Extracto
La mucina es una MUC4, unida a las proteínas de la membrana, y altamente glicosilada de alto peso molecular. Es una proteína multi-dominio que supuestamente escinde en una subunidad grande similar a la mucina (MUC4α) y un factor de crecimiento C-terminal como subunidad (MUC4β). MUC4 juega un papel crítico en condiciones fisiológicas y patológicas y se sobreexpresa de forma aberrante en varios cánceres, incluidos los del páncreas, cuello uterino, de mama y de pulmón. También es un biomarcador potencial para el diagnóstico, el pronóstico y la progresión de varios tumores malignos. Además, MUC4 juega diversos papeles funcionales en la iniciación y progresión del cáncer como se desprende de su participación en la transformación oncogénica, la proliferación, la inhibición de la apoptosis, la motilidad y la invasión, y la resistencia a la quimioterapia en las células cancerosas humanas. Hemos generado previamente un anticuerpo monoclonal 8G7, que está dirigido contra la región TR de MUC4, y se ha utilizado ampliamente para estudiar la expresión de MUC4 en varios tumores malignos. A continuación, describimos la generación de anticuerpos anti-MUC4 dirigidos contra las regiones no-TR de MUC4. Recombinante de glutatión-S-transferasa (GST) -fused fragmentos MUC4α, tanto aguas arriba (MUC4α-N-Ter) y aguas abajo (MUC4α-C-Ter) del dominio TR, se utilizaron como inmunógenos para inmunizar ratones BALB /c. Después de la fusión celular, los hibridomas fueron seleccionados utilizando los antes mencionados proteínas recombinantes de anuncios lisados de líneas celulares pancreáticas humanas. Tres anti uno anticuerpos anti-MUC4α-C-Ter MUC4α-N-Ter y se caracterizaron por varios inmmunoassays incluyendo ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia, mediante inmunofluorescencia, citometría de flujo e inmunoprecipitación usando MUC4 expresan líneas celulares de cáncer de páncreas humano. Los anticuerpos también reaccionaron con el MUC4 en secciones de tumores pancreáticos humanos en el análisis inmunohistoquímico. Los nuevos anticuerpos anti-MUC4 específicos de dominio servirán como reactivos importantes para estudiar la relación estructura-función de los dominios MUC4 y para el desarrollo de diagnósticos y terapéuticos basados en MUC4
Visto:. Jain M, G Venkatraman, Moniaux N, Kaur S, Kumar S, Chakraborty S, et al. (2011) Anticuerpos monoclonales Reconociendo las Repetir las regiones no tándem de la mucina MUC4 humano en el cáncer pancreático. PLoS ONE 6 (8): e23344. doi: 10.1371 /journal.pone.0023344
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2011; Aceptado: 12 de julio de 2011; Publicado: 23 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Jain et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores en este trabajo se apoyan, en parte, por subvenciones de los Estados Unidos Departamento de Defensa (BC074639, BC083295, BC09742 y PC074289) y los Institutos nacionales de Salud (R21 CA156037, RO1 CA78590, UO1 CA111294, RO1 CA131944, RO1 CA133774, RO1 CA138791, SR3 CA 139285 y CA127297 P50). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
MUC4 humana es una mucina asociada a la membrana altamente glicosilada, que consiste en una subunidad de 850 kD-mucina-como gran MUC4α, y un factor de crecimiento similar a 80 kD subunidad unida a la membrana MUC4β [1], [2] . MUC4α contiene un dominio de repetición central de tándem (TR) que contiene un número variable de 16 motivos de residuos de aminoácidos que podría repetirse hasta 400 veces por molécula. El dominio TR está flanqueada por una cisteína dominio rico en C-terminal y un dominio N-terminal que contiene tres repeticiones de 123 residuos de aminoácidos [1]. MUC4β contiene un dominio rico en cisteína, un dominio rico en sitios de N-glicosilación y tres dominios similares al EGF [1]. MUC4 se considera que es un homólogo humano de rata sialo-mucina complejo (SMC, rata Muc4) debido a las similitudes en la organización estructural [1], [3], [4]. SMC es una glicoproteína heterodimérica compuesta de una subunidad de mucina O-glicosilada, ascitis sialoglicoproteína (ASGP-1), fuertemente unido a una subunidad de transmembrana N-glicosilada, ASGP-2, que contiene dos dominios de factor de crecimiento epidérmico-como en su parte extracelular [ ,,,0],3], [4].
