Extracto
Antecedentes
Se determinó la expresión de la caja forkhead Q1 (FoxQ1) , e-cadherina (e-cad), mucina 1 (MUC1), vimentina (VIM) y la proteína de unión de calcio S100 A4 (S100A4), todos de transición (EMT), las proteínas indicadoras epitelio-mesénquima en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) muestras de tejido. También se investigó la relación entre estas cinco proteínas de expresión y otros factores clínico-patológicos en el CPNM. Por último, se evaluó el valor potencial de estos marcadores como indicadores de pronóstico de supervivencia en pacientes de NSCLC.
Métodos
Cuantitativo en tiempo real PCR e inmunohistoquímica se utilizaron para caracterizar la expresión del ARNm y FoxQ1 proteína en NSCLC. Expresión de las transcripciones y productos traducidos a las otras proteínas indicadoras de cuatro EMT se evaluó por inmunohistoquímica en las mismas muestras de NSCLC clínicas.
Resultados
FoxQ1 ARNm y proteínas se incrementaron en un reguladas en el CPNM en comparación con normalidad tejidos (
P = 0,015
y
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). La expresión de FoxQ1 en el adenocarcinoma fue mayor que en el carcinoma de células escamosas (
P
= 0,005), y la alta expresión de FoxQ1 correlacionada con la pérdida de expresión de E-cad (
P = 0,012
), y positividad anómala de VIM (
P = 0,024
) y S100A4 (
P
= 0,004). Un análisis adicional de supervivencia mostró que la alta expresión de FoxQ1 (
P = 0,047
) y E-cad (
P = 0,021
) fueron factores pronósticos independientes.
Conclusión
FoxQ1 tal vez juega un papel específico en la EMT de CPNM, y podría ser utilizado como un factor pronóstico de NSCLC
Visto:. J Feng, Zhang X, Zhu H, Wang X, Ni S, Huang J (2012) FoxQ1 sobreexpresión influye mal pronóstico en células no pequeñas de cáncer de pulmón, asociados con el fenómeno de la EMT. PLoS ONE 7 (6): e39937. doi: 10.1371 /journal.pone.0039937
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Marzo, 2012; Aceptado: 29-may de 2012; Publicado: 28 Junio 2012
Copyright: © 2012 Feng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por las subvenciones del Desarrollo Social y Proyectos de investigación Aplicada (S2010041) del gobierno de Nantong, china; Cooperación Internacional e Intercambio (2011) del Departamento de Salud de Jiangsu; y el Fondo de Doctorado (2010) del Hospital Afiliado de la Universidad de Nantong, Nantong, China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el tipo más frecuente de cáncer, y la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con una mayor mortalidad que los de mama, próstata y cáncer colorrectal combinado [1], [2]. Durante las últimas tres décadas en China, la mortalidad por cáncer de pulmón se ha incrementado en un 465%, con estas malignidades convirtiéndose en la segunda causa de muerte después del cáncer de hígado [3]. A pesar del gran avance en el tratamiento de los cánceres en los últimos años, el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo pobre, con tasas de supervivencia a 5 años inferior al 15% [4], [5]. La mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón se encuentran en un periodo avanzado de la enfermedad en el momento del diagnóstico, y aproximadamente el 85% de estos cánceres son el cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) [1], [6].
Muchos estudios recientes han señalado que la transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un evento crítico en la invasión tumoral y la metástasis en los cánceres epiteliales derivadas de [7] - [10], incluyendo NSCLC [11] - [14]. El conocimiento de los fenómenos de la EMT se remonta ya en 1908. Durante la década de 1990, la EMT ganó más reconocimiento como un mecanismo posiblemente importante en las enfermedades crónicas, como la fibrosis de órganos y cáncer [15]. EMT se caracteriza por la baja regulación de marcadores de diferenciación del epitelio E-cadherina (E-cad) [16] - [20] y mucina 1 (MUC1) [21], y la sobre regulación de marcadores mesenquimales como la vimentina (VIM) [17] - [20], [22], [23], fibronectina [17], [20], [24] y la proteína de unión a calcio S100 A4 (S100A4) [25] - [28]. Estudios previos han descrito un papel clave para la caja forkhead Q1 (FoxQ1) en la regulación de la EMT y la agresividad en el cáncer humano [29] - [32].
