Extracto
Humano cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es altamente agresivo, y rápidamente desarrolla resistencia a la terapia . CEP células suelen ser insensible a los glucocorticoides debido a la alteración de la expresión del receptor de glucocorticoides (GR). Esto es importante, como hemos demostrado anteriormente que la expresión de un transgén GR induce la muerte celular
in vitro
, e inhibe el crecimiento del tumor
in vivo
. Sin embargo, el mecanismo subyacente para la pérdida de la expresión de GR es desconocida. La línea de células SCLC, DMS79, tiene una baja expresión de GR, en comparación con líneas celulares no SCLC y células epiteliales bronquiales normales. expresión retroviral GR en las células DMS79 causó la activación de la vía apoptótica como se evidencia por la inducción marcada de la actividad de la caspasa-3. El análisis de metilación del promotor de GR reveló algunas metilación en la 1D, 1E y promotores del gen GR, sin embargo, el promotor 1C constitutivamente activo ubicuo era fuertemente metiladas. En el promotor 1C hubo un aumento altamente significativo en la metilación del ADN en un panel de 14 líneas celulares de SCLC humanos en comparación con un panel mixto de GR que expresa, y las líneas celulares que no expresan, y a células mononucleares de sangre periférica. Además, dentro del panel de líneas celulares de SCLC hubo una correlación negativa significativa vista entre la metilación del promotor 1C, y la expresión de proteínas GR. La inversión de la metilación de genes GR con la inhibición de la ADN metiltransferasa causado un aumento del GR ARNm y la expresión de proteínas en SCLC, pero no las células no-SCLC. Esto dio lugar a aumento de la sensibilidad Gc, disminución de Bcl-2 expresión y el aumento de la actividad de caspasa-3 en células de SCLC. Estos datos sugieren que la metilación del ADN disminuye la expresión de genes GR en las células de SCLC humanas, de una manera similar a la de los genes supresores de tumores convencionales
Visto:. Kay P, Schlossmacher G, Matthews L, Sommer P, Singh D, Blanco A, et al. (2011) La pérdida de la expresión del receptor de glucocorticoides por la metilación del ADN previene la apoptosis inducida por glucocorticoides en humano de células pequeñas células cancerosas de pulmón. PLoS ONE 6 (10): e24839. doi: 10.1371 /journal.pone.0024839
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 22, 2010; Aceptado: 22 de agosto 2011; Publicado: 3 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Kay et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación Biomédica INDH Manchester y la Universidad de Manchester asociación Alumni. PK y GS han recibido un premio de beca BBSRC (http://www.bbsrc.ac.uk). GS también tiene una beca dotada Barbara Mawer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los cambios en el estado epigenético de genes son importantes en muchas enfermedades humanas, pero particularmente en el cáncer [1]. Algunos de éstos están mediadas por los cambios en la expresión y la actividad de metiltransferasas de ADN, DMNT1, DNMT3A y DNMT3B [2], [3]. Las células cancerosas se caracterizan por tener hypermethylated islas CpG asociadas con genes supresores de tumores [1], y DNMT1 es informado de que sobre-expresan en pacientes con cáncer de pulmón que fuman [4]. Estudios recientes han identificado que un carcinógeno humo de tabaco, nitrosamina 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) 1-butanona (también conocido como cetona nicotina nitrosamina derivada; NNK) no sólo induce mutaciones de genes, sino que también aumenta la hipermetilación de múltiples los promotores de genes supresores de tumores, incluyendo la ciclina dependiente 2A inhibidor de quinasa (p16INK4a), la muerte asociada a la proteína quinasa 1 (DAPK1), y el receptor de ácido retinoico b (RARB) [4]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo de carcinoma humano de pulmón de células pequeñas, y el tabaquismo se asocia con la metilación en sí de más de 20 genes supresores de tumores [5], [6].
