capaz de sugerir un posible papel de methytlation en NTAT en la progresión del cáncer de próstata, aunque la posibilidad para la traducción clínica de este hallazgo requiere más investigación en un entorno clínico mejor definidos. También nos ha faltado información sobre el tratamiento al inicio del estudio, lo que implica que nuestra cohorte incluye un grupo heterogéneo de pacientes, lo que dificulta aún más la traducción clínica directa de nuestros resultados. Sin embargo, el hecho de que la fuente de tejido tumoral (biopsia, prostatectomía radical, RTUP) no era un efecto modificador sugiere que nuestros hallazgos sobre la metilación en NTAT no se explican por la confusión de las heterogeneidades de los pacientes y /o el tratamiento inicial.
la magnitud de la asociación entre la metilación en NTAT y la mortalidad por cáncer de próstata que encontramos es más fuerte que la que normalmente se encuentra para la metilación en el tejido del tumor de próstata [5], [8] - [14]. Aunque se seleccionaron los dos genes que estudiamos
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sobre la base de la evidencia sustancial de su posible papel en la carcinogénesis de próstata, es probable que la información pronóstica adicional se podría obtener por el estudio de un mayor número de genes .
en conclusión, nuestros resultados de APC frecuente y metilación GSTP1 en NTAT y su asociación con la mortalidad por cáncer de próstata apoyan la idea de que los cambios en la metilación del gen son un evento temprano en la carcinogénesis de próstata y desempeñar un papel en la progresión del cáncer . La fuerza de la asociación con la mortalidad por cáncer de próstata y el hecho de que la asociación se mantiene en los pacientes con una puntuación de Gleason de abajo 8 sugieren que el patrón de metilación en NTAT podría ser un posible marcador de pronóstico para el cáncer de próstata a ensayar en estudios clínicos futuros.