foxq1, anteriormente conocido como HNF-3 /forkhead homólogo 1 (HFH1 ), pertenece a un miembro de la familia de factores de transcripción forkhead [32] - [34], que se expresan en diferentes tejidos y juegan un papel importante en el desarrollo, el metabolismo, el cáncer y el envejecimiento [30], [34]. Como uno de los primeros genes forkhead estudiados, foxq1 se ha implicado a reprimir genes específicos de los músculos lisos, como Sm22α y telokin en células A10 [35]. Foxq1 ha demostrado ser un mediador aguas abajo de Hoxa1 en las células madre embrionarias [36]. Foxq1 humana, localizado en el cromosoma 6p23-25, se ha aislado y caracterizado [33] y desempeña un papel esencial en la etiología del cáncer humano [31], [32].
Un paso q RT-PCR se realizó para confirmar la expresión de FoxQ1 mRNA en tejidos humanos. Los resultados fueron normalizados a nivel de ARNm de GAPDH. El nivel FoxQ1 mRNA en tejidos de NSCLC fueron más altos que en los tejidos que peritumoral con significación estadística usando una prueba T para muestras relacionadas. **
P & lt; 0,05
. Las barras indican el error estándar (S. E.) guía empresas
(A) 1 y 2:. Patrón de tejido de carcinoma de células escamosas de pulmón con H & amp; E tinción; 3 y 4: alta expresión de FoxQ1; 5 y 6: pérdida de expresión de E-cad; 7 y 8: una fuerte tinción VIM-positivo. (B) 1 y 2: patrón de tejido de adenocarcinoma de pulmón con H & amp; E tinción; 3 y 4: tinción positiva para FoxQ1; 5 y 6: tinción negativa para MUC1; 7 y 8: expresión de S100A4 hasta reguladas. (C) 1 y 2: tejido de adenocarcinoma de pulmón con H & amp; E tinción; 3 y 4: IHC negativo para FoxQ1; 5 y 6: fuerte reacción inmunológica de E-cad; 7 y 8: negativo para S100A4. (D) 1 y 2: pulmón tejido de carcinoma de células escamosas con H & amp; E tinción; 3 y 4: baja expresión de FoxQ1; 5 y 6: alta expresión de MUC1; 7 y 8: expresión débil de VIM. Aumento original era × 40 para 1, 3, 5 y 7; y × 400 para 2, 4, 6 y 8.
Curvas (A) calculados para la expresión FoxQ1. Alta expresión en el grupo FoxQ1 (línea roja) indica significativamente menor supervivencia que baja y ninguna expresión en el grupo FoxQ1 (línea azul). (B) Curvas calculadas para la expresión de E-cad. Esperanzas de vida de los pacientes con tinción positiva E-cad son mucho más cortos (línea roja) que en los pacientes con tinción de E-cad negativo (línea azul).
Los estudios recientes han descrito que foxq1 se ha encontrado para ser sobreexpresa en el cáncer colorrectal [29], [31] y el cáncer de mama [31], [32], en la que los pacientes tienen pobres resultados clínicos [31], [32]. Aunque la sobreexpresión de foxq1 en líneas celulares de cáncer confirmó que el gen podría desempeñar un papel en el desarrollo de cáncer de pulmón [29], [33], la correlación entre la expresión foxq1 y EMT factores para determinar su importancia clínica en NSCLC no ha sido previamente informó.
Se analizó la expresión del gen FoxQ1 mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) en muestras pequeñas, frescas congeladas de tejido de NSCLC. La expresión de la proteína FoxQ1 y cuatro proteínas indicadoras EMT común (E-cad, MUC1, VIM y S100A4) fue evaluada por inmunohistoquímica utilizando secciones misma microarrays de tejidos (TMA). Además, se investigó la relación entre la expresión de los cinco genes que codifican estas proteínas y otros factores clinicopatológicos en NSCLC. Por último, se evaluó el valor potencial de estos marcadores como indicadores de pronóstico de supervivencia en pacientes con NSCLC.