Hay muchos factores que pueden afectar a la sensibilidad de glucocorticoides, incluyendo la genética la variación en el locus del gen GR, y la expresión de las proteínas que interactúan [7] - [10]. Hemos demostrado anteriormente que las líneas celulares de SCLC humanos son resistentes a glucocorticoides (GC) hormonas y fármacos y que esta resistencia se debe a la alteración de la expresión de GR [11], [12]. Restauración de la expresión de GR en las células mediante transfección o transducción viral es suficiente para restaurar la sensibilidad Gc [12]. Sin embargo, más importante aún, la restauración de la expresión de GR también es suficiente para inducir la apoptosis de las células de SCLC tanto in vitro [13], y también en un modelo de xenoinjerto [14]. Esto plantea la posibilidad de que GR es un nuevo gen supresor tumoral para el CPCP, y que la pérdida de la expresión de GR está implicada en la patogénesis de SCLC.
El gen GR (NR3C1) es una expresión ubicua, ligando activado factor de transcripción, una miembro de la superfamilia de receptores nucleares. Hay un gen de copia única en el cromosoma 5, pero su estructura es compleja, y se sabe relativamente poco acerca de cómo se regula la transcripción de la misma [15]. La transcripción es controlada por 9 promotores, cada uno asociado con un sitio de inicio de la transcripción alternativo. Siete de estos promotores están agrupados juntos en una isla CpG, una característica común de los genes del hogar [16]. Todas las transcripciones generan auténtica proteína GR de larga duración como el sitio de inicio de la traducción se encuentra en el exón 2.
común
El GR es activado por las hormonas Gc de la corteza suprarrenal, bajo un estricto control del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA). Este eje está bajo el control de retroalimentación en el hipocampo y el hipotálamo a través de la activación de la proteína GR expresado en estos sitios. La variabilidad en la rata tono eje HPA se ha atribuido a cambios en la expresión del hipocampo GR, regulada por metilación alterada del promotor GR de rata exón 1-7 [17]. Esta se encuentra, como en el ser humano, en la isla CpG aguas arriba. Estudios más recientes han examinado el estado de metilación de un número de promotores de GR humanos alternos en las células mononucleares de sangre periférica [16]. Estos estudios han revelado extensa, y la metilación variable.
hipocampo y GR hipotálamo juega un papel clave en el control de retroalimentación negativa del eje hipotálamo-hipofisario-suprarrenal. La expresión alterada de GR en el cerebro resulta en la re-configuración del tono de este eje neuroendocrino y esto está asociado con la metilación alterada del factor de crecimiento nervioso inducible-A (NGFI-A, o Krox, EGR1) sitio de unión en el promotor exón rata 1,7 , homóloga al promotor exón 1F humano [17] - [19]. Esta alteración controlada metilación en GR expresión tiene por resultado consecuencias para todo el organismo, mediante la regulación de la producción de glucocorticoides suprarrenales.
En este estudio se analizó el patrón de metilación del promotor GR en las células de SCLC humanas, y demostramos que la inversión de los grupos metilo marcas de aumento de la expresión de proteína GR, y la función. Por otra parte, hemos identificado una correlación negativa entre los RG 1C promotor de la metilación y la expresión de la proteína GR a través de un panel de líneas celulares de SCLC humanas, y células de control humanos.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y mantenimiento
células de carcinoma humano A549 epiteliales de pulmón, células HEK-293 células humanas embrionarias de riñón, células de carcinoma cervical humano HeLa y células de osteosarcoma humano U20S (Colección Europea de cultivos celulares, Wiltshire, Reino Unido) fueron todos cultivaron en DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Invitrogen).
no-pequeñas líneas de cáncer de pulmón de células NCI-H358 y -H727 (Colección Europea de cultivos celulares, Wiltshire, Reino Unido) y NCI-H23, -H441 , -H1299 (American Type Culture Collection, EE.UU.) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con FCS al 10% y HEPES 10 mM según lo recomendado por el proveedor.
cáncer de pulmón microcítico (SCLC) utilizan líneas celulares en este estudio fueron las líneas celulares de la 10'COR 'Cor L24, L27 Cor, Cor L31, L32 Cor, Cor L42, L47 Cor, Cor L51, L88 Cor, Cor L99 y L103 Cor. También utilizados fueron DMS 79, DMS 153, HC12 y HX 148. Todas estas líneas celulares fueron derivadas de pacientes con SCLC patológicamente confirmado [20], [21] con la excepción de Cor L32, que se derivó de un paciente con poco diferenciado carcinoma epidermoide de pulmón. Esta línea celular hizo sin embargo posean las características de SCLC [21]. Todas las líneas celulares de SCLC se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de FCS y HEPES 10 mM, como se describe anteriormente [12].
células mononucleares de sangre periférica humana se obtuvieron de donantes sanos locales, según aprobación LCI 09 /H1013 /6.
normal epitelio bronquial humano se recogerán a partir de muestras de resección pulmonar después de la cirugía para el cáncer de pulmón, con el consentimiento del paciente completa e informada.
