Extracto
Antecedentes y propósito
microRNAs (miRNAs) de tejido puede detectar cánceres y predecir el pronóstico. Varios estudios recientes informaron de que el tejido, plasma, saliva y miRNAs comparten perfiles de expresión similares. En este estudio, se investigó la capacidad de discriminación de miRNAs salivales (incluyendo toda la saliva y el sobrenadante de la saliva) para la detección de cáncer de esófago.
Materiales y Métodos
Por Agilent microarrays, seis miRNAs desregulados de todo se seleccionaron muestras de saliva de siete pacientes con cáncer de esófago y tres controles sanos. Los seis seleccionados miRNAs fueron sometidos a validación de sus niveles de expresión por RT-qPCR utilizando enteros ambas muestras de saliva y el sobrenadante de saliva de un conjunto independiente de 39 pacientes con cáncer de esófago y 19 controles sanos.
Resultados
Seis miRNAs (miR-10b *, miR-144, miR-21, miR-451, miR-486-5p, y miR-634) fueron identificados como objetivos por Agilent microarrays. Después de la validación por RT-qPCR, miR-10b *, miR-144 y miR-451 en toda la saliva y miR-10b *, miR-144, miR-21 y miR-451 en el sobrenadante de la saliva se upregulated significativamente en los pacientes, con una sensibilidad de 89.7, 92.3, 84.6, 79.5, 43.6, 89.7, y 51.3% y especificidad de 57.9, 47.4, 57.9%, 57.9, 89.5, 47.4, y 84.2%, respectivamente.
Conclusiones
Nos encontramos miRNAs distintivos de cáncer de esófago en su conjunto, tanto la saliva y la saliva sobrenadante. Estos miRNAs poseen poder discriminatorio para la detección de cáncer de esófago. Debido a que la toma de saliva no es invasiva y cómoda, miRNAs salivales tienen gran potencial como biomarcadores para la detección de cáncer de esófago en zonas con alto riesgo
Visto:. Xie Z, G Chen, Zhang X, D Li, Huang J, Yang C, et al. (2013) Los microARNs como biomarcadores salivales prometedores para la detección de cáncer de esófago. PLoS ONE 8 (4): e57502. doi: 10.1371 /journal.pone.0057502
Editor: Anthony W. I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 29 de octubre de 2012; Aceptado 22 de enero de 2013; Publicado: 1 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de esófago (CE) es el octavo más común. cáncer y 6º principal causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo [1]. Un estimado de 482,300 nuevos casos de la CE y 406.800 muertes ocurrieron en 2008 en todo el mundo. Las tasas de incidencia varían internacionalmente por casi 16 veces, con las tasas más altas de África oriental y meridional y Asia oriental y el más bajo en África Occidental y Central y América Central, tanto en hombres como en mujeres. CE es de 3 a 4 veces más común entre los hombres que en las mujeres [2]. Su incidencia ha aumentado rápidamente en los países occidentales durante el último medio siglo [3]. El área de Chaoshan de la provincia de Guangdong en China tiene una alta incidencia de CE (& gt; 100 /100.000) [4]. El número de muertos causados por la CE en China representa más del 70% de todas las muertes en todo el mundo de la CE [5]
La tasa de supervivencia global sigue siendo baja.; sólo el 3-5% de los pacientes diagnosticados sobrevivir durante 5 años [6]. Por el contrario, la tasa de supervivencia aumenta hasta el 90% en los pacientes diagnosticados con la enfermedad en estadio I (T1N0M0) que se someten a resección quirúrgica [7]. Por lo tanto, el diagnóstico y el tratamiento precoz son vitales. En la actualidad, el diagnóstico clínico depende principalmente de la radiología y la biopsia endoscópica. Sin embargo, estas pruebas son costosas, invasor, o causan molestias a los pacientes, y la mayoría de los pacientes están en una etapa avanzada de la enfermedad cuando se alcanