Extracto
carcinoma de colon humano (HCT-8), las células muestran una transición estable de bajo a alto estado metastásico cuando se cultiva en sustratos blandos apropiada (21 kPa). Inicialmente epitelial (E) en la naturaleza, las células HCT-8 se redondean (R) después de siete días de cultivo en sustrato blando. células de I muestran una serie de características metastásicos [1]. Aquí, nosotros usamos sustratos gradiente de rigidez, un sensor de fuerza bio-MEMS, y ensayos de contador Coulter para estudiar sensibilidad mecánica y la adhesión de las células E y R. Encontramos que las células HCT-8 pierden sensibilidad mecánica que sean sometidos a la transición E-a-R. rigidez HCT-8 células R ', área de extendido, la proliferación y la migración se vuelven insensibles al sustrato rigidez en contraste con su contraparte epitelial. Ellos son más suaves, proliferativa y migratoria en todos los substratos. células R demuestran insignificante de adhesión homotípica célula-célula, así como la adhesión no específica de células-sustrato. En consecuencia, muestran la misma área de difusión en todos los sustratos en contraste con las células E. Tomados en conjunto, estos resultados indican que las células R adquieren autonomía y la independencia de anclaje, y por tanto son potencialmente más invasiva que las células E. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe de los datos cuantitativos sobre los cambios en la adhesión de células de cáncer y la rigidez durante la expresión de un
in vitro
metástasis fenotipo similar
Visto:. Tang X, Wen Q, Kuhlenschmidt TB, Kuhlenschmidt MS, Janmey PA, Saif TA (2012) La atenuación de la célula mecanosensibilidad en células de cáncer de colon en
in vitro
metástasis. PLoS ONE 7 (11): e50443. doi: 10.1371 /journal.pone.0050443
Editor: Fan Yuan, la Universidad de Duke, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Agosto, 2012; Aceptado: 22 Octubre 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
Derechos de Autor © 2012 Tang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo está financiado por la National Science Foundation (NSF), concede Nº ECCS 07-25831, 10-02165 y NIH RO1 083272-03. XT fue financiado por la NSF subvención 0.965.918 IGERT: formación de la próxima generación de investigadores en el Celular y Molecular y Mecánica BioNanotecnología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mayoría de las muertes por cáncer son causados por metástasis y no por el tumor primario de los padres [2], [3], [4], [5], [6]. Durante la metástasis, las células cancerosas malignas escapan del tumor separando una de otra o de otras células y la matriz extracelular (ECM) [2], [3], [6], [7]. Las células escapado expresan activamente proteinasas y alteran sus ligandos de adhesión para degradar y modificar su ECM circundante [3], [4], [5], [8], [9]. Simultáneamente, hasta de regular su motilidad y la resistencia a la apoptosis de propagación vascular éxito y la invasión de órganos sanos distantes [6], [7], [10]. Al mismo tiempo, estas células a reducir su rigidez [11], [12], [13], [14], es decir, aumentar su cumplimiento a fluir a través de pequeños capilares [4], [15], [16]. Un estudio cuantitativo de las propiedades mecánicas de las células cancerosas durante las fases tempranas de la metástasis; Sin embargo, se carece [17], [18], [19], [20], en gran parte debido a los desafíos en la detección de la aparición de metástasis
in vivo
y la heterogeneidad de las propiedades bioquímicas y celulares del tumor individual las células [3], [17], [21], [22].
recientemente hemos descubierto [1] que las células de carcinoma de colon humano (HCT-8) pueden mostrar consistentemente un
in vitro
fenotipo similar a la metástasis (MLP) cuando se cultivan en sustratos de hidrogel blandas con rigidez mecánica adecuada (geles de poliacrilamida con módulo de Young: 21~47 kPa [1], [23]). HCT-8 células son epitelial (E) en la naturaleza. Cuando se cultivan en sustratos blandos, por primera vez forman grupos epiteliales diferenciadas o islas. Después de 7 días, las células se disocian de las islas, y asumen una forma redondeada (células R). Estas células R son altamente proliferativas, migratorio y significativamente baja regulan la expresión de E-cadherina - marcas típicas de metástasis [1], [24]. Además, E a la transición R es repetible y irreversible [1], [24]. Sobre sustratos duros (3 GPa sustratos de poliestireno), no se produce este correo a la transición R.