Tratamientos
Cuando sea apropiado, las células se trataron con vehículo o con 100 nM de dexametasona (Sigma-Aldrich) durante 24 horas a 37 ° C, 5% C0
2 antes de la lisis. En algunos experimentos, las células fueron incubadas con vehículo o 5 M 5'Azadeoxycytidine (Sigma-Aldrich) durante 72 horas o 5 días. Después de tratar con 5'Azadeoxycytidine se trataron algunas células durante 72 horas con 100 nM de dexametasona.
El análisis por inmunotransferencia
Las células se lisaron usando 1 x tampón RIPA (base 100 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% de Igepal, 2,5% desoxicolato de sodio, EDTA 1 mM) .Este tampón también contenía inhibidores de la proteasa (Roche). Después de la centrifugación durante 30 min a 10.000
g
se recogieron los sobrenadantes y se ensayaron para el contenido de proteína usando un ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las muestras se diluyeron en tampón de carga [0,125 M TrisCl (pH 6,8), 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 20% de glicerol, 0,2% β-mercaptoetanol, 0,001% bromophenolblue]. Los extractos celulares (50 g) se analizaron a continuación por SDS-PAGE y transferencia Western como se describe [22], [23]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron el monoclonal de ratón anti-hGR (Clon 41, 1:2500), que se une en la región N-terminal de GR (BD Biosciences), policlonal de conejo anti-hGR (P-20, 1:500) generado contra un mapeo de péptidos en el extremo C-terminal de GRα (Santa Cruz) y el monoclonales de ratón α-tubulina (1:5000) (Sigma-Aldrich). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron la peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón (1:5000) y anti-conejo (1:5000) (GE Healthcare). Para cuantificar los niveles de proteína, análisis densitométrico se llevó a cabo. Las transferencias se escanean y la densitometría de cada banda fueron analizados utilizando el software ImageJ. El control interno de carga (αTubulin) también fue cuantificada y los resultados se normalizaron en contra de estas lecturas. Este análisis se llevó a cabo en 3 manchas separadas para cada experimento y la media calculada.
Reporter Gene Ensayos
Las células fueron co-transfectadas con 2 g de un constructo TAT3-luciferasa [13] y 0,5 g de un pCMV
Renilla
constructo de luciferasa (para corregir la eficiencia de transfección), utilizando Fugene 6 (Roche). En algunos casos, las células también fueron transfectadas con 1 g de un vector de expresión de GR (pFUNC1-GR-eYFP) [13]. Las células se trataron con Dex como se ha descrito antes ensayos de luciferasa se llevaron a cabo utilizando el sistema de ensayo Dual Luciferase Reporter (Promega), como se describe anteriormente [8].
Las infecciones retrovirales
pFUNC1-eYFP o pFUNC1 -GR-eYFP se transfectaron en HEK293 para la producción retroviral utilizando Fugene HD (Roche, Reino Unido), como un reactivo de transfección a una relación de 03:02 reagent:DNA. La infección de las partículas retrovirales en células DMS 79 se llevó a cabo como se detalla anteriormente. después de la infección, las células se cultivaron en medio de cultivo normal que contenía suero durante 72 horas.
exfoliados caspasa-3 ensayo
DMS 79 células que expresan GR-eYFP o eYFP se aplicaron a poli-L-lisina recubierto cubreobjetos y se fijaron con formaldehído al 4%. Las células se permeabilizaron con PBS /0,2% Triton x 100. Después del lavado, las células se bloquearon en PBS /Tween-20 + 5% de suero de burro 0,1%. Anti-caspasa-3 activa Pab (Promega, Reino Unido) diluido en tampón de bloqueo 1:250 se añadió a las células y se incubaron durante la noche. de incubación de anticuerpo secundario se realizó en la oscuridad utilizando Alexa Fluor 546 burro IgG anti-conejo (Invitrogen, Reino Unido) diluido 1:500 en PBS. Los cubreobjetos se montaron utilizando Prolong Oro con DAPI (Invitrogen, Reino Unido).