MUC4 se expresa en diversos tejidos epiteliales, incluyendo el epitelio de los pulmones del feto y del adulto tracto respiratorio de la tráquea a la tráquea conductos colectores de pulmón [5], colon [6], endocérvix [7], la conjuntiva [8], la córnea [9], las glándulas salivales [10], oído medio y la trompa de Eustaquio [11]. En estudios recientes, un aumento progresivo en la expresión MUC4 se ha observado en las lesiones neoplásicas intraepiteliales pancreáticas, lo que indica su papel en el desarrollo de la enfermedad [12]. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que la inhibición de la expresión MUC4 utilizando ARN corto de interferencia (siRNA) oligonucleótidos específicos para MUC4 resultados en una disminución de la tumorigenicidad antisentido o y la difusión de las células del cáncer [13]. Además, nuestros estudios recientes han demostrado que MUC4 resulta en la transformación oncogénica de fibroblastos de ratón [14], contribuye a la resistencia a fármacos de las células de cáncer de páncreas mediante la activación de las vías de anti-apoptosis [15], y está implicado en el epitelio mesenquimales a transición en células de cáncer de ovario [16]. Estos estudios de nuestro laboratorio y otros grupos indican la importancia potencial de esta mucina en diversos aspectos de la biología del tumor.
Hemos generado previamente un panel de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la región TR de MUC4 [17]. Uno de los anticuerpos anti-MUC4 TR, 8G7, ha servido como un reactivo valiosa para estudiar la expresión de la MUC4 mucina en diversos tejidos y desentrañar su participación en diversos tumores malignos incluyendo, pancreáticas [12], [18], gástrico [19] , cuello del útero [20], el cáncer de ovario [21], el carcinoma hepático conducto biliar adicional [22], colangiocarcinoma [23], y el carcinoma cutáneo de células escamosas. Sin embargo, MUC4 contiene muchos dominios estructurales y funcionales, tanto aguas arriba y aguas abajo de la región de TR [1], [2], y muchas formas de corte y empalme de MUC4 están completamente desprovistas de la región de TR [24], [25]. Además, la región de TR está fuertemente O-glicosilada. Dada la alteración en el estado de glicosilación de los tumores sólidos, es posible que la reactividad con el anticuerpo puede ser oscurecida en ciertas enfermedades malignas. Por lo tanto, la complejidad estructural de MUC4, la existencia de numerosas variantes de empalme y glicoformas, y pesado O-glicosilación en el dominio TR justifica la generación de anticuerpos adicionales para entender completamente la relación estructura-función de diversos dominios MUC4 en condiciones fisiológicas y patológicas.
a continuación, se presenta la generación y caracterización de una nueva anticuerpos monoclonales anti-MUC4 que reconocen las regiones de MUC4α tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio TR. fragmentos MUC4 recombinante purificada, fusionados en marco con GST, se usaron como inmunógenos y se seleccionaron clones positivos en base a su reactividad en ELISA. Los clones seleccionados se caracterizaron por su reactividad hacia MUC4 en inmunotransferencia, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia y citometría de flujo usando células de cáncer de páncreas. Los MAbs no TR anti-MUC4 desarrollados en este estudio pueden ser reactivos prometedoras para el desarrollo de ensayos para la cuantificación de MUC4 en los tejidos y fluidos biológicos, para estudiar el papel funcional de MUC4 en diversas enfermedades y, potencialmente, para la inmunoterapia.
resultados
La estructura esquemática de MUC4 y los dominios recombinantes se indican en la figura 1a. Después de la fusión de células, sobrenadantes de cultivo de hibridomas estables fueron seleccionados y los hibridomas positivos que exhiben alta reactividad con la proteína recombinante y reactividad negativa con GST se clonaron mediante tres rondas de dilución limitante. Se obtuvieron siete clones estables reactivos con MUC4α-N-Ter y tres clones reactivos con MUC4α-C-Ter (Tabla 1 y la Figura 1b). MAb 2172, 2173, 2175, 2212, 2213, 2214 y 2382 mostró reactividad específica hacia MUC4α-N-Ter, mientras que los MAb 2103, 2106 y 2107 eran específicos de MUC4α-C-Ter. Además, ninguno de los anticuerpos seleccionados mostró ninguna reactividad hacia purificado péptido MUC4 TR, BSA o GST (datos no mostrados). Del mismo modo, generado previamente anticuerpo anti-MUC4 TR 8G7 o K2G6 anticuerpo anti-KLH no mostraron reactividad hacia los dominios MUC4 recombinantes.