Métodos
Pacientes y TMA de las muestras de NSCLC
Después de una revisión patológica completa de acuerdo con la 7ª edición del TNM en el cáncer de pulmón [37], un grupo de tejidos de NSCLC en parafina fijados con formol con tejidos de tumores adyacentes sometidos a tratamiento quirúrgico correspondiente se obtuvieron del hospital Afiliado de la Universidad de Nantong entre enero de 2005 y diciembre de 2006. los datos clínicos (incluyendo el género, la edad, el tipo histológico, grado, estadio, tamaño tumoral, la diferenciación, el estado de los ganglios linfáticos metástasis) se obtuvieron de los registros médicos de cada paciente.
entre el material de archivo, 103 bloques de tejido de pacientes con CPNM con registros de seguimiento de supervivencia de 5 años estaban disponibles y se utilizan para la construcción de la AMT. Se seleccionó un área representativa de cada tumor y 2,0 mm de núcleos de tejido se utilizaron para construir un TMA por Shanghai aventajan Biotech (República Popular China). La calidad de TMA secciones se confirmó mediante la tinción de hematoxilina-eosina (H & amp; E). La edad media del grupo fue de 62,5 años (rango: 35-81 años). La supervivencia se calculó a partir de la fecha de la cirugía hasta la fecha de la muerte o el último seguimiento. Además, un panel de 20 tejidos de NSCLC recién congelados y coincidente peritumour tejidos del mismo hospital mencionado anteriormente se utilizaron en este estudio. Antes de la terapia quirúrgica, ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia neoadyuvante, radioterapia o inmunoterapia. Ética aprobación para llevar a cabo este estudio se obtuvo del Comité de Ética de Investigación Humanos local.
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
ARN total fue extraído y purificado a partir de 40 muestras de tejido de NSCLC frescas congeladas , incluyendo 20 tejidos de NSCLC y 20 tejidos no cancerosos correspondientes. La extracción de RNA total, control de calidad y de un solo paso QRT-PCR se realizaron como se informó anteriormente [38]. cebadores de oligonucleótidos-foxq1 específico (adelante, 5'-ACG CTG GCG GAG ATC AAC GAG-3 '; inverso, 5'-AGG TTG TGG CGC GAG ACG TT-3') fueron diseñados para producir un producto de PCR de 92 pb. Los datos se normalizaron usando deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) como un gen de referencia (cebador directo, 5'-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 '; cebador inverso, 5' TGC CAT GGG TGG AAT CAT ATT GGA-3 ').
La inmunohistoquímica (IHC)
IHC se realizó tal como se describe anteriormente [39]. Deparaffinized secciones (4-m de espesor) a partir de bloques de matriz se tiñeron por separado en un Sistema Universal de tinción Autostainer (LabVision, EE.UU.) utilizando los siguientes anticuerpos primarios: ratón anti-foxq1 (1:300 dilución; Abcam, UK), ratón anti-E -CAD (1:120; Invitrogen, EE.UU.), monoclonal de ratón anti-MUC1 (1:200; Novocastra, RU), monoclonal de ratón anti-VIM (1: 100; Invitrogen, EE.UU.), y el conejo policlonal anti-S100A4 (1 :100; Newmarker, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: Envision de cabra HRP anti-ratón (DAKO, EE.UU.), Envision de cabra anti-conejo HRP (DAKO, EE.UU.). La evaluación de la inmunotinción de estas secciones se hizo ciego a dos patólogos entrenados que no tenían conocimiento de los antecedentes clínicos de las muestras
Los porcentajes de células FoxQ1-positivas se anotó y se colocaron en cuatro categorías de acuerdo a las manchas:. 0 de 0%; 1 de 1 a 33%; 2 de 34 a 66%; y 3 para el 67-100%. Las intensidades de tinción foxq1 también se calificaron como: 0, se utilizó 1, 2 o 3. La suma de los porcentajes y las puntuaciones de intensidad como la puntuación de tinción FoxQ1 final, que hemos descrito anteriormente [39] y se ha definido de la siguiente manera: 0-2, baja expresión; y 3-6, alta expresión. Sin embargo, para la positividad de los fabricantes seleccionados EMT (E-cad, MUC1, VIM y S100A4), no detectables o & lt; 10% de tinción positiva de las células tumorales se consideró como negativo, mientras que se consideró ≥10% de tinción positiva de las células tumorales positivo [40]. Todas las muestras se evaluaron a 4 × 10 × magnificación.