Las imágenes se recogieron en un microscopio Olympus BX51 en posición vertical utilizando un UPlanApo 60 × /1.40 objetiva y capturaron con una cámara Coolsnap ES (Fotometría) a través de MetaVue Software (Molecular Devices). conjuntos de filtros de paso de banda específicos para DAPI, FITC y rojo de Texas se utilizaron para evitar sangrar a través de un canal a la siguiente. Las imágenes fueron procesados y analizados usando ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij).
bisulfito sódico Secuenciación
ADN genómico fue extraído de varias de las líneas celulares utilizadas en este estudio, algunos de los cuales habían sido tratados con 5 'Azadeoxycytidine (ver resultados) utilizando la sangre y el tejido kit DNeasy (Qiagen). ADN genómico purificado se convierte entonces bisulfito usando el Kit Epitect Bisulfito (Qiagen). A continuación se utilizó este convertida ADN como una plantilla en la reacción PCR para amplificar regiones promotoras específicas GR. GR regiones promotoras amplificados (y) los cebadores utilizados fueron los siguientes:
Promotor
1C (orientadas hacia el 5'-AGGTGGATCCGGAAGGAGGTAGYGAGAAAAGAAATT-3 '; inversa 5'AGGTGAATTCACACRAACTCRCAAAATAAAAAAAA-3').
Promotor
1D (orientadas hacia el 5'-AGGTGGATCCTTTTATAAAAATTTTTTTGGTTGAGG-3 '; inversa 5'AGGTGAATTCCCCCCTACTCTAACATCTTAAAAA).
Promotor
1E (orientadas hacia el 5'-3 AGGTGGATCCTTAGAGTTATAAAAATTATAATTTGTGT.. '; inversa 5'AGGTGAATTCATACAAACAACTTTAAAATACCAAC-3')
Todos los cebadores fueron suministrados por MWG-Eurofins
La PCR se llevó a cabo utilizando Immolase de la polimerasa (Bioline) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: 95 ° C durante 10 minutos, 30 ciclos, a 95 ° C durante 30 segundos, a 56 ° C durante 45 segundos, y a 72 ° C durante 30 segundos, esto fue seguido por una extensión final de 72 ° C durante 10 minutos.
productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de poli-acrilamida y se purificó usando un kit de extracción de gel (Qiagen). Las ligaciones se llevaron a cabo a continuación, el uso de estos fragmentos de PCR utilizando el sistema de vector pGEM-T-easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la transformación en bacterias competentes JM-109 (Promega), las colonias se seleccionaron y se incubaron durante la noche en caldo LB a 37 ° C. Mini-preps (Qiagen) se llevaron a cabo en estas suspensiones de células, seguido de una digestión de restricción utilizando EcoRI (Roche) para confirmar la presencia del inserto correcto. Los plásmidos que contenían el inserto fueron enviados para la secuenciación usando un cebador SP16 en el Centro de Secuenciación del ADN de la Universidad de Manchester. Un estudio inicial se llevó a cabo para analizar el potencial de metilación y los efectos de 5'Azadeoxycytidine, utilizando ADN de células DMS 79. En este caso, un clon se analizó para cada condición (cada promotor individual, no tratada o tratada con 5'Azadeoxycytidine). Un estudio más en profundidad se llevó a cabo para analizar la metilación del promotor 1C en un panel de líneas celulares de SCLC. En este caso, 3 clones se analizaron por línea celular.
Estadísticas
Todo el análisis estadístico se realizó con el programa SPSS para Windows versión 16. Además análisis estadístico se llevó a cabo para comparar los niveles de metilación por el Dr. Steve Roberts, Universidad de Manchester; utilizando un modelo de regresión lineal. La ecuación utilizada para este análisis fue el siguiente:
Resultados
La expresión del GR se altera en la línea celular humana SCLC, DMS79
proteínas
GR se midió en la célula hSCLC línea, DMS79 y se comparó con dos líneas Gc células sensibles, HeLa y A549, y dos líneas de células resistentes Gc, U2OS y HEK293. La línea de células SCLC DMS79 expresa niveles bajos de proteína GR, similar a las células U2OS, y claramente mucho menor que el HeLa y células A549 (Fig. 1a). La comparación con un panel de líneas celulares de SCLC no indica que la expresión de GR es menor en las células de SCLC (Fig. 1B). se encontró proteína de GR que se expresa en el epitelio bronquial humano normal, cosechadas a partir de tejido pulmonar en la resección de cáncer de pulmón (Fig. 1c).