a) Estructura esquemática de MUC4 y proteínas recombinantes utilizados en el estudio. MUC4 se escinde supuestamente en el sitio GDPH para generar un N-terminal de tipo mucina subunidad MUC4-α y un crecimiento de tipo factor de subunidad MUC4-β C-terminal. dominios importantes de MUC4 están marcados. dominios recombinantes de MUC4- α correspondientes a los fragmentos aguas arriba y aguas abajo de la repetición en tándem (TR) de dominio se clonaron y se expresa como se describe en Materiales y Métodos y denomina MUC4-α-N-ter-α y MUC4-C-Ter, respectivamente. Los números de los nucleótidos correspondientes a los límites de los dominios recombinantes se marcan y se describen en Moniaux et al. y Choudhury et al (Ref 1 y 24, respectivamente) de acuerdo con la numeración original. Cys-rica en cisteína dominio de crecimiento epidérmico EGF-como factor de dominio; dominio TM-transmembrana; CT-citoplasma de la cola. b) ELISA que muestra la reactividad de MAb anti-MUC4 a inmunógenos recombinantes. Los MAbs indicadas se incubaron con los 2,5 mg /ml de GST-etiquetados dominios recombinantes N-terminal y de repetición en tándem de MUC4. Las especificidades también fueron probados contra el péptido MUC4 TR, GST y una proteína de control de albúmina de suero bovino no específica y los anticuerpos mostraron reactividad negativa contra estos antígenos. El ensayo también incluía un isotipo emparejado K2G6 no específico de control.
Los anticuerpos se ensayaron adicionalmente por su capacidad de reconocer específicamente la proteína MUC4 en los lisados de líneas celulares que expresan MUC4 cáncer de páncreas en inmunotransferencia. De los siete anticuerpos MUC4α-N-Ter-específicas sólo MAbs 2214, 2175 y 2382 reconocieron la proteína MUC4 en los lisados celulares (Figura 2). MAbs 2215 y 2382 reconocieron bandas de proteína de alto peso molecular en los lisados de las células positivas MUC4 (HPAF /CD18, Colo357, QGP1 y T3M4) (Fig. 2A y 2C) y el patrón de reactividad fue similar a la de anti-TR MAb 8G7 (Fig. 2d). Cada una de las líneas de células positivas MUC4 exhibieron un tamaño de banda característicamente distinto que es consistente con informes anteriores de los polimorfismos VNTR en MUC4 con HPAF /CD18, Colo357 y QGP1 que muestra una única banda y T3M4 expresar dos bandas (alélica polimorfismo VNTR). A diferencia de MAbs 2175, 2382 y 8G7, MAb 2214 reaccionó predominantemente con la forma de bajo peso molecular de MUC4 pero con el patrón de banda correspondiente al polimorfismo VNTR (Figura 2b). Mab 2214 también mostró reactividad muy débil con la banda de alto peso molecular correspondiente a los reconocidos por otros anticuerpos en QGP1 y T3M4 lisados. El análisis por inmunotransferencia de β-actina en los lisados SDS-PAGE resueltos indica la carga igual de proteínas (Figura 2, recuadro). No se observó reactividad con cualquier anticuerpo con el lisado de la línea celular negativa MUC4 MiaPaCa. Ninguno de los anticuerpos anti-MUC4α-C-Ter hace reaccionar con MUC4 en los lisados celulares en inmunotransferencia (datos no mostrados).
Un total de 20 g de proteína de los extractos celulares se resolvieron mediante electroforesis en un 2% gel SDS-agarosa, se transfirió a una membrana de PVDF, y se incubaron con 2 g /ml de MAb 2175 (a), 2214 (b), 2382 (c) o 1 mg /ml de anti-MUC4 TR Mab 8G7 (d). La membrana se sondeó con cabra marcado con peroxidasa de rábano picante anti-inmunoglobulina de ratón. La señal se detectó usando un kit de reactivo ECL. La posición de las bandas detectadas se indica mediante flechas. Para el control de carga, de inmunotransferencia para la detección de β-actina (recuadro a) se realizó en lisados de células respectivas se resolvieron en 10% SDS-PAGE.