Métodos estadísticos
El nivel de ARNm en tejidos FoxQ1 NSCLC frescas congeladas y los correspondientes tejidos no cancerosos se normalizó a GAPDH y analizados mediante el Wilcoxon prueba de los rangos con signos de pruebas no paramétricas. Las asociaciones entre las variables clínico-patológicas y la expresión de proteínas FoxQ1 fueron examinados por χ
2 pruebas. El chi-cuadrado se utilizó para confirmar la correlación entre la expresión de las proteínas indicadoras foxq1 y EMT. Las curvas de supervivencia se calcularon utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Los factores que han demostrado ser de importancia pronóstica en los modelos univariantes fueron evaluados utilizando un modelo de regresión de Cox. Un
P
-valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Los datos fueron analizados utilizando el software STATA 9.0 (Stata Corporation).
Resultados
FoxQ1 de expresión de mRNA en el CPNM y peritumoral tejidos
ARN total fue extraído de los tejidos de NSCLC frescas congeladas y sometido a un solo paso QRT-PCR para investigar la expresión de ARNm FoxQ1. También se investigó muestras de tejidos tumorales emparejados adyacentes. Cuando se normaliza a GAPDH, los niveles de expresión de ARNm FoxQ1 en NSCLC media y la correspondiente tejido no canceroso fueron 0,15 ± 0,02 y 0,04 ± 0,02 (
P = 0,015
), respectivamente. FoxQ1 expresión era 3,75 veces mayor en promedio en las muestras de cáncer que en los tejidos no malignos (fig. 1).
resultados de IHC para las proteínas indicadoras foxq1 y EMT en los tejidos de NSCLC
inmunohistoquímico típico patrones de tinción observados para los cinco genes que codifican el FoxQ1 y las otras cuatro proteínas indicador de EMT en NSCLC se muestran en la Figura 2. la tinción positiva para FoxQ1 fue localizada principalmente a las células tumorales y los neumocitos en el citoplasma y plasmalema a diferentes niveles. Mientras que la tinción nuclear positiva podría ser visto, FoxQ1 immunolabelling no se observó en el estroma de estos tejidos. La expresión de alto FoxQ1 se detectó en 82/103 (50,49%) de los tejidos de NSCLC y estaba en 38 (20,39%) de los tejidos tumorales emparejados adyacentes. Los datos mostraron significación estadística mediante χ
2 análisis de la prueba (χ
2 = 38,6450,
P Hotel & lt; 0,001). Y era consistente con los niveles de mRNA en FoxQ1 NSCLC
Positivo expresión de e-cad y MUC1 se localizó en la membrana celular, y una combinación del plasmalema y el citoplasma en las células tumorales de NSCLC, respectivamente. Se observó tinción inmunohistoquímica positiva para VIM y S100A4 en células de cáncer en el citoplasma, y una combinación del núcleo y el citoplasma. Una excepción a esto fue los fibroblastos del estroma positivos.
Relación entre la expresión de las proteínas foxq1 y parámetros clínico en CPNM
Las asociaciones entre la expresión FoxQ1 y las características clinicopatológicas de NSCLC se muestran en la Tabla 1. FoxQ1 expresión de la proteína en el adenocarcinoma fue mayor que en el carcinoma de células escamosas, con significación estadística (χ
2 = 10,7089,
P
= 0,005) por χ
2 análisis de prueba. Por el contrario, no hay asociaciones significativas se observaron con la edad del paciente, el sexo, el diámetro del tumor, el grado histológico del tumor, los ganglios linfáticos metástasis, y la etapa de agrupamiento con TNM.
Correlación entre la expresión de FoxQ1 y las proteínas indicadoras EMT
las relaciones entre la expresión de FoxQ1 y las cuatro proteínas indicadoras EMT se calcularon y se han esbozado en la Tabla 2. se observó que las frecuencias epiteliales pérdida de proteínas en los tejidos de NSCLC 103 fueron 66,02% para e-cad y 18.45 % para MUC1. Anormales mesenquimales frecuencias de expresión de proteínas en las mismas muestras fueron 23,30% para VIM y 68,93% para S100A4. El resultado también mostró que la alta expresión de FoxQ1 correlaciona con una pérdida de expresión de E-cad (χ
2 = 6,308,
P = 0,012
), y la positividad anómala de VIM (χ
2 = 1.396,
P = 0,024
) y S100A4 (χ
2 = 8,374,
P
= 0,004) en las muestras de NSCLC clínicas.