(A) análisis de transferencia de Western de GR, y expresión de la proteína tubulina en U20S, HEK, HeLa, A549 y DMS 79 células. Blot es representativo de 3 experimentos independientes. (B) Comparación de la expresión de la proteína GR entre SCLC, y las líneas de células no-SCLC (NS). La cuantificación de GR expresión relativa a la tubulina se presentan como media +/- S.E.M. (N = 3) con * indica p & lt; 0,05, prueba t de Student para muestras independientes. (C) Comparación de la expresión de la proteína GR en el epitelio bronquial humano normal (NBE) en comparación con la línea celular no SCLC (A549), y un panel de líneas celulares de SCLC humanas. se presenta la cuantificación de GR expresión relativa a la tubulina. Media de n = 2. (D) Análisis de expresión de la proteína GR usando un anticuerpo pan-GR generado contra el terminal de GR N (N plazo), y un anticuerpo específico GR GRalpha generado contra el terminal C (C plazo).
GR migra como dos especies principales, y la abundancia relativa parecían diferir entre tipos de células (Fig. 1a, b). Esto puede reflejar splicing alternativo para la isoforma GRβ, o el uso de traducción alternativa sitio de inicio de [22] - [24]. Para caracterizar aún más la especie, inmunotransferencias se repitieron utilizando un anticuerpo específico de terminal C que reconoce específicamente GRα (Fig. 1d). El patrón de bandas similares observados con los dos anticuerpos indica dos proteínas comparten un dominio común de terminal C, lo que sugiere que la diversidad de proteínas se encuentra con el uso de traducción alternativa sitio de inicio.
Restauración de expresión GR induce apoptosis
en las células DMS79 expresión de un transgén GR-eYFP por la infección retroviral resultado en un aumento de proteína GR-eYFP (Fig. 2a) y la apoptosis como se evidencia por el aumento de la caspasa-3 escindido en las células de SCLC que expresan el GR-eYFP (Fig. 2b). En estos estudios, sólo una minoría de las células se transducen de manera eficaz, por lo tanto, la baja abundancia de la proteína de fusión expresada en la piscina de las células. Además, la expresión del transgén inducida por apoptosis, reduciendo aún más la concentración de GR-eYFP en lisados celulares agrupados [13], [14].
DMS 79 células (A) se infectaron con cualquiera de GR-EYFP EYFP o retrovirus y la proteína GR evaluó a las 72 h. células (B) DM79 tratados como los anteriores fueron fijadas para inmunohistoquímica para detectar exfoliados caspasa-3. Las células se tiñeron para la caspasa-3 activada y luego se analizaron para la co-localización, ya sea con GR-eYFP o eYFP. Porcentaje de células positivas para la caspasa-3 escindido y eYFP o GR-eYFP. Los recuentos de células derivan de 3 infecciones independientes y representados como porcentaje de la caspasa-3 positiva a eYFP positivo como media +/- S.E.M. (N = 3) con *** indica p & lt; 0,001, prueba t de Student para muestras independientes
El estado de metilación del promotor GR en las células de SCLC
La disminución de la expresión de GR. células de SCLC pueden ser resultado de la alteración en promotor GR metilación, o de un mecanismo indirecto. Por lo tanto el estado de metilación de los promotores de GR en las células DMS79 se examinó por secuenciación de bisulfito. No se detectó ninguna metilación del ADN en los promotores 1B y 1F. El 1D y 1E promotor tenían cada uno un único metil CpG, marcado con una caja abierta (Fig. 3a, b). En contraste, el promotor 1C tenía cuatro CpG metilo (Fig. 3C). Los CpG metilados observados se encuentran en posibles sitios de unión de factores de transcripción, (CpG 6, 44 y 52), o se encuentran cerca de un sitio (CPG 69) (Fig. 3c).