La capacidad de los anticuerpos para reconocer MUC4 en el intacta Las células se estudió por inmunofluorescencia y citometría de flujo. En las celdas de metanol fijo y el ensayo se permeabilizaron HPAF /CD18 todos los anticuerpos monoclonales seleccionados mostraron tinción específica para MUC4; no se observó tinción con el K2G6 anticuerpo anti-KLH de control (Figura 3). MAb 2214 mostró una membrana de ambos y la tinción perinuclear, mientras MAbs 2175, 2382 y 2106 mostraron citoplasmática y la membrana de la tinción. El anti-TR MAb 8G7 mostraron reactividad más fuerte debido a la naturaleza repetitiva de los epítopos. Además, ninguno de los anticuerpos mostró ninguna reactividad con las líneas celulares de cáncer pancreático negativos MUC4 MiaPaCa o Panc1 (datos no mostrados). Para la tinción de superficie celular, se utilizaron células paraformaldehído-fijo (unpermmeabilized) y la unión de los anticuerpos se analizó mediante citometría de flujo. MAb 2214 mostró la reactividad más fuerte con la superficie celular en las células con paraformaldehído fijo, mientras que la reactividad de la superficie de MAbs 2175 y 2382 era débil y los valores de la intensidad de fluorescencia media (MFI) fueron comparables a los valores obtenidos con MAb 8G7 (Figura 4).
Las células fueron cultivadas a baja densidad en la cubierta toboganes esterilizados, se fijaron en metanol enfriado con hielo a -20 ° C y se incubaron con 10 mg /ml no TR anticuerpos monoclonales de 2214, 2175, 2382 y 2106, o 2 mg /ml de anti-MUC4 TR MAb 8G7 (control) y se detectó usando anticuerpo secundario conjugado con FITC. K2G6 anticuerpo anti-KLH se usó como un control de isotipo. Las células fueron montadas en portaobjetos de vidrio utilizando anti-fade Vectashield medio de montaje y se observaron con un microscopio confocal de barrido láser ZEISS (ampliación, × 630).
Las células se recogieron de forma no enzimática, se fijaron con paraformaldehído y se incubaron con los anticuerpos indicados. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las células se analizaron utilizando BD FACSCalibur. Las intensidades de fluorescencia media (MFI) los valores obtenidos con cada anticuerpo está indicado en los paréntesis.
Los anticuerpos anti-MUC4 específicos de dominio también se probaron por su capacidad para inmunoprecipitar MUC4 utilizando el lisado /CD18 HPAF. MAbs 2382 2175, y 2214 inmunoprecipitaron de longitud completa MUC4 a partir de los lisados de células totales, que se visualizó en las que las muestras procesadas se resolvieron en gel de agarosa-SAS y a inmunotransferencia con anti-MUC4-TR MAb 8G7 (Figura 5). Las muestras inmunoprecipitadas de diversos anticuerpos también se inmunotransfirieron con MAb 2214 debido a su reactividad predominante con una forma de peso molecular inferior de MUC4. Cuando se sondearon con MAb 8G7, la cantidad más alta de MUC4 se inmunoprecipitó con 8G7, mientras que MAb 2382 también resultó en considerable enriquecimiento de las bandas de proteína reactiva 8G7. MAb 2175 y 2214 también se inmunoprecipitaron los de larga duración 8G7 banda reactiva, pero el enriquecimiento no fue tan fuerte como se ha observado con anticuerpos monoclonales 8G7 y el MAB 2106 y el control negativo anti-KLH K2G6 anticuerpo 2382. Anti-C-terminal no tire hacia abajo cualquier 8G7 reactiva banda de proteína. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos ensayados, excepto 2214, immunopecipitated el MAb forma molecular bajo 2214-reactiva peso de MUC4.
Proteína lisados de las células CD18 /HPAF MUC4 que expresan se inmunoprecipitaron usando 5 mg /ml de 8G7 ( repetición en tándem MAB), 2382, 2214 y 2175 (para no repetir tándem MAb) y K2G6 (MAb isotipo control) y se sometieron a inmunotransferencia usando anticuerpos monoclonales 8G7 y 2214 como se describe en Materiales y Métodos.
