Extracto
La radiación ionizante -Mejora de la invasividad tumoral (IR) está emergiendo como un contribuyente a la limitada beneficio de la radioterapia; sin embargo, su mecanismo todavía no está claro. Anteriormente puso de manifiesto que las células A549 subclonado adenocarcinoma de pulmón (células P), que sobrevivieron 10 (células IR) Gy IR, adquieren gran capacidad invasora
in vitro
. Aquí, hemos tratado de identificar el mecanismo por el cual las células IR aumentan su capacidad invasiva mediante el examen de la expresión del gen alterado y las vías de señalización en las células de IR en comparación con los de las células P. Para simular el microambiente
in vivo
, células fueron incorporados en un (3D) de tipo tridimensional de colágeno I en gel, en el que se alargaron las células IR, mientras que las células P eran esféricas. El patrón de expresión de la integrina fue examinada, y los niveles de expresión de la integrina α2 y subunidades beta 1 fueron significativamente elevados en las células IR. Desmontables expresión de α2 o bloqueo funcional de la integrina α2β1 dio lugar a una morfología redonda de las células IR, y abrogó su invasión de la matriz de colágeno, lo que sugiere el papel esencial de la molécula en la propagación celular y la invasión de colágeno 3D. Epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) también presentó una mayor expresión y la activación en las células IR. El tratamiento con inhibidor de tirosina quinasa de EGFR, PD168393, disminución de la relación de células alargadas y invasividad de las células. Moléculas de señalización, incluyendo la señal extracelular regulada quinasa-1/2 (Erk1 /2) y Akt, exhibieron mayor activación en las células IR. La inhibición de la activación de Akt por tratamiento con inhibidor de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) LY294002 disminuye la invasión de células IR, mientras que la inhibición de la activación de Erk1 /2 por MAP quinasa quinasa (MEK) U0126 inhibidor no lo hizo. Nuestros resultados demuestran que la integrina α2β1 y EGFR cooperativamente promover una mayor invasividad de las células de cáncer de pulmón sobrevivido-IR, mediada en parte por la vía de señalización PI3K /Akt, y podría servir como objetivos alternativos en combinación con radioterapia
Cita.: Li X, Ishihara S, Yasuda H, Nishioka T, Mizutani T, Ishikawa M, et al. (2013) Las células del cáncer de pulmón que sobreviven a la radiación ionizante muestran un aumento de la integrina invasividad α2β1- y EGFR-dependiente. PLoS ONE 8 (8): e70905. doi: 10.1371 /journal.pone.0070905
Editor: Ferenc Gallyas, Universidad de la Escuela de Medicina de Pecs, Hungría
Recibido: Abril 26, 2013; Aceptado: June 26, 2013; Publicado: 8 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas-en-Ayudas a la JSP Fellows (11J06280) a SI, Investigación Científica (a) (21249065) a HS y H. H., Investigación Científica (B) (24390285) para M.Y., T.N. y H. H., Investigación científica en áreas innovadoras (24106502) a T. M., y la investigación exploratoria (23651099) a K. K. desde el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón. Esta investigación también fue apoyada en parte por gastos especiales para "Reverse Investigación traslacional de tecnología médica avanzada a avanzado Ciencias de la Vida" a M. I., H. S. H. H. y financiado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que representan la mayoría de los casos. Las opciones de tratamiento para CPNM son la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia y la terapia de combinación secuencial o concurrente [1]. La radioterapia es el uso médico de la radiación (IR) ionizante, y se considera un tratamiento local no invasiva, que afecta principalmente a las células y los tejidos que se encuentran en el interior del haz de infrarrojos. Sin lugar a dudas, se ha demostrado como una herramienta fundamental disponible en la batalla contra el cáncer.