secuenciación por bisulfito sódico en ADN genómico extraído de células DMS 79 incubadas con 5'Azadeoxycytidine durante 5 días (sin tratar como control). La secuencia original (obtenido de genoma navegador) se comparó con bisulfito de ADN tratado desde el control y 5'Azadeoxycytidine muestras tratadas. , cajas abiertas negrita destacan los CpG metilados específicos, los cuales mostraron inversión de la metilación después 5'Azadeoxycytidine incubación. El factor de transcripción potencial sitios en las proximidades de los sitios metilados de unión se indica mediante el sombreado gris para sitio de unión Sp1 y el sombreado gris oscuro para el sitio de unión C /EBPb. metilación (A) CpG en la región promotora GR 1D en células DMS 79. CpG individuales están numerados y en letras mayúsculas. (B) la metilación CpG en una región del promotor GR 1E de DMS 79 ADN genómico. CpG individuales están numerados y en letras mayúsculas. (C) El ADN genómico de una región del promotor GR 1C a partir de células DMS 79. CpG individuales están numerados y en letras mayúsculas. El texto en cursiva indica el inicio del exón 1C.
CEP líneas celulares han incrementado la metilación del promotor GR 1C
Para determinar si se han encontrado los cambios observados en el promotor GR metilación en otro ser humano SCLC líneas de células, un panel de 14 hSCLC líneas de células con expresión GR variable se compararon con dos líneas celulares que expresan GR, (A549 y HeLa) una línea celular que no expresa, (U2OS), y las células mononucleares de sangre periférica como una comparación de células primarias (Fig. 4a, b). Las perlas representan dinucleótidos CpG de la posición 1 a la posición 69. Es evidente que existe la metilación frecuente en las dos últimas perlas de la derecha, que representan CpG 68 y 69. Este está presente a través del panel de células de SCLC, y es también visto en las células de control. Sin embargo, hay también un marcado aumento de la metilación en las posiciones 1-67 de todo el panel de SCLC, sin ninguna agrupación notable. Por el contrario hay muy poco metilación CpG visto en las posiciones 1-67 en el panel de control de células (Fig. 4a, b).
ADN genómico fue extraído de las líneas celulares específicas de control (A), incluyendo la sangre periférica primaria leucocitos mononucleares de un donante sano y (B) 14 líneas celulares hSCLC. Después de la conversión de bisulfito de la región promotora 1C se amplificó por PCR. 3 clones por línea celular fueron secuenciados. La metilación en el panel de líneas celulares de SCLC y líneas celulares de control se muestra como "talones". Cada grano individual representa un solo CpG en el promotor GR 1C en orden numérico de izquierda a derecha. perlas blancas indican los CpG no metilados, mientras que los granos negros indican los CpG metilados. Todos los 3 clones se muestran para cada línea celular analizada.
La regresión logística se utilizó para comparar la metilación entre el panel de SCLC, y todas las células de control (Tabla 1). Esto reveló que había una diferencia significativa entre los grupos con la metilación en CpG 69 individualmente; y con CpG 68 y 69 en combinación, y en toda la región del promotor. También se observó una diferencia significativa entre los grupos para todos los CpG exclusión de 68 y 69 (Tabla 1).
GR promotor metilación se correlaciona con la expresión de GR
A través de todas las líneas celulares hSCLC allí era una amplia gama de la expresión de GR, aunque en todos los casos GR era menos abundante que en la HeLa y las líneas celulares de control de A549 (Fig. 5a, b). También hubo una marcada variación en la abundancia de las dos especies de proteínas GR a través de las líneas celulares examinadas, pero para este análisis las dos isoformas de la proteína GR fueron considerados juntos. La relación entre los RG 1C promotor de la metilación y la expresión de la proteína GR fue examinado a través de todo el conjunto de líneas celulares hSCLC. Hubo una correlación significativa entre el número de CpG metilados, y la expresión de la proteína GR dentro del panel de líneas celulares hSCLC; r
2 = 0,54 y p = 0,01 (Fig. 5c).