En este estudio, presentamos en primer lugar una investigación detallada de sensibilidad mecánica de ambos antes y después de la metástasis similar HCT-8 las células utilizando un sustrato de la rigidez del gradiente. El estudio revela la pérdida de mechanosensitivity de HCT-8 células R, en contraste con tanto las células E y fibroblastos normales. La rigidez de las células R, medida por AFM, se hace independiente de la rigidez del sustrato. Por el contrario, la rigidez de las células E se correlaciona con la rigidez del sustrato. Los ensayos de contador Coulter y Bio-MEMS revelan que las células R tienen una baja adhesión célula-célula homotipica y la adhesión no específica insignificante en comparación con las células E.
Resultados
1. débil adhesión entre 8 HCT-R y células sustrato
Para explorar cómo las células HCT-8 R responden a diferentes sustratos fisiológicamente relevante de rigidez variable, se recogieron las células HCT-8 R PA a partir de geles suaves, como se describe ampliado en Materiales y Métodos y luego cultivadas en substratos de gel de PA-rigidez gradiente frescas con rigidez continuamente variable de 1 a 20 kPa (Fig. 1a, de izquierda a derecha). El sustrato rigidez-gradiente se recubre con una concentración de fibronectina uniforme para permitir la fijación de células al sustrato [25], [26], [27]. Para la comparación, ambas HCT-8 células E y células de mono normales de riñón de fibroblastos (MKF), sin ninguna exposición previa a geles de PA, se sembraron en los mismos sustratos gradiente rigidez y funcionalización de la superficie (Fig. 1b y 1c). Las células normales MKF se eligieron como control, ya que son conocidos por ser mechanosensitive al sustrato rigidez [28]. Hemos encontrado, en contraste con HCT-8 células E y las células normales MKF, las células HCT-8 R constitutivamente mostraron áreas de contacto sustrato muy limitadas independientemente de la rigidez del sustrato. área de contacto Las células R 'con el sustrato es de aproximadamente 40 a 60% de su área proyectada aparente. Como medida por 3D imágenes microscópicas confocal, el área de contacto célula R con sustrato es solamente 49,5 ± 20,9 m
2 (n = 34), que es 3,8 ± 0,3 veces más pequeño que las células E (n = 47), lo que sugiere que R células tienen adherencia más débil con el sustrato de células E. La adhesión débil de las células de R con sustrato también es consistente con la observación de que R células muestran un área proyectada más pequeño, que las células E en el mismo sustrato rigidez (Fig. 1d). El área proyectada de células aisladas sin ningún contacto célula vecina, de 1,9 es 0,6 veces menor para las células R (n = 68) que las células E (n = 61).
(A-C) Imágenes de contraste de fase de las células recogidas HCT-8 R, HCT-8 células e, y las células normales MKF sobre los sustratos de gel de gradiente PA-rigidez. Los respectivos paneles cuadrados (3 encerradas por las cajas de tablero amarillo) muestran los puntos de vista representativos magnificados en kPa 1-5, 8-12 kPa, y 15-20 dominios de rigidez kPa. Las flechas blancas indican en las vistas ampliadas de las células individuales, sin contacto, mientras que las flechas amarillas indican las células en contacto con las colonias. Las barras de escala en los paneles de vista ampliada son 100 micras. (D) área proyectada Las células individuales 'de 3 tipos de células en todo el rango de rigidez se muestran. Aquí no tienen ningún contacto con sus células vecinas en diferentes sustratos de rigidez. (E) La zona de propagación de las células individuales en contacto con las células vecinas en diferentes sustratos de rigidez. (F) La aparente área de la colonia celular de 3 tipos de células en diferentes sustratos de rigidez. (G) El factor de forma de la célula de 3 tipos de células, que no están en contacto con sus células vecinas en diferentes sustratos de rigidez. (H) El factor de forma de la célula de las células individuales, que están en contacto con las células vecinas en diferentes sustratos de rigidez.