Sin embargo, el aumento de los datos experimentales sugieren que, en circunstancias aún no entiende, la radioterapia del tumor primario podría favorecer la metástasis, lo que puede explicar por qué mejor control local de la radiación no se traduce en mayor tiempo de supervivencia, libre de metástasis a distancia [2]. Por lo tanto, además de los esfuerzos considerables en la mejora de la radiosensibilidad [3] - [6], se requiere la identificación de las moléculas y los mecanismos de progresión metastásica del cáncer inducido por IR para la mejora de la eficacia de la radioterapia y la tasa de supervivencia de los pacientes. Muchos estudios han demostrado que la irradiación puede promover la invasión y /o metástasis upregulating la expresión de genes y la activación de las vías que están involucrados en el proceso metastásico de señalización. Entre ellos, los receptores de la superficie celular, tales como integrinas y receptores de factores de crecimiento, a menudo están alterados por IR y son capaces de activar muchos diferentes vías de señalización con múltiples respuestas celulares. Por ejemplo, los niveles de expresión de integrina αvβ3 en células de glioma [7] y α5β1 en el cáncer de páncreas [8] son upregulated por IR, lo que facilita tanto la migración celular y la invasión. Integrina α3β1 se sobreexpresa después de IR, la promoción de la migración de células a través de meningioma quinasa de adhesión focal (FAK) y la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) [9]. Nuestro grupo [10] y otros [11] mostró un papel fundamental de β1 integrina en la invasividad inducida por IR en el cáncer de pulmón y el meduloblastoma, respectivamente. IR también puede mejorar la invasión a través de la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el receptor de insulina como factor de crecimiento 1 (IGFR1) [12], [13], y la secreción del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) [14].
En esto, hemos tratado de comprender mejor el mecanismo que subyace al aumento de la capacidad de invasión de las células del cáncer de pulmón que sobrevivieron IR. Hemos demostrado que la integrina α2β1 es upregulated selectivamente en células de IR, y es necesario para el fenotipo agresivo e invasión de células de IR en el (3D) de gel de colágeno tridimensional. EGFR también se sobreexpresa y más activo en células de IR, lo que contribuye a IR invasividad también. Investigación de varias moléculas de señalización importantes mostró la activación de la señal extracelular regulada quinasa-1/2 (Erk1 /2) y Akt en células de IR, pero sólo phosphoinositide 3-quinasa (PI3K) /Akt mediada la transducción de señalización invasiva de la integrina α2β1 y EGFR . La comprensión de cómo IR promueve la invasión de las células cancerosas puede dar una idea de la metástasis y potenciales dianas terapéuticas para prevenir la recurrencia de tumores secundarios después de la radioterapia.
Materiales y Métodos
Cell Culture
adenocarcinoma de pulmón A549 línea celular humana se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). las células P y las células IR se generaron tal como se publicó anteriormente [10]. Ambas líneas celulares se mantuvieron en Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Equitech-Bio, Kerrville, TX) y 1% mezcla de antibióticos de penicilina /estreptomicina (Sigma ). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2.
Reactivos
PD168393 EGFR inhibidor de la cinasa (Calbiochem, Merck KGaA, Damstadt), inhibidor de PI3K LY294002 ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y MAP quinasa quinasa (MEK) inhibidor U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) se utilizaron a la concentración indicada en DMSO. Un anticuerpo de bloqueo de función contra α2β1 integrina (BHA2.1) se adquirió de Millipore (Billerica, MA). Western Blot anticuerpos específicos para las subunidades a2 y beta 1 integrina se compraron de BD Bioscience (San Jose, CA). El anticuerpo p-EGFR (Tyr1068) se adquirió de Signalway de anticuerpos (College Park, Maryland). Los anticuerpos específicos para EGFR, Akt, p-Akt (Ser473), p44 /42 Raf-activada por mitógenos proteína MAPK quinasa (Erk1 /2), p-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204), transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3), p-Stat3 (Ser727), MAPK p38, MAPK y p-p38 (Thr180 /Tyr182) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). anticuerpo GAPDH fue adquirido de Ambion (Austin, TX). MFP488 faloidina fue adquirido de Mo Bi Tec (Molecular Biologische Technologie, Göttingen).