(A) Borrón representativo occidental para GR y tubulina en 10 líneas celulares de SCLC, así como líneas celulares de control HEK (riñón embrionario humano ), U2OS (osteosarcoma), HeLa (carcinoma cervical) y A549 (carcinoma de pulmón de células no pequeñas). (B) La densitometría se llevó a cabo en 5 manchas separadas para cuantificar los niveles de expresión de GR en relación con la tubulina. El gráfico muestra la media, la expresión GR corregido ± S.E.M. (C) La relación entre la metilación del promotor GR 1C y la expresión de GR en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón humano. metilación global (porcentaje) a través de promotor 1C se representa frente a la expresión de GR, con error estándar, para cada línea celular. La línea de regresión fue significativamente diferente a cero (P = 0,01), y la bondad de ajuste fue de r
2 = 0,54.
Restauración de expresión de GR por la inversión de la metilación del ADN
Si la pérdida de expresión de GR en las células DMS79 el resultado de la metilación del ADN, tal vez como consecuencia de la carcinogénesis, la expresión de GR se prevé que aumente siguiente inversión de la metilación. Después de 72 horas de tratamiento con 5'Azadeoxycytidine, los niveles de mRNA de GR se incrementaron dramáticamente en las células DMS79 en comparación con las células HEK y A549, donde no se observaron cambios en la expresión (Fig. 6a). Además, después de 72 horas, o después de 5 días de incubación con 5'Azadeoxycytidine, hubo un aumento notable en la proteína GR (Fig. 6b). En contraste con el aumento en la expresión GR se ve en DMS79, no hubo disminución de la expresión en células U2OS, posiblemente debido a la toxicidad (Fig. 6b).
expresión (A) GR mRNA normalizó a GAPDH en respuesta a 72 horas tratamiento con 5'azadeoxycytidine (5'Aza) en las células DMS 79, células HEK deficientes GR, y las células que expresan A549 GR. líneas celulares deficientes (B) Dos GR, DMS 79 y U2OS, se trataron con 5'Azadeoxycytidine (5'Aza) durante 72 horas y 5 días (células sin tratar como control). Los lisados se analizaron entonces mediante transferencia de western para la expresión GR. Para las células DMS 79, la expresión de GR se normalizó en contra tubulina α, y se representa como medio de expresión de GR, más S.E.M. (N = 3). * Indica p & lt; 0,01 en comparación con el control tratado con vehículo. (C) Un panel de líneas celulares de SCLC humanas (panel superior) se comparó con un panel de líneas celulares de SCLC no (panel inferior) para la respuesta de proteína de GR de la incubación con 5'Azadeoxycytidine (5'Aza).
el efecto de 5'Azadeoxycytidine se comparó en líneas de células y líneas celulares de SCLC no SCLC humana para determinar si la regulación de la expresión de GR por metilación fue generalizado en el cáncer de pulmón. Tres de las cuatro líneas celulares de SCLC mostraron aumentada expresión GR después del tratamiento 5'Azadeoxycytidine, en comparación con sólo una de las cuatro líneas celulares de SCLC no (Fig. 6c).
El aumento de la expresión GR visto en DMS79 las células se prevé que restaurar la sensibilidad Gc a estas células. De hecho, hubo una mayor Gc transactivación de un simple gen reportero (Fig. 7a). La magnitud de la inducción Gc fue considerablemente menor que la observada con la sobreexpresión de GR, pero este último da lugar a concentraciones suprafisiológicas de GR en las células diana (Fig. 7a).