R células HCT-8 también muestran una insensibilidad notable a los cambios de la mecánica rigidez de su sustrato de cultivo. Conservan un fenotipo redondeado y área de adhesión limitada a sustratos independientemente de la rigidez de los sustratos '(Fig 1a, indicado por las flechas blancas;. Fig. 1d, 1e y 1g). Cuando la rigidez del sustrato varió en un rango de 20 veces, el área de extensión de las células R individuales aumentó sólo alrededor del 27%, (de 156,2 ± 42,1 m
2 en una región de 1 kPa (n = 62) a 197,9 ± 83,6 micras
2 (n = 56) en una región de 20 kPa) (Fig. 1d). Al otro lado de la rigidez probado, el aumento de la superficie difusión células R 'no es tan dramática como la de las células E y MKF. El 5 kPa, 10 kPa y 15 regiones kPa, sus áreas de propagación son 158,2 ± 40,3 m
2 (n = 56), 182,3 ± 32,2 m
2 (n = 63), y 190,9 ± 82,5 m
2 (n = 57), respectivamente (Fig. 1d). Además, el factor de forma de la célula R cambió sólo el 7% de 0,9 ± 0,2 en una región de 1 kPa a 0,8 ± 0,2 en un 20 región kPa (figura 1 g;. El factor de forma, S = 4 * πA /P
2, donde a es el área de la célula y P es el perímetro. S = 1 para la forma circular perfecta y 0 para la forma irregular), lo que indica forma redondeada constitutiva independiente de la rigidez del sustrato. En 5 kPa, 10 kPa y 15 kPa regiones, los factores de forma de células individuales R son 0,8 ± 0,1, 0,8 ± 0,2, y 0,9 ± 0,2, respectivamente (Fig. 1 g). Después de un cultivo prolongado (60 días), las células R no mostraron ninguna reversión hacia una morfología epitelial en todos los substratos, sin tener en cuenta la rigidez, incluso poliestireno muy rígido (3 GPa) [1]. Además, el registro diario a través de microscopía de vídeo indica que las células R no muestran signos de deterioro de la actividad proliferativa incluso después de varios meses en cultivo. Por el contrario, ambos HCT-8 células E y células MKF cultivadas en el mismo tipo de sustratos gradiente de rigidez muestran sensibilidad obvio para la rigidez mecánica de su sustrato de cultivo. El aisladas células E área individual extendido aumenta 2,5 veces más que 20 veces el cambio sustrato rigidez, de 239,6 ± 191,9 m
2 en la región de 1 kPa a 578,1 ± 429,8 m
2 en la región de 20 kPa (Fig. 1b , indicado por flechas blancas). Como sustratos se vuelven rígidas, las células HCT-8 E muestran una mayor área de difusión, con sus áreas de propagación 270,8 201,7 m
2 (n = 51), 276,0 ± 104,8 m
2 (n = 62), y 442,7 ± 367,7 m
2 (n = 55), el 5 kPa, 10 kPa y 15 kPa regiones, respectivamente (Fig. 1b). Su factor de forma se redujo de 0,9 ± 0,2 en la región de 1 kPa a 0,6 ± 0,2 en la región kPa 20 (Fig. 1 g). A través de la prueba a otros rigidez, los factores de las células individuales E de forma son 0,8 ± 0,2 (en 5 región kPa), 0,8 ± 0,1 (en 10 región kPa), y 0,7 ± 0,3 (en 15 región kPa), respectivamente. El mechanosensitivity de MKF es aún más pronunciada en comparación con células HCT-8 cancerosas (Fig. 1C). El área de propagación del individuo aislado células MKF (figura 1c;. Indicado por las flechas blancas) aumenta 5 veces a través del sustrato degradado, de 286,4 ± 86,2 m
2 (n = 46) en la región de 1 kPa a 1421,7 ± 845,7 micras
2 (n = 31) en la región de 20 kPa (Fig. 1d). A medida que aumenta la rigidez del sustrato, su área de difusión se incrementa dramáticamente, y son 578,1 ± 373,1 m
2 (n = 62), 749.9 ± 355.5 m
2 (n = 63), y 1218,6 ± 773,5 m
2 (n = 59), el 5 kPa, 10 kPa y 15 kPa regiones, respectivamente. Simultáneamente con el aumento de la rigidez del sustrato, las células individuales MKF extendido a una morfología más irregular, con su factor de forma decreciente desde 0,9 ± 0,1 en la 1 kPa a 0,5 ± 0,2 en las 20 regiones kPa, respectivamente (Fig. 1G). En las regiones de rigidez intermedios, es decir, 5 kPa, 10 kPa y 15 kPa regiones, los factores de forma de células individuales MKF son 0,7 ± 0,3, 0,6 ± 0,3 y 0,5 ± 0,3, respectivamente. La adhesión débil entre HCT-8 células R y el sustrato, así como la independencia de la morfología celular R de la rigidez del sustrato, sugieren fuertemente que las células pierden R anclaje dependencia y la comunicación con su microambiente mecánica. Este anclaje independencia puede promover potencialmente la supervivencia R células en suspensión, que es una característica esencial de
in vivo
la metástasis de las células cancerosas [2], [3], [4], [16], [22] .