Cultura colágeno 3D
Una solución de colágeno de 1,6 mg /ml se preparó mezclando 3 mg /ml de colágeno de tipo porcino IP solución (Nitta Gelatin, Osaka), 2.6 × medio DMEM (Sigma), y tampón (Nitta Gelatin) en una proporción de 7:05: 1 en hielo. Un plato 30-mm se revistió primero con 150 l de solución de colágeno y se dejó polimerizar a 37 ° C durante 30 min, después se aclara con medio. A continuación, 10 l de 2 × 10
5 células en suspensión se mezcló a fondo con 150 l de solución de colágeno y se sembraron en la capa inferior de gel de colágeno. Después de la polimerización de colágeno a 37 ° C durante 30 min, la mezcla de células de colágeno fue cubierta con 2 ml de FBS que contienen medio y se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 para su posterior análisis. Para el análisis de la morfología y la observación de lapso de tiempo, un plato de cristal se sustituyó por el plato de plástico. Para facilitar la observación de movimiento de las células en el mismo plano, se utilizó la cultura gel de arena. Las células se sembraron primero y permite que se adhieran sobre el gel inferior y, después de 16 h, el gel superior se sobrepuso y se polimerizó a 37 ° C durante 30 min. Las células se mantuvieron en 2 ml de medio que contenía FBS a 37 ° C y 5% de CO
2.
se analizó de análisis de la morfología
La morfología celular después de estar en el gel de colágeno 3D por 24 h. Cuando se indica, se añadieron inhibidores o anticuerpos para el medio. imágenes de contraste de fase se tomaron al azar de 4 campos por muestra, y el porcentaje de células alargadas se determinó a partir de al menos 3 experimentos independientes incluyendo más de 100 células individuales. Una célula se consideró alargada cuando su dimensión más larga era dos veces la dimensión más corta, y cuando mostró al menos un saliente, como se informó anteriormente [15].
Microscopía por lapsos de tiempo y cuantificación de la velocidad de invasión celular
2 × 10
4 células se cultivaron mediante el ensayo de gel de arena 3D durante 24 h, y se observaron en una cámara a 37 ° C mediante un microscopio de contraste de fase (TE300, Nikon Instech, Tokio). Imágenes de células elegidas al azar fueron tomadas cada 5 min durante 6 h. Para los experimentos de inhibición, se añadieron inhibidores o anticuerpos en el medio de cultivo después de gel de superposición cuando esté indicado. Para cuantificar la velocidad de las células, rastreamos los movimientos de las células individuales por el software Image-Pro (Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD). La velocidad de la invasión de células se calculó como la distancia (m) por minuto a partir de al menos 3 experimentos independientes, incluyendo 50 células individuales.
3D esferoide Invasion Ensayo
esferoides se produjeron utilizando el sistema de gravedad Plus (InSphero , Zurich, Suiza) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 40 l de suspensión de células que contiene 10
3 células se sembraron en cada pocillo de la placa durante 4 d, y esferoides se transfirieron a gel de colágeno y superpuestos poco después. Después de estar en gelatina a 37 ° C durante 30 min, se añadió medio con FBS, y las células se cultivaron durante 24 h. Cuando esté indicado, se añadieron inhibidores o anticuerpos durante el cultivo. Luego, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído en PBS, permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en PBS, y se tiñeron con faloidina MFP488. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron mediante la microscopía confocal de barrido láser (sistema de imagen confocal C1;. Nikon Instech, Tokio). El perímetro y el área de esferoides se determinaron mediante el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland) como se informó anteriormente [16]. En pocas palabras, cambiar la imagen con el tipo de 8 bits, y utilizar la función de umbral para convertir áreas de interés para las zonas negras saturadas de manera uniforme a tener un (negro & amp; blanco) imagen binaria. A continuación, excluir todas las partículas de menos de 3 píxeles de tamaño y eliminar todos los artefactos mediante la comparación de la imagen binaria de las imágenes de fluorescencia. Utilice el cuadro de diálogo para especificar las mediciones conjunto de área y perímetro. Utilice el cuadro de diálogo analizar partículas para medir todas las partículas y generar un "informe de partículas" para cada imagen en la que se documenta el área y el perímetro de las partículas y el área de la suma de las partículas individuales. La relación de aspecto se calculó a partir del perímetro
2 /[4π (área)]. Una relación de aspecto más alto significa una estructura esferoidal infiltrarse más irregular. Los resultados se determinan a partir de 3 experimentos independientes realizados por triplicado.