La capacidad de los anticuerpos para detectar MUC4 en los tejidos tumorales se ensayó mediante análisis inmunohistoquímicos realizados en tejidos de cáncer de páncreas. MAbs 2214, 2175 y 2382 mostró tinción positiva en el tejido tumoral que se determinó que era MUC4 positivo basado en su reactividad con anti-TR MAb 8G7 (Figura 6). El patrón de tinción con los nuevos anticuerpos era similar a la observada con 8G7 que muestra tinción difusa tanto en la membrana y el citoplasma de las células tumorales. No se observó tinción con Mab 2106 o el control de isotipo no específico emparejado MAb K2G6.
secciones de parafina se incubaron con los anticuerpos de prueba y de control que se indica y la unión se detectó usando el kit de tinción VECTOR Universal. MAb 8G7 se utilizó a una concentración de 2 g /ml, mientras que todos los demás anticuerpos se utilizaron a una concentración de 10 mg /ml.
Discusión
MUC4 es una glicoproteína grande implicado en la fisiología y el implicado en varios estados de enfermedad. De particular importancia es su papel en el desarrollo del cáncer de páncreas y la progresión [2], [26], [27]. Un número de estudios recientes han establecido el papel de la mucina transmembrana MUC4 en la patogénesis de varios tumores malignos. MUC4 consiste en dos dominios, a saber, MUC4α que tiene la región de repetición en tándem y MUC4β que tiene la región trans-membrana y también posee el factor de crecimiento como dominios [1], [2]. Debido al polimorfismo en el número de repeticiones en tándem [28] y la existencia de diversas formas de empalme completamente desprovisto del dominio TR [25], los anticuerpos que reconocen las regiones de repetición no en tándem de la proteína que podría proporcionar información útil acerca de su función , posibles socios que interactúan y lo más importante se pueden utilizar en ensayos cuantitativos.
Tres de los anticuerpos dirigidos contra la región aguas arriba del dominio central de TR 2214, 2175 y 2382, y uno de los anticuerpos generados contra la corriente abajo de el dominio TR, 2106 mostró una fuerte reactividad frente a los respectivos dominios recombinantes en ELISA. Ninguno de los anticuerpos reconocen los dominios recombinantes, GST o TR sintético péptidos no específicos. Estos anticuerpos pueden servir potencialmente como reactivos útiles para el desarrollo de bioensayos MUC4 y pueden complementar el anticuerpo anti-MUC4 TR existente o otros anticuerpos reactivos contra los epítopos de hidratos de carbono presentes en mucinas (DUPAN2, CA 19.9, TAG 72). La creciente evidencia sugiere que la MUC4 mucina, debido a su sobreexpresión en varios tumores malignos, es un marcador potencial para el diagnóstico [27], en particular para el cáncer de páncreas letal cuando se haya establecido su asociación con las lesiones neoplásicas tempranas [29]. Otro estudio reciente ha demostrado MUC4 ser un factor pronóstico novela de carcinoma de conducto biliar extrahepático [22]. MUC4 expresión se correlaciona con mal pronóstico en el adenocarcinoma de pulmón de pequeño tamaño [30]. Todos estos estudios han demostrado que MUC4 podría ser un jugador clave en la tumorigénesis; Sin embargo, todos estos estudios han analizado MUC4 en muestras de tejido, lo que podría ser limitado por los errores de muestreo, debido a la expresión heterogénea de antígenos tumorales. Por lo tanto, sería lógico para desarrollar ensayos cuantitativos para MUC4 en fluidos biológicos, que será no invasivo, rentable y fácilmente automatizado. Debido al tamaño variable de la región de repetición en tándem, el anticuerpo que reconoce la región de repetición en tándem no se podía utilizar para fines cuantitativos. El dominio anticuerpos específicos pueden ayudar potencialmente en el desarrollo de
in vitro
ensayos de diagnóstico para cuantificar MUC4 en el suero y otros fluidos biológicos.