2. células HCT-8 R demuestran débil adhesión célula-célula
Sobre soportes rigidez de gradiente, tanto las células E HCT-8 y células MKF muestran la formación de colonias de células, especialmente en las regiones más duras (indicado por flechas amarillas en la Fig. 1b y 1c). El tamaño de las colonias se correlaciona positivamente con la rigidez del sustrato. El sustrato rigidez 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa y 20 kPa gelifica los tamaños de colonia de células de HCT-8 células E son 2962,2 ± 1000,5 m
2, 3662,1 ± 1105,3 m
2, 4249,5 ± 919,5 m
2, 9736,5 ± 4032,7 m
2 y 11748,7 ± 2144.9 m
2, respectivamente (Fig. 1f). Para HCT-8 células R en los mismos sustratos de rigidez, los tamaños de colonia son notablemente más pequeños que sus homólogos E incluso cuando las células R están en contacto con las células vecinas para 3 días (Fig. 1a). En rigideces de sustrato de 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa y 20 kPa, los tamaños de colonias de células R son, 1087,4 ± 338,3 m
2, 1449,8 ± 343,4 m
2, 3062,2 ± 1326,9 m
2, 3849,6 ± 919,1 m
2 y 3912,1 ± 1183,8 m
2, respectivamente (Fig. 1f). También observamos que dentro de las colonias de células R, el área de contacto célula-célula no es tan extensa como en las colonias de células E. R células parecen estar simplemente en contacto entre sí en puntos de contactos (Fig. 1a). Estos resultados sugieren la adhesión célula-célula R no es suficiente para que se formen colonias de células cohesivas o islas como lo hacen las células E y MKF.
Por otra parte, es interesante observar que a medida que las células HCT-8 E o células MKF someterse a la adhesión homotípica célula-célula, sus áreas de células individuales y el factor de forma de la célula a ser notablemente menos sustrato rigidez dependiente (Fig. 1b y 1c, indicado por flechas amarillas). áreas de células individuales y los factores de forma de HCT-8 células individuales E dentro de islas de células en 1 geles kPa son 785,6 ± 299,4 m
2 y 0,7 ± 0,1, respectivamente, que es similar a los de 20 geles kPa, 892,8 ± 322,1 micras
2 y 0,6 ± 0,1 (Fig. 1e y 1 h). Las mismas características se observan en la rigidez intermedia, el área de la celda y el factor de forma del individuo HCT-8 E dentro islas son 526,7 ± 187,0 m
2 y 0,8 ± 0,1 en 5 geles kPa, 633.9 ± 421.4 m
2 y 0,6 ± 0,2 en 10 geles kPa y 723,1 ± 515,2 m
2 y 0,6 ± 0,2 en 15 geles kPa. Para las células MKF individuales islas en su interior el área de la celda y el factor de forma son 928,5 ± 374,0 m
2 y 0,5 ± 0,3 en 1 geles kPa, 892,8 ± 415,7 m
2 y 0,5 ± 0,3 en 5 geles kPa, 1098.1 ± 564,6 m
2 y 0,5 ± 0,2 en 10 geles kPa, 1008,8 ± 223,7 m
2 y 0,3 ± 0,2 en 15 geles kPa y 1.160,6 ± 429,7 m
2 y 0,4 ± 0,1 en 20 geles kPa ( Fig. 1e y 1 h). Una vez que estas células establecen contactos célula-célula, la E y las células MKF muestran la propagación de células en muy suaves 1 geles kPa, lo que sugiere las señales de célula-célula abrumar las señales de célula-sustrato (la región izquierda en la Fig. 1b y 1c, indicados por el amarillo flechas). La mayoría de HCT-8 células R; sin embargo, permanecen redondeadas, con misma área de la celda aparente y factor de forma como los de las células aisladas R, incluso cuando está en contacto con las células vecinas (Fig. 1a, indicado por las flechas de color amarillo). Los resultados de este fenotipo celular R en área de la colonia generalmente más pequeñas en comparación con las células R islas de células E consisten en el número de células similares (Fig. 1f). Las áreas individuales de células y factores de forma de las células R individuales dentro de las colonias de células R en 1 geles kPa son 151,8 ± 33,4 m
2 y 1,0 ± 0,1, respectivamente, y es similar a los de 20 geles kPa (169,6 ± 30,5 micras
2 y 0,9 ± 0,2), respectivamente, así como los de las células individuales de I exhiben no hay contactos célula-célula (Fig. 1E y 1 h). El 5 kPa, 10 kPa y 15 geles kPa, el área de la celda y el factor de forma de HCT-8 células individuales R islas interiores son 156,2 ± 52,3 m
2 y 0,8 ± 0,1, 142,8 ± 47,2 m
2 y 0,9 ± 0,0 y 160,7 ± 33,4 m
2 y 0,8 ± 0,2, respectivamente. Este fenotipo único persiste incluso después de que las células se cultivan R sobre los sustratos de poliestireno muy rígidos (3 PAM) para tiempos de cultivo prolongados (meses); sugiriendo una vez más débil adhesión célula-célula entre las células R. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que durante o después de la transición E-a-R, R células adquieren autonomía celular que se caracteriza por una marcada reducción célula-célula y contactos adhesivos de células del sustrato.