Western Blot
Las células en cultivo de colágeno 3D se fijaron en 500 l de ácido tricloroacético enfriado con hielo (TCA) durante 3 min, y se digirieron con 200 l 0,1% de colagenasa a 37 ° C durante 1 h. Los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación a 14.000 rpm durante 2 min, se resuspendieron en 100 l de tampón Laemmli, y se calentó a 95 ° C durante 5 min, antes de lisados se sometieron a sonicación durante 30 segundos y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Para realizar la transferencia Western, los lisados celulares se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 12%, y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). La membrana se bloqueó con 5% descremada reconstituida leche en polvo en una solución de TBST (10 mM Tris-HCl que contiene NaCl 150 mM y 0,05% de Tween 20, pH 7,5). Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en TBST o puede recibir la señal inmunorreacción reforzador Solución 1 (Toyobo, Osaka) a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con TBST, rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa diluido en TBST o puede recibir la señal inmunorreacción reforzador Solución 2 se aplicaron y las transferencias fueron desarrolladas por el Sistema de Detección de aumento de quimioluminiscencia (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los niveles de inmunocomplejos GAPDH se utilizaron como estándar interno para la igualdad de la carga. La cuantificación de la intensidad de la señal se realizó utilizando el software ImageJ y normalizado para el valor de control.
RT-PCR
Las células se lisaron con Tripure (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) para la extracción de ARN, y la reacción de transcripción inversa se realizó por ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). Para las células cultivadas en gel de colágeno 3D, la extracción se realizó dos veces. PCR se realizó con Taq polimerasa en ThermoPol Buffer (NEB, Ipswich, MA). Los cebadores fueron los siguientes: α1:5'-GCCTCCTTTCTTGCTGTGTC-3 integrina '(adelante), 5'-TGGGTGCTTATTGGTTCTCC-3' (marcha atrás); integrina α2:5'-GAGCACCAGCAACAAAGTGA-3 '(adelante), 5'-CGGGTGTGTGTTCTGACATC-3' (marcha atrás); integrina α4:5'-GAGATTTTCCCCTTGCATGA-3 '(adelante), 5'-GAGTGCAATGCAGACCTTGA-3' (marcha atrás); integrina α5:5'-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 '(adelante), 5'-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3' (marcha atrás); integrina β1:5'-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3 '(adelante), 5'-CCTCGTTGTTCCCATTCACT-3' (marcha atrás); y GAPDH: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '(adelante), 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (marcha atrás)
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)
QRT-PCR. fue realizado por PikoReal (Thermo Scientific, Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN total (1 g) fue transcrito inverso usando los cebadores específicos como sigue: α2:5'-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 integrina '(adelante), 5'-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3' (marcha atrás); integrina β1:5'-GACGCCGCGCGGAAAAGATG-3 '(adelante), 5'-GCACCACCCACAATTTGGCCC-3' (marcha atrás); EGFR: 5'-CGCAGATAGTCGCCCAAAG-3 '(adelante), 5'-CCATCAGGGCACGGTAGAA-3' (marcha atrás); y β-actina: 5'-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3 '(adelante), 5'-ACATGCCGGAGCCGTTGTCG-3' (marcha atrás), que fue utilizado como un gen de referencia para la normalización
pequeños ARN de interferencia (siRNA) La transfección.
las células fueron transfectadas con siRNA contra la secuencia diana de la integrina α2 5'-AACCAAAGAAGAAATGATTGTAG-3 '(secuencia sentido, siα2-1) o 5'-AACAAGAATGCTCAGATAATTCT-3' (secuencia sentido, siα2-2) usando Lipofectamine RNAiMAX reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un siRNA contra la secuencia diana Azami verde 5'-AGCAGATATTCAGGACTATTTCA-3 '(secuencia sentido) se utilizó como control negativo.
Ensayo de proliferación de
2 × 10
4 células fueron cultivadas en gel de colágeno 3D en placas de 24 pocillos, y se trata con inhibidores o anticuerpos cuando se indique durante el cultivo. Medio con o sin inhibidores o anticuerpos se cambió cada dos días. Las células en cultivo de colágeno 3D se fijaron en 200 l de TCA enfriado con hielo durante 3 min, y se digirieron con 200 l 0,1% de colagenasa a 37 ° C durante 1 h, pipeteadas a fondo y continúan para ser digerida durante 1 h. Los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación, y se resuspendieron con PBS. La densidad celular se determinó con un hemocitómetro. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado en 3 experimentos independientes.