Todos los anticuerpos reactivos con la región aguas arriba del dominio MUC4 TR fueron capaces reconocer MUC4 en los lisados celulares de las células de cáncer de páncreas MUC4-expresión. MAbs 2175 y 2382 reconocieron la longitud completa MUC4 con un alto peso molecular, con un tamaño de banda similar a la reconocida por MAb anti-TR 8G7. La diferencia en la intensidad de señal de los anticuerpos no-TR y TR podría atribuirse al número de epítopos disponibles para el MAb para unirse, ya 8G7 reconoce la región de repetición en tándem, que está representado varias veces en cada molécula, mientras que los epítopos reconocidos por 2175 y 2382 están representados sólo una vez por molécula. Por el contrario, Mab 2214 exhibió un fuerte reconocimiento de una banda de proteína de un tamaño más pequeño que los reconocidos por anticuerpos monoclonales 8G7, 2175 y 2382. A pesar de su tamaño molecular más bajo, estas bandas reflejan la variación alélica exhibida por los de larga duración MUC4 de las respectivas líneas celulares , lo que sugiere que el mAb 2214 posiblemente reacciona con una forma inmadura o underglycosylated de MUC4. bandas muy débiles correspondientes a la proteína madura de alto peso molecular todavía se detectaron en QGP1 y T3M4. La intensidad de la señal más fuerte de Mab 2214 con las bandas inferiores podría ser debido a la abundancia de una proteína MUC4 inmaduros en las células cancerosas. En las células de cáncer que está bien establecido que, debido a la glicosilación aberrante e ineficiente, mucinas se hipoglicosilada y estas formas inmaduras continuamente se someten a ciclos de internalización repite, lo que resulta en una forma más inmadura de la forma madura. Sin embargo, en la membrana desglicosilación (enzimática o química) de bandas de proteínas se resolvieron no aumentar la reactividad del Mab 2214 con las bandas MUC4 maduros (datos no mostrados). Sin embargo, en las células paraformaldehído fijo, MAb 2214 exhibió la más alta reactividad con la superficie celular. La proteína inmadura es poco probable que esté presente en la superficie celular y, posiblemente, la fijación de las células con paraformaldehído expuesto el epítopo reactivo MAb 2214. Además de la caracterización de la forma de bajo peso molecular de MUC4 reactivo con MAb 2214 está en marcha. Análisis
inmunofluorescencia mostró tinción específica para MUC4 en las membranas, así como en los compartimentos citoplasmáticos de células /CD18 HPAF. El patrón de tinción era comparable con el anti TR Mab 8G7 y su especificidad para MUC4 fue apoyado además por la falta de señal en las células negativas MUC4. La tinción perinuclear de Mab 2214 apoya aún más su reactividad a la proteína inmadura.
Debido a su gran tamaño y multi-dominio de la organización, MUC4 potencialmente puede interactuar con muchas proteínas y estas interacciones podría ser la clave para diversas funciones atribuidas a MUC4. Su interacción con HER2 y la importancia funcional de esta interacción ha sido bien estudiado [31], [32]. Sin embargo, hay muchos otros socios que interactúan potenciales de MUC4 que podrían jugar un papel importante en la modulación de la función o mediar MUC4. MAbs 2175 y 2382 fueron capaces de inmunoprecipitar la proteína MUC4 partir de los lisados celulares de células /CD18 HPAF y por lo tanto podrían ayudar en el aislamiento y la identificación de socios adicionales que interactúan MUC4. Además, la reactividad predominante de MAb 2214 a MUC4 de menor peso molecular es sugerente de una forma diferente de MUC4 que co-existe con la proteína madura. Si, de hecho, es la forma inmadura de la proteína, entonces el MAb 2214 potencialmente puede ayudar en el aislamiento de varios socios que interactúan novedosos que pueden interactuar con esta forma de MUC4 y desentrañar su significado funcional.
MAbs 2214, 2175 y 2382 también reconoció MUC4 expresa en los tejidos de cáncer por el análisis inmunohistoquímico con el patrón de reactividad similar a la observada con anti-TR Mab 8G7. Ninguno de los conductos pancreáticos normales se tiñeron, lo que está de acuerdo con nuestros estudios anteriores que han mostrado una ausencia de expresión MUC4 en los conductos no neoplásicas. Los nuevos anticuerpos pueden ser herramientas útiles para corroborar los resultados obtenidos a partir de 8G7, lo que sugiere la sobreexpresión de MUC4 en diversos tumores malignos. Además, debido a la naturaleza no repetitiva de su epítopo reactivo, los anticuerpos desarrollados recientemente proporcionarán una medida más razonable de la medida de la sobreexpresión mediante la negación de los efectos de VNTR polimorfismo. El anti-TR anticuerpo 8G7, sin embargo, proporcionaría una mayor sensibilidad de la detección debido a la multiplicidad de los epítopos. Por lo tanto, la combinación de anti-TR y los anticuerpos anti-TR no MUC4 puede proporcionar una mejor información sobre el alcance de MUC4 sobreexpresión en los tejidos tumorales.