El análisis de supervivencia
Varios factores predictivos conocidos de resultado deficiente en NSCLC se evaluaron para validar la cohorte de pacientes representados por este TMA (Tabla 3). Alta expresión de la proteína FoxQ1 (
P = 0,023
) y la baja expresión de la proteína E-cad (
P
= 0,002) mostraron una asociación estadísticamente significativa con la supervivencia de cinco años por el análisis univariado de regresión de Cox. Además de estos dos marcadores genéticos, otros factores pronósticos clínicos de NSCLC, como la diferenciación de la etapa del tumor y TNM se incluyeron en un modelo de regresión de Cox multivariado. Nuestros datos demuestran que la expresión de alto FoxQ1 (
P = 0,047
) y una pérdida de expresión de E-cad (
P = 0,021
) fueron confirmados para ser pronosticadores independientes de la baja supervivencia de NSCLC.
la supervivencia se trazó utilizando el método de Kaplan-Meier. Los resultados identificado que los pacientes con una expresión FoxQ1 alta o la pérdida de expresión de E-cad tenían un tiempo de supervivencia significativamente más corto, en comparación con aquellos con baja expresión o conservados, respectivamente (Fig. 3).
Discusión
en este estudio, el uso de un TMA, destacamos el valor pronóstico de la expresión FoxQ1 en el CPNM. Alta expresión de FoxQ1 fue detectable en las TMA de las muestras tumorales y se correlacionó significativamente con la supervivencia global disminuido. Además, los resultados demostraron que la expresión FoxQ1 se asoció significativamente con EMT en un subgrupo de pacientes. A través del análisis multivariado, la alta expresión de FoxQ1 y E-cad expresión reducida se mostraron como biomarcadores de pronóstico independiente para la supervivencia global pobres. Por lo que sabemos, este es el primer reporte de la importancia clínico-patológica de expresión FoxQ1 relacionada con la EMT en muestras de tejido de NSCLC clínicas.
Recientemente, la evidencia acumulada sugiere que FoxQ1 humano juega un papel clave en la regulación de la EMT de cáncer de mama [31], [32], y la agresividad del cáncer de colon [29], [32]. Hay pruebas considerables de que la presencia del fenómeno de EMT indica la supervivencia a corto en el cáncer de pulmón [11] - [14]. Para identificar la relación entre FoxQ1 y EMT en el carcinoma de pulmón, cuatro biomarcadores indicador frecuentes fueron investigados en el cáncer de pulmón TMA utilizando IHC. Curiosamente, nuestros resultados mostraron que los altos niveles de expresión de la proteína FoxQ1 correlacionada con una disminución de expresión de la proteína E-cad, y el aumento de expresión de la proteína S100A4 y VIM.
Algunos autores han demostrado que la E-cad se vincula con la metástasis de cáncer de pulmón [12]. VIM no se cree que está asociado con la supervivencia en cáncer de pulmón [14], aunque S100A4 se ha correlacionado con el pronóstico de cáncer de pulmón carcinoma de células escamosas [41] en estudios de investigación clínica. También se determinó el efecto pronóstico de la expresión de marcadores de EMT mediante análisis univariante y multivariante. Nuestros resultados revelaron que el único marcador asociado con el resultado era E-cad.
Estudios recientes han confirmado que FoxQ1 para ser un indicador pronóstico valioso para pobres supervivencia en el cáncer de mama [31], [32]. Sin embargo, la alta expresión del gen FoxQ1 también se observó en el cáncer de pulmón, cáncer gástrico, y líneas celulares de cáncer de colon [29]. Por lo tanto, nuestros resultados actuales corroboran hallazgos previos sobre la expresión FoxQ1 en el CPNM, especialmente en el adenocarcinoma de pulmón.
Aunque los mecanismos exactos de efectos tumorigénicos de foxq1 en NSCLC no se han descrito plenamente en nuestra investigación actual, la base molecular de la asociación entre FoxQ1 y EMT son bien comprendidos en el tumor. Los resultados obtenidos a partir de nuestros datos están de acuerdo con los presentados en la literatura emergente, que había declarado que la represión de FoxQ1 condujo a un aumento en la expresión de E-cad en el carcinoma humano [31], [32]. En conjunto, los resultados de nuestro estudio presente corroboraron que FoxQ1 podría utilizarse potencialmente como un marcador EMT en NSCLC.
En conclusión, hemos demostrado que FoxQ1 fue altamente expresado en NSCLC y podría ser utilizado como un pronosticador directa de un resultado negativo. Además, nuestros resultados apoyan el hecho de que FoxQ1 tiene un papel funcional con respecto a los genes relacionados con la EMT en NSCLC.