Análisis estadístico
Cada condición experimental se repitió al menos 3 veces. Los datos se expresan como media ± S.D. El análisis estadístico se realizó utilizando de Student
t-test
, y un valor de p ≤0.05 fue considerado significativo.
Resultados
IR células presentes mayor capacidad invasiva
Para examinar si el IR puede promover la invasión de las células cancerosas, el fenotipo celular se comparó primera entre P y células IR. A diferencia de morfología similar sobre el sustrato rígido 2D, morfologías celulares difieren significativamente cuando incrustado en un gel de colágeno 3D, donde las células P son esféricas; células IR son más alargada con salientes [10].
La cuantificación de la velocidad de invasión de las células individuales mostró que las células de IR se movían más rápido por aproximadamente dos veces que las células P en gel de colágeno (Fig. 1A). Por otra parte, las trayectorias de las células IR eran más largos y más dirigidas a los de las células P, con células a menudo dando la vuelta (Fig. 1B). Aumento de la invasividad de las células IR se confirmó adicionalmente mediante el ensayo de invasión esferoide 3D para imitar la característica de los tumores
in vivo
(Fig. 1C). Los resultados muestran que, después de incrustado en gel de colágeno durante 24 h, tanto P como esferoides IR aumentado en volumen en aproximadamente 20 a 40% (Fig. 1D), mientras que esferoides IR extienden salientes masivas, con algunas células ya que tiene escapado del cuerpo , y se presenta como una relación de aspecto mayor que la de las células P (Fig. 1E), lo que sugiere una mayor invasividad de las células IR en microtejidos.
(a) la cuantificación de la velocidad de invasión en P y las células IR presentan como media Los valores ± SD, *** p & lt; 0,001. (B) Los diagramas que representan las trayectorias de invasión de 4 células representativas de P y células IR en 3D colágeno en gel de arena cubiertos durante 6 h. orígenes celulares se establecen como (0,0), y la unidad de escala es micras. (C) Confocal imágenes de MFP488 representante faloidina-manchado P y esferoides IR en gel de colágeno a las 0 h ó 24 h. Barra de escala, 200 micras. (D) La cuantificación de la zona de esferoides por software ImageJ. (E) La relación de aspecto de esferoides se calculó a partir perímetro
2 /[4π (área)]. Los resultados se presentan como valores medios ± SD (*** p & lt; 0,001) de 3 experimentos independientes por triplicado
integrina α2β1 se sobreexpresa en células de IR, y es necesario para la elongación y la invasividad de IR. Las células en 3D de colágeno
Las integrinas son receptores de la superficie adhesiva de células formadas por subunidades alfa y beta, que se unen a proteínas de la matriz extracelular (ECM). la adhesión mediada por la integrina a la ECM activa vías de señalización intracelular para modular la morfología celular, la migración, la invasión, la proliferación y la supervivencia [17]. El cambio morfológico espectacular de las células IR comparación con las células P cuando está rodeado por una matriz de colágeno nos animó a investigar el patrón de expresión de la integrina. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que desmontables de la integrina β1 de siRNA o el tratamiento con su AIIB2 anticuerpo inhibidor induce la morfología esférica de células IR en gel de colágeno 3D, similar a las células P [10]. Teniendo en cuenta que el colágeno tipo I y fibronectina (secuestrado de las FBS en el medio y secretada por las células) son los principales componentes de ECM en nuestro modelo de gel de colágeno, el patrón de expresión de las integrinas, incluyendo α1β1, α2β1, α4β1 y α5β1, se investigó por RT-PCR. Entre ellos, α1β1 y α2β1 se presentan como los principales receptores de colágeno, mientras que α4β1 y α5β1 se presentan como los principales receptores de fibronectina [18]. Los resultados de RT-PCR indican que, en células de IR, los niveles de transcripción de α2 y β1 aumentaron, el nivel de α1 disminuyó, y no hubo ningún cambio evidente en los niveles de α4 y α5 (Fig. 2A). Los resultados de QRT-PCR confirmó además que el nivel de transcripción de α2 fue reforzada por 4,8 veces, y el de β1 se mejoró por 2,2 veces (Fig. 2B). Además, el Western Blot se llevó a cabo para detectar sus niveles de proteína, y una vista en alzado similar se observó (Fig. 2C). Estos resultados sugieren que la integrina α2β1 podría desempeñar un papel importante en la interacción alterada entre las células IR y el ECM. Para confirmar si la elevada expresión de α2β1 integrina es esencial para la invasividad de las células IR, desmontables de expresión α2 en células de IR por dos tipos de siRNA específicos para la integrina α2 se llevó a cabo, y el efecto se verificó por RT-PCR (Fig. 3A, izquierda). De hecho, desmontables de α2 deteriorado elongación celular IR (Fig. 3A, a la derecha) y la invasión en gel de colágeno (Película S1, S2).