Se están realizando esfuerzos para estudiar los efectos inhibidores directos de los anticuerpos en el cáncer el crecimiento celular, la motilidad y la invasión tanto bajo
in vitro Opiniones y
in vivo
condiciones. Nuestros estudios recientes han demostrado que MUC4 contribuye a la quimiorresistencia en las células de cáncer de páncreas mediante la activación de las vías de anti-apoptóticas y la promoción de la supervivencia celular [15]. Por lo tanto, será de interés para estudiar el efecto de los anticuerpos anti-MUC4 en la inducción de apoptosis en células de cáncer y aumentar su sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos. Además, estos anticuerpos también deben ser evaluados por su utilidad en radioinmunodiagnóstico y radioinmunoterapia de tumores que sobreexpresan MUC4. Los estudios funcionales utilizando los MAbs de repetición en tándem no probablemente pueden proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos mediados por MUC4 en la progresión del cáncer. Estos anticuerpos también podrían ayudar en la comprensión de MUC4 relaciones estructura-función, regulación de la expresión y, posiblemente, identificar un socio interactuar probable en la superficie de células tumorales, lo que podría ser la razón para el fenotipo metastásico.
En conclusión, nuestros estudios indican que los MAb 2175 y 2382 son altamente específicos en la detección de la región de repetición en tándem no de la mucina MUC4 por diversos inmunoensayos. Estos anticuerpos específicos de dominio servirían como reactivos útiles para desarrollar ensayos cuantitativos, y son herramientas valiosas para estudiar MUC4 relaciones estructura-función y posiblemente apuntar MUC4 para la terapia de tumores sólidos que sobreexpresan MUC4.
Materiales y Métodos
Ética declaración
el uso de animales para la inmunización y el aislamiento del bazo fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de animales Institucional (IACUC) Protocolo#94-025-12 titulado "Fondo para el anticuerpo monoclonal Core Protocolo de inmunización" .
tejidos tumorales pancreáticas humanas se obtuvieron de la Universidad de Nebraska Medical Center (UNMC) Banco de tejidos y su uso fue aprobado a través de la UNMC Junta de Revisión Institucional (IRB) la aprobación#491-97-EX.
Generación de dominios recombinantes MUC4
Regiones de MUC4-α a cada lado del dominio TR fueron clonado y expresado, y proteínas purificadas se utilizaron como inmunógenos. Se diseñaron cebadores específicos usando MUC4 secuencia AJ000281 para amplificar los fragmentos de nucleótidos 587 a 3361 [MUC4α-Amino Terminal (MUC4α N-ter)] y de los nucleótidos 1 hasta 1293 [terminal de MUC4α-carboxi (MUC4α C-ter), que representan las regiones inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del dominio TR, respectivamente (Figura 1a). BamHI y un sitios de restricción EcoRI se añadieron en los cebadores directo e inverso, respectivamente, lo que permite la clonación en marco con el GST y el sitio de escisión de trombina del vector pGEX-2TK (Pharmacia). La amplificación se realiza por el sistema de expansión a largo RT-PCR (Roche) como se ha descrito anteriormente utilizando JER103 y JER109 como plantillas para la secuencia de AJ00281 y AJ010901, respectivamente [1]. Las construcciones se secuenciaron para confirmar el marco de lectura apropiado y se mantuvieron en E. coli BL21 (New England Biolabs Inc.). Un precultivo 5 ml durante la noche de cada cepa recombinante se utilizó para inocular 1 litro de medio 2 x YTA (16 g de triptona, 10 g extracto de levadura y 5 g de NaCl en 900 ml de agua desionizada, 100 g /ml de ampicilina), y se hicieron crecer bajo agitación a 37ºC durante 3-4 h para alcanzar una absorbancia a 260 nm entre desde 0,6 hasta 0,8, inducida por 0,1 mM de IPTG, y se cultivaron durante una adición de 3 a 4 h. Los cultivos se centrifugaron y se lavaron tres veces en PBS helado, se resuspendieron en 5 ml de PBS enfriado en hielo, y se sonicaron. Proteína lisados se clarificaron por centrifugación y por filtración en un filtro de 0,22 micras. Los lisados se hicieron pasar a través de una columna de flujo rápido de 5 ml de glutatión Sepharose (Pharmacia), se lavó tres veces con 5 volúmenes de columna de PBS, y se eluyó con 10 ml de 15 mM glutatión reducido. Las fracciones de elución de 1 ml se recogieron y 5 alícuota l de cada fracción se resolvieron en 10% SDS-PAGE, y las proteínas detectadas por la tinción con azul de Coomassie. Las fracciones que contenían proteínas de fusión GST puras se reunieron y se cuantificaron utilizando el convertidor D /C Kit de estimación de proteína BIO-RAD (BIO-RAD).