3. células R han reducido la actividad adhesiva célula-célula homotípica
Además de la estimación de la adhesión célula-célula cualitativamente basándose en sus morfologías de contacto, que utiliza aún más el ensayo contador Coulter para estudiar cuantitativamente la pérdida funcional de la célula-célula HCT-8 adherencias después de la transición E-a-R. El contador Coulter mide la velocidad y el grado de la adhesión celular mediante la cuantificación de la reducción en el número de células individuales en suspensión como agregados de células se forman como una función del tiempo [1], [29], [30]. La cinética de la adhesión célula-célula homotípica específico para las células HCT-8 E y R epiteliales cancerosas se midieron y se compararon. Se usaron células epiteliales (no canceroso) MA104 normales como control. Se encontró que disociados HCT-8 células R (cosechadas a partir de 21 sustratos kPa PA) muestran una tasa notablemente inferior y el grado de adhesión célula-célula en comparación con los HCT-8 células E originales cultivadas sobre sustratos de poliestireno duro (Fig. 2). Estudios anteriores han demostrado que después de 120 minutos de incubación, 84,8 ± 4,0% de las células R HCT-8 se mantuvo como células individuales, a diferencia de 37,6 ± 6,1% de HCT-8 células originales E y 5,2 ± 0,7% de las células normales MA104 [1]. Este notable resultado indica claramente que la actividad adhesiva de célula a célula de las células HCT-8 R se perdió casi por completo después de que se disocian de las islas de células E. Este resultado es coherente con nuestra conclusión de la reducción de la expresión de E-cadherina en las células R [1], [24]. La reducción de la adhesividad de la superficie celular también se observó cuando se midieron las fuerzas de adhesión no específicas entre HCT-8 superficies y SiO
2 revestidos con sondas de Bio-MEMS.
(a) Comparación de la adhesión célula-célula tasas de células originales HCT-8 e (nunca expuestos a 21 kPa geles PA), disociarse HCT-8 células cosechadas a partir de R 21 geles kPa PA, y las células MA104 epiteliales no cancerosas normales. células HCT8 R tienen la adhesión célula-célula más bajo. Cada punto de datos consta de 3 duplicados, y cada duplicado consta de 5 × 10
5 células de los respectivos tipos de células.