Análisis
(A) Semi-cuantitativa de los niveles de mRNA de las subunidades de integrina, incluyendo α1, α2, α4, α5, y β1, de P y las células IR por RT-PCR. (B) El análisis cuantitativo de los niveles de mRNA de la integrina a2 y ß1 subunidades de P y células IR de QRT-PCR. La intensidad de las señales se cuantificó por densitometría y se normalizaron con β-actina. La representación es valor medio ± S.D. de nivel de ARNm relativo (** p & lt; 0,01) a partir de 3 experimentos independientes, indicado como factor de cambio en relación con las células P. (C) Análisis de los niveles de proteína de la integrina a2 y ß1 subunidades a partir de células P e IR cultivadas en gel de colágeno 3D por Western Blot. GAPDH se utilizó como control de carga.
(A) Desmontables de la subunidad de integrina α2 en células de IR dio lugar a una morfología redonda en gel de colágeno 3D. células de IR que se transfectaron con 2 siRNAs específico para la integrina α2 (siα2-1 o siα2-2), o un siRNA dirigido a Azami-Green (SIAG) como control, se transfirieron a un gel de colágeno 3D y se cultivaron durante 24 h . A la izquierda: los resultados de RT-PCR para verificar el efecto de la caída específica de la integrina α2. Derecha: imágenes representativas de morfologías celulares. Ampliación de la celda individual representada por las cajas blancas. Barra de escala, 20 micras. (B) de bloqueo funcional de la integrina α2β1 indujo una retracción reversible de protuberancias y la invasividad de las células IR. la observación de lapso de tiempo de las células tratadas con IR BHA2.1 en 3D colágeno gel arena. Las imágenes representativas de las células IR contables que no son tratados (NT), tratados con BHA2.1 (BHA2.1), o por lavado (Lave) con medio fresco se muestran. cajas blancas describen la zona dada que magnifica. Barra de escala, 100 micras. (C) Análisis de la morfología celular de las células tratadas con IR BHA2.1 frente a los controles en gel de colágeno en 3D mediante la cuantificación del porcentaje de células alargadas en total, expresado como valores medios ± SD (*** p & lt; 0,001) de 3 experimentos independientes incluidos alrededor 100 células. (D) La cuantificación de la velocidad en P y las células IR en 3D colágeno gel de arena para 6 h, expresado como valores medios ± S.D. (*** p & lt; 0,001) de 3 experimentos independientes incluyendo alrededor de 50 células. (E) Confocal imágenes de representante de MFP488 faloidina manchado esferoides P e IR en gel de colágeno a las 0 h ó 24 h. Barra de escala, 200 micras. (F) La cuantificación de la zona de esferoides por software ImageJ. (G) La relación de aspecto de esferoides se calculó a partir perímetro
2 /[4π (área)]. Los resultados se presentan como valores medios ± SD (*** p & lt; 0,001). De 3 experimentos independientes por triplicado
Desde integrinas se unen directamente los componentes de la ECM y proporcionar la tracción necesaria para la motilidad celular y la invasión , consideramos si la interacción entre la integrina α2β1 y el ECM fue importante para la invasión de células IR. El BHA2.1 anticuerpo de bloqueo de función (400 ng /ml) que reconoce el dominio I de α2, el sitio de unión para los colágenos, se usó para tratar las células de IR en el gel. observación de lapso de tiempo mostró que el bloqueo de la activación de la integrina α2β1 inducida por tanto la contracción de salientes de células y baja invasividad poco después del tratamiento, y la eliminación del anticuerpo por la adición de medio fresco restaurado invasión (Fig. 3B, la película S3). tratamiento BHA2.1 disminuyó significativamente la proporción de fenotipo alargado (Fig. 3C) y la velocidad de invasión en las células IR (Fig. 3D), y abolió invasión esferoide (Fig. 3E-3G), lo que sugiere que se requiere α2β1 integrina funcional para IR la invasión de células.