Ratón Inmunización
La inmunización y selección de anticuerpos monoclonales se llevaron a a cabo utilizando los procedimientos establecidos en la Instalación UNMC anticuerpo del núcleo [17]. Brevemente, grupos separados de ratones (BALB /c) fueron inmunizados por inyecciones IP repetidas de las proteínas de fusión GST recombinantes MUC4α-N-Ter y MUC4α-C-TER a intervalos de dos semanas. En cada grupo, la inmunización con proteína recombinante se alterna con el lisado de las células MUC4 HPAF positivo /CD18 humanos pancreáticas cáncer [17]. Los sueros de estos ratones se evaluaron en ensayos de unión directa para la reactividad del anticuerpo con la proteína de fusión recombinante MUC4, y GST se utilizó como control negativo. Una vez que se observó una respuesta de anticuerpos apropiada en ELISA, los animales se les dio una inyección final de refuerzo con la proteína recombinante cuatro días antes de la exanguinación y la esplenectomía. Los esplenocitos se aislaron y se fusionaron con células NS-1 y /o Sp2 /0 de mieloma. Los hibridomas que producen los anticuerpos de interés se seleccionaron mediante el cribado por la unión al inmunógeno de interés de anticuerpos específicos (proteínas recombinantes y HPAF /CD18 de lisado) y la falta de unión a antígenos de control irrelevante (GST y BSA).
Screening para MUC4-positivo hibridomas
placas Immulon se recubrieron con 50 l de la preparación antigénica (proteínas recombinantes MUC4 o GST o de proteínas de lisados de líneas celulares positivas MUC4) a una concentración de 2,5 mg /pocillo en tampón de bicarbonato (pH 9,6 ). Las placas se incubaron durante la noche a 4 ° C. Las placas se lavaron en PBST y los sitios de unión libres de los pocillos se saturaron para eliminar la unión no específica de las inmunoglobulinas mediante la incubación con 200 l /pocillo de 2% no grasa de leche desnatada en PBS durante 2 horas a 37 ° C y las placas se lavaron en PBST. Ciento l del sobrenadante del cultivo fue transferido de los pozos de placas de cultivo en los pocillos correspondientes en las placas de ELISA. Ratón de suero pre-inmune se utilizó como control negativo en cada ensayo, se incubaron durante 1 h a 37 ° C, y luego se lavaron las placas de nuevo en PBST. El cien por l /pocillo de la peroxidasa anticuerpo conjugado (HRP anti-ratón, Amersham Biosciences, 1:2000 dilución en PBS) y se incubó durante 1 hora a 37 ° C. Las placas se lavaron en PBST y se añadieron 100 l de sustrato TMB (Dako sustrato) a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 l de ácido sulfúrico 2 M y las placas fueron escaneadas a 450 nm en un lector de placas de ELISA Biotech.
inmunoprecipitación
Proteína lisados de la HPAF MUC4 que expresan /células CD18 se inmunoprecipitaron usando 5 mg /ml de 2,382, 2,214, 2,175, 8G7 (anticuerpo anti-TR), y K2G6 (isotipo mAb de control reaccionar con KLH). Los complejos antígeno-anticuerpo formado fueron derribadas utilizando /G cuentas de Proteína A (Calbiochem) y los complejos fueron solubilizados mediante el uso de tampón de muestra de SDS que contenía 2-mercaptoetanol. Las muestras se resolvieron en 2% de gel de SDS-agarosa y se inmunotransfirieron usando 8G7.
Immunoblotting
Una serie de líneas de células pancreáticas fueron procesados para extracción de proteínas y transferencia Western utilizando procedimientos estándar [17] . Brevemente, las células se lavaron dos veces en PBS y se rasparon en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón [Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, 0,25% de desoxicolato de sodio; 1% de NP40 (pH 7,5)], que contiene mezcla de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y los inhibidores de fosfatasa (NaF 5 mM y 5 mM Na3VO4; Sigma Chemicals, St. Louis, MO), y se mantuvo a 4 ° C durante al menos 30 min.