(a) Tratamiento de células con 79 DMS 5'Azadeoxycytidine (5'Aza) restaura la sensibilidad Gc. DMS 79 células tratadas con 5'Aza durante 72 horas fueron transfectadas con el constructo informador TAT3-luciferasa. Las células fueron incubadas durante la noche con o sin 100 nM de dexametasona. El gráfico muestra la media veces el cambio (DEX tratados /no tratados), (unidades relativas de luz), (por triplicado) más el S.E.M. (* = P & lt; 0,05). células DMS 79 fueron también co-transfectadas con pFUNC1 GR-eYFP (como control positivo) y el constructo indicador TAT3-luciferasa. Las células fueron incubadas durante la noche con o sin 100 nM de dexametasona. El gráfico muestra la media veces el cambio (DEX tratados /no tratados), más la S.E.M. Todos los resultados se normalizaron frente a un control renilla. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. (B) Bcl-2 la expresión de ARNm normalizado a GAPDH en respuesta al tratamiento de 72 horas con 5'Azadeoxycytidine (5 'Aza) en células DMS79 y HEK. (C) Tratamiento de células con Aza y entonces los resultados dexametasona en apoptosis. imagen representativa de las células de SCLC (CORL47) y células no SCLC (NCI-H358) tratados con Aza como se describe anteriormente. Las células se trataron luego con dexametasona durante 72 h, se fijaron y se tiñeron para la caspasa-3 activa. (D) La desmetilación conduce al marcado incremento de la apoptosis mediada por Gc en las células de SCLC en comparación con las células no SCLC. La apoptosis se mide por la caspasa-3 de activación después de 5'Aza y dexametasona como se describe anteriormente. Las barras grises representan las células tratadas con dexametasona, barras negras para las células tratadas con 5'Aza y luego con dexametasona. Cada línea celular se incubó por triplicado y 100 células contadas para evaluar% de tinción positiva. La prueba t de estudiante independiente * = p & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p. & lt; 0,001
La expresión GR aumentado en respuesta al tratamiento con 5'Azadeoxycytidine produjo la supresión de la pro-supervivencia Bcl-2 gen tanto en HEK, y las células DMS79 (Fig. 7b). También se aumentó la activación exfoliados caspasa-3 en las células de SCLC, pero no las células no SCLC (Fig 7c & amp;. 7d). Es importante tener en cuenta que después de 5 días de incubación con 5'Azadeoxycytidine hubo inducción de muerte celular, posiblemente debido a la readquisición de expresión GR, o la regulación de otros genes de supervivencia.
Discusión
epigenética trastornos están implicados en muchas enfermedades humanas incluyendo cáncer. El humo del cigarrillo es el agente principal de la promoción del medio ambiente SCLC y recientemente, un carcinógeno humo del cigarrillo, NNK, se ha demostrado que ejercen un efecto específico promover la expresión DNMT1, y la actividad [4]. Por lo tanto este carcinógeno puede actuar mediante la inducción de cambios epigenéticos en genes clave implicados en la patogénesis del cáncer.
Hemos demostrado previamente que el receptor de glucocorticoides es efectivamente un gen supresor de tumor de SCLC, cuya expresión se inhibe [12] . Hemos ampliado el análisis en este estudio con más pruebas de que la expresión de GR es inferior en un panel de células de SCLC en comparación con las células no SCLC o células epiteliales bronquiales normales. Readquisición de expresión GR, y la sensibilidad de glucocorticoides en las células de SCLC
in vitro
, o en los tumores de xenoinjertos resultados en la apoptosis [13], [14]. GR se expresa en la mayoría de células y tejidos, y ejerce efectos pleiotrópicos en las células. Sin embargo, se sabe relativamente poco de cómo se regula la expresión de genes GR, ya que tiene un promotor estructura inusualmente compleja. Estudios más recientes en las células mononucleares de sangre periférica primarias definen patrones altamente individuales de promotor GR metilación [16]. Este trabajo también asigna potencial, y probada factor de transcripción sitios de unión dentro de los promotores, la mayoría de los cuales contenía sitios CpG metilados, que podría ser. Esto sugiere que la metilación diferencial del promotor GR humano es un mecanismo para controlar la utilización del promotor, y por lo tanto la expresión del gen GR.
Tres GR promotores fueron examinados en la línea celular índice, DMS79, y los tres contenían sitios CpG metilados . Un análisis más detallado se realizó en el promotor 1C ya que se ha demostrado que se expresa de forma ubicua en todos los tejidos ensayados, incluyendo cáncer de pulmón [15]. Hubo un aumento evidente y altamente significativa en la metilación CpG a través de un panel de líneas celulares hSCLC comparación con la línea celular A549 no SCLC. Es importante destacar que no hubo un aumento en las dos líneas que no expresa de células de control (U2OS y HEK293), lo que indica que el promotor 1C metilación no se requiere para limitar la expresión de GR, pero que otros mecanismos pueden aplicarse para regular la expresión GR en diferentes tipos de células. Una comparación más amplia entre las células hSCLC y un panel heterogéneo de GR que expresa, y las líneas de células no expresan también encontró un aumento altamente significativo en sitios CpG metilados en las células hSCLC.