el aumento de la expresión de EGFR y la activación de las células IR participa en la invasión celular IR
EGFR es un receptor tirosina quinasa que se sobreexpresa frecuentemente o puertos mutaciones constitutivamente activos en NSCLC [19]. Por lo tanto, hemos comprobado si cualquier alteración de EGFR se produjeron en células de IR. Sorprendentemente, tanto EGFR nivel transcripcional y el nivel de proteína fueron muy elevados en células de IR, en comparación con los de las células P (Fig. 4A, 4B). Un alto nivel de activación de EGFR en el residuo relacionados con la señalización de Tyr1068 también se observó en células de IR sin ninguna estimulación por EGFR ligando (Fig. 4B). Por lo tanto, un inhibidor específico de la orientación de la tirosina quinasa de EGFR, PD168393 (10 mM), se utilizó para tratar las células de IR, y fue demostrado que disminuye la fosforilación de EGFR (Fig. 4C), la relación de las células IR alargados (Fig. 4D , 4E), y la velocidad de invasión (Fig. 4F). Al igual que la integrina α2β1 inhibición, esferoides IR PD168393 tratados permanecieron esferoides regulares sin expansión de volumen (Fig. 4G, 4H) o saliente (Fig. 4G, 4E). Estos resultados apoyan la hipótesis de que la ruta de señalización de EGFR está implicado en el aumento de la invasividad de las células IR.
(A) El análisis cuantitativo de los niveles de EGFR de ARNm a partir de células P e IR de QRT-PCR, representada como valores medios ± SD de nivel relativo de ARNm (*** p & lt; 0,001) de 3 experimentos independientes, indicado como factor de cambio en relación con las células P. (B) Análisis de los niveles de proteína de EGFR total y EGFR fosforilado (Tyr1068) por transferencia de Western. La intensidad de las señales se cuantificaron por densitometría y normalizado con GAPDH. Los resultados se representan como valores medios ± S.D. de nivel de proteína relativa (** p & lt; 0,01) a partir de 3 experimentos independientes, indicadas como factor de cambio en relación con las células P. (C-E) La inhibición de la activación de EGFR inducida por una morfología redonda de las células IR. células IR en gel de colágeno 3D se trataron con 10 mM PD168393 inhibidor de EGFR o DMSO como un control para 24 h. (C) Análisis de la expresión de EGFR fosforilado (Tyr1068) y EGFR total a partir de PD168393- y las muestras tratadas con DMSO por el Western Blot. GAPDH se utilizó como control. (D) Imágenes representativas de morfologías celulares de muestras de PD168393-tratado frente al control tratado con DMSO. (E) El porcentaje de células alargadas se cuantificó a partir de 3 experimentos independientes incluyendo aproximadamente 100 células, *** p & lt; 0,001. (F) La cuantificación de la velocidad en DMSO o células IR PD168393 tratados en 3D colágeno gel de arena para 6 h se representan como valores medios ± S.D. (*** p & lt; 0,001) de 3 experimentos independientes, incluyendo aproximadamente 50 células. (G) Confocal imágenes de MFP488 representante esferoides IR faloidina manchado en gel de colágeno de 0 horas y esferoides IR tratados con DMSO o PD168393 durante 24 h. Barra de escala, 200 micras. (H) La cuantificación de la zona de esferoides por software ImageJ. (I) La relación de aspecto de esferoides se calculó a partir del perímetro
2 /[4π (área)]. Los resultados se representan como valores medios ± SD (*** p & lt; 0,001). De 3 experimentos independientes por triplicado
integrina α2β1 y EGFR Promover la célula IR Invasión parcialmente a través de PI3K /Akt
Para identificar mejor el mecanismo de la integrina α2β1- y EGFR dependiente de la invasión de las células IR, inspeccionamos varios importantes moléculas de señalización corriente abajo que son regulados por la integrina α2β1 y /o EGFR, incluyendo MEK /Erk1 /2 [20], [21] , PI3K /Akt [21], [22], STAT3 [23], y p38 MAPK [24], [25]. Entre ellos, el Western Blot mostró sólo Erk1 /2 y la activación de Akt ser upregulated significativamente en células de IR, con total y los niveles de proteína fosforilados los formadores 'en los residuos necesarios para la transducción de señales (Fig. 5A). Para confirmar si su activación está relacionada con la invasividad de células IR, se utilizaron inhibidores específicos dirigidos a sus quinasas corriente arriba, incluyendo inhibidor de MEK U0126 (10 mM) para Erk1 /2 y el inhibidor de PI3K LY294002 (50 M) para Akt. La activación de Akt y Erk1 /2 fue abrogada por la fosforilación disminución de la inhibición de sus moléculas de aguas arriba (Fig. 6A). análisis de morfología mostró que el tratamiento LY294002 disminuye el porcentaje de células alargadas (Fig. 5C) y, por tanto, la velocidad de invasión (Fig. 5D), mientras que el tratamiento U0126 no lo hizo. Consistentemente, 3D esferoide ensayo de invasión demostró que la invasión de células IR en gel de colágeno se suprimió solamente después del tratamiento con LY294002, mientras U0126 tuvo poco efecto (Fig. 5E, 5G), a pesar de la expansión esferoide se inhibió ligeramente (Fig. 5F). Estos resultados sugieren la implicación de PI3K /Akt, pero no MEK /Erk1 /2, en la transducción de señales en las células invasiva IR.
(A) Análisis de la expresión de las formas totales y fosforiladas de Akt (Ser473), Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38 (Thr180 /Tyr182) y STAT3 (Ser727) por el Western Blot. La intensidad de las señales se cuantificó por densitometría y normalizado con GAPDH. Los resultados se representan como valores medios ± S.D. de nivel de proteína relativa (** p & lt; 0,01) a partir de 3 experimentos independientes, indicadas como factor de cambio en relación con las células P. (B-C) Efectos de la inhibición de Akt y ERK1 /2 en la morfología de las células IR. (B) Las imágenes de contraste de fase de inhibidor de PI3K LY294002 (50 M) o MEK inhibidor U0126 (10 mM) células tratadas de IR frente a las células de IR tratados con DMSO durante 24 h en gel de colágeno 3D (C) El porcentaje de células alargadas se cuantificó a partir de 3 experimentos independientes, incluyendo aproximadamente 100 células, *** p & lt; 0,001. (D) La cuantificación de la velocidad en DMSO de 50 M LY294002- o 10 células IR M U0126 tratados con gel de colágeno en 3D de arena durante 6 h, representado como valores medios ± SD (*** p & lt; 0,001) del 3 independientes experimentos incluyendo aproximadamente 50 células. (E) Las imágenes confocales de MFP488 representante esferoides IR con faloidina manchado en gel de colágeno de 0 h y esferoides de IR tratados con DMSO, LY294002, o U0126 para 24 h. Barra de escala, 200 micras. (F) La cuantificación de la zona de esferoides por software ImageJ. (G) La relación de aspecto de esferoides se calculó a partir del perímetro
2 /[4π (área)], y los resultados se presentan como valores medios ± SD (*** p & lt; 0,001). De 3 experimentos independientes por triplicado
(a) Regulación de EGFR en PI3K /Akt y vías //2 señalización ERK1 MEK. células IR en gel de colágeno 3D fueron tratadas con DMSO (control), EGFR inhibidor PD168393 (10 M), el inhibidor de PI3K LY294002 (50 mM), o MEK inhibidor U0126 (10 mM) durante 24 h. Se recogieron las células, y las cantidades de Akt fosforilada y total (Ser473) y ERK1 /2 (Tyr202 /Tyr204) se analizaron por Western Blot.