4. cambios de rigidez celular reflejan la sensibilidad mecánica
Además de sustrato cambios en la morfología celular dependiente de la rigidez, las células HCT-8 E también mostraron variada rigidez celular depende de la rigidez sustrato de cultivo. El uso de microscopía de fuerza atómica (AFM), la rigidez de células de HCT-8 células E cultivadas en sustratos rigidez de gradiente se determina mediante la sangría basados en palanca de nitruro de silicio con una constante de elasticidad de 148,14 PN /nm (con velocidad de sangrado celular coherente 0,1 m /segundo). teoría Hertz (ver Materiales y Métodos) se utilizó para extraer el módulo de elasticidad de las células con sangría. Para facilitar la comparación entre diferentes células en misma rigidez sustrato, designamos 5 regiones igual en el espacio a través de todo el rango de rigidez, con la región 1 abarca una rigidez de 1 a 4 kPa, regiones 5 con rigidez 5-8 kPa, 9-12 kPa , 13-16 kPa, 17-20 kPa, respectivamente (Fig. 3a). El uso de AFM, encontramos células HCT-8 E aumentan su rigidez celular como los sustratos se vuelven más rígidos. De región 1 a la región 5, HCT-8 células E rigidez aumentaron progresivamente de 1,4 ± 0,9 kPa a 1,9 ± 0,8 kPa, a 2,1 ± 1,4 kPa, a 2,2 ± 1,3 kPa, y a 3,8 ± 2,0 kPa, respectivamente (n = 6 ~ 10 para cada región; Fig. 3b). En particular, vale la pena señalar que el gradiente de aumento de rigidez de células (Fig. 3a) parece coincidir con el gradiente de aumento de la rigidez del sustrato gel. Estos resultados son consistentes con los reportados previamente [25], y sugiere que las células HCT-8 E son muy sensibles a la delicada variación de sus señales mecánicas microambientales. La rigidez de HCT-8 células R; sin embargo, en todos los diferentes sustratos de rigidez, aparece invariante en 0,5 ± 0,4 kPa, lo que indica que las células R tienen una muy limitada o ninguna interacción con su microambiente mecánica. El estudio también indicó que AFM células R son mecánicamente más suave que las células E, lo que potencialmente puede aumentar su maleabilidad para permitir la invasión más eficiente de los tejidos diana después de
in vivo
metástasis.
Uso de Microscopía de Fuerza Atómica , se determina la rigidez de las células HCT-8 E cultivadas en el sustrato degradado. Las células HCT-8 E aumentan su rigidez celular como los sustratos se hacen más rígido. Para facilitar la comparación entre diferentes celdas de igual rigidez sustrato, cinco regiones de igual espaciados en toda la gama de rigidez se designan: región 1 abarca 1-4 kPa, la región 2 abarca 5-8 kPa, la región 3 cubre 9-12 kPa, región 4 cubre 13-16 kPa, y la región 5 cubre 17-20 kPa. (A) A partir de la región 1 a la región 5, la rigidez de células E aumenta progresivamente con valores de 1,42 ± 0,85 kPa a 1,90 ± 0,77 kPa, 2,06 ± 1,39 kPa, 2,15 ± 1,28 kPa, y 3,82 ± 1,98 kPa, respectivamente. Por el contrario, en sustratos de gel con gradiente misma rigidez, las células metastásicas R post muestran rigidez celular casi invariante. (B) Fase de contraste de imágenes de células HCT-8 E sobre sustratos PA gradiente.
5. islas de células E muestran la adhesión no específica alta en comparación con las células R
La superficie adherencias no específicos de las células HCT 8 E (4
º día de la cultura en gel PA) y las células se midieron utilizando R un sensor de fuerza bio-MEMS micro-fabricados (Fig. 4 y Materiales y Métodos) [1], [30], [31]. El sensor consiste en una viga microcantilever con relación fuerza-desplazamiento calibrado (ver Materiales y Métodos). Hay una sonda plana (anchura 15 micras y la profundidad 5 micras) unido a la viga, que forma contacto adhesivo con las células (Fig. 4a). El sensor está hecho de silicio de cristal único, y está recubierto con una fina capa de óxido de silicio nativo (SiO
2). La sonda y el sensor no están funcionalizados. El sensor se manipula con una etapa piezo x-y-z. La sonda plana se pone en contacto con la superficie convexa lateral de células E islas en el límite. Cada isla celda E consta de 100 s de las células con varias celdas de apilamiento en la periferia isla (Fig. 4b). Después de un contacto de 2 minutos, el sensor de fuerza se retira horizontalmente desde la isla de células a una velocidad constante de 2,1 ± 0,4 micras /s (Fig. 4C). El tiempo de contacto fue elegido como 2 minutos, ya que la duración de contacto prolongado podría dar lugar a la deposición celular de ECM en la sonda y complicar el análisis. Debido a la adhesión de las células-sonda, el haz sensor se deforma durante la retracción, es decir, las células se aplican una fuerza de recuperación en contra de la separación. La duración de contacto corto entre la célula y la sonda impide la activación de las integrinas celulares y la formación de cualquier adhesión focal en la sonda (se lleva a & gt; 30 minutos para formar [32], [33]). Por lo tanto, las interacciones adhesivas solamente no específicos se pueden formar entre la superficie de la célula y la
2 recubierto sonda SiO.
(a) El sensor de fuerza no funcionalizado micro-fabricada de Si con una sonda plana y cuando se conoce la relación esfuerzo-deformación es manipulado por un xyz piezo-etapa de alta resolución para ponerse en contacto con la superficie convexa lateral celulares islas (en el plano xy). (B) La microscopía confocal de islas de células muestran la altura de islas es del orden de 30~50 micras. La altura vertical de la sonda bio-MEMS es 5~10 micras. (C) Después de un contacto de 2 minutos, sensor de fuerza se tira horizontalmente de distancia a una velocidad constante de 2,1 ± 0,4 m /s. Mientras que la adhesión celular entre la superficie de la sonda y de células impide la retracción del sensor, los haces de los sensores se deforman por δ, dando a la fuerza F. Tenga en cuenta que la sonda no está funcionalizado. El contacto de 2 minutos entre la sonda y las células impide la activación de las integrinas celulares y la formación de cualquier adhesión focal celular, que tiene & gt;. 30 minutos para formar
Hemos encontrado que, durante la retracción de las islas sensor bio-MEMS, célula e se extienden localmente por 15 a 20 micras que resulta en una forma cónica (ver los dos esquemas en la Fig. 4C y la fase de contraste de imágenes en la Fig. 5). Nota este tramo es diferente de que, debido únicamente a la membrana de sujeción, que consiste en estirar únicamente la bicapa de fosfolípidos. Durante la retracción de la sonda, el cono se estira de forma continua con el aumento de θ ángulo de contacto, mientras que el contacto célula con la sonda de gotas de una manera por etapas (Fig. 5b-5d). El aumento de la fuerza entre la célula y la sonda se refleja en el aumento progresivo de la distancia entre una referencia fija y la sonda (de D
0 a D
1 y D
2). la fuerza de la célula se calcula a partir del cambio del espacio de separación y la fuerza-deformación de calibración del muelle sensor. A un valor crítico de la fuerza, F
c, el cono se separa de repente de la sonda (Fig. 5d-e). Por E-células, F
c es la fuerza máxima en las curvas de fuerza-desplazamiento. Consideramos F
c como una medida de la adhesión celular-sonda. Medimos Fc para 12 de tales grupos de células y obtuvimos F
c = 256,3 ± 33,7 nN (n = 12). Experimentos similares con células R demuestran insignificante de adhesión celular-sonda con F
c = 1,14 ± 0,13 nN (n = 25; Fig. 6). Por lo tanto, las células R tienen adherencia no específica insignificante en comparación con las células E y por lo tanto parecen estar en un estado "lubricado", tal vez lo que les permite adaptarse a paso a través de los lechos capilares vasculares durante
in vivo
metástasis.
(a) intercelular adhesivo fuerza de desprendimiento de una isla de celda de la sonda de MEMS. La fuerza aumenta monótonamente con estiramiento hasta que el desprendimiento. (B-e) Las imágenes de contraste de fase de un experimento típico de adhesión. La fuerza se calcula a partir de la deformación de la viga sensor
D
y la curva de calibración de fuerza-deformación. La fuerza de desprendimiento crítico, F
c, es la fuerza máxima en las curvas de fuerza-desplazamiento. Durante el estiramiento, el ángulo de contacto θ entre la sonda y los aumentos de la isla de células, pero el tamaño de la zona de contacto entre la sonda y la isla de células sigue reduciendo. Barra de escala = 40 um.
(a) la fuerza adhesiva de las células R en la sonda de MEMS medida que la sonda se separa de las células después de 2 min de contacto (n = 25). (ser). imágenes de contraste de fase de R sonda células y MEMS cuando se mide la adherencia no específica entre ellos. La fuerza máxima de desprendimiento medida es & lt; 2,5 nN, mientras que la deformación celular es apenas perceptible. Barra de escala:. 40 micras
Discusión
A nuestro entender, el presente estudio es el primero en describir y evaluar el cambio en la sensibilidad mecánica en las células de cáncer de colon humano durante una metástasis similar transición producido por únicamente cambiando el microambiente mecánica durante
in vitro Francia culture. En un trabajo anterior se informó HCT-8 células ejecutar una transición E-a-R en 21~40 sustratos kPa rigidez [1]. El presente estudio emplea con eficacia un enfoque sistema de análisis combinatorio utilizando sustratos rigidez de gradiente, ensayo contador Coulter, de fuerza atómica microcopy (AFM) y sensores de fuerza Bio-MEMS para explorar el cambio mechanosensitivity cuantitativa de células de carcinoma de colon humano HCT-8 epitelial E, ya que el tránsito de las células R-forma redondeada. Encontramos, provocada por las señales sustrato rigidez apropiadas, que las células HCT-8 R pierden su sensibilidad tanto a la microambiente sustrato, así como su interacción con las células vecinas R y E. Como resultado, las células HCT-8 R adquieren autonomía para la supervivencia como células independientes de anclaje, móvil, que es una característica esencial de los primeros eventos de la metástasis de las células del cáncer [3], [4], [5], [6], [16], [20], [30], [34], [35].
las propiedades físicas de los sustratos de cultivo se encuentran ampliamente para afectar la expresión de genes y fenotipos de un número de células normales y cancerosas [1], [17], [18], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55]. Para responder al sustrato estímulos, las células se adhieren y se extienden sobre el sustrato seguido de la detección y procesamiento de ambas señales mecánicas y químicas [26], [37], [44], [46], [49], [53], [55 ], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Como hemos demostrado anteriormente [1], después de un cultivo de 7 días en sustratos blandos, HCT-8 células sufren un correo a la transición R se caracteriza por células R disociación de la capa de células epiteliales padre o islas de células. Estas células disociadas R muestran adherencia notablemente disminuida (tanto específica como no específica [1], [24], [29]) en comparación con sus homólogos de células E. A diferencia de las células E, las células HCT-8 R disociadas muestran las interacciones célula-sustrato independientes de sustrato-rigidez. Su proliferación no se vea afectada por el anclaje débil con el sustrato de cultivo o de otras células (Fig. 1). la independencia de anclaje es una característica distintiva de las células metastásicas [7], [21], [36]. De hecho, nuestro reciente
in vitro
ensayos de invasión de células de la membrana basal indican que las células HCT-8 R son significativamente más invasivas que las células E [24].
Nuestro descubrimiento de un E-a-R transición en el HCT-8 células de colon sugiere que adenocarcimona sustrato apropiado suavidad mecánica puede promover o ayudar en la iniciación de los primeros eventos en la metástasis de las células cancerosas, y la pérdida de sensibilidad mecánica irónica, lo que podría ayudar en la extensión vascular hasta sitios diana de tejidos distales. Este estudio revela que las células de cáncer de colon pueden alcanzar este rasgo únicamente por la cultura sobre el sustrato apropiadamente suave. Actualmente estamos evaluando si las células de I muestran un comportamiento metastásico mejorada en estudios con animales, en comparación con las células E. Si E a la transición R se correlaciona con la adquisición de la actividad metastásica mejorado, manipulación del microambiente mecánico puede servir como un atractivo
vitro
modelo para investigar en los primeros eventos de la metástasis de las células del cáncer, así como para la detección de la posible anti- agentes terapéuticos metastásico.
Materiales y Métodos
1. Cultivo celular, formación de imágenes de microscopía y PA preparados geles
adenocarcinoma de colon humano HCT-8 células (ATCC No .: CCL-244) se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco No .: 23400-062), complementado con 2 gramos de bicarbonato de sodio por litro, dando una concentración final de suero de caballo al 10% (Gibco No .: 26050-088), 1 × antibiótico-antimicótico (Gibco No .: 15240-062) y 1 mM de piruvato sódico (Gibco No .: 11360) [1]. Se obtuvieron células MA104 (embrionarias de riñón de mono africano verde) de MA Bioproducts y se cultivaron en MEM (Gibco No .: 41500-018), complementado con 2 gramos de HEPES por litro, 2,2 gramos de bicarbonato de sodio por litro, 1 × antibiótico-antimicótico como anteriormente, y 5% de suero bovino fetal (Gibco No .: 16140). El fibroblasto de riñón de mono (MKF) línea celular (CV-1, ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en un medio con 90% de DMEM (ATCC, Manassas, VA), 10% de FBS (ATCC, Manassas, VA) y 1 × antibiótico-antimicótico (Gibco No .: 15240-062). La densidad celular antes de chapado se contó con hemocitómetro estándar. incubadora de cultivo celular estándar se utiliza para proporcionar la condición de cultivo con suficiente humedad, 37 ° C de temperatura, y 5% de CO
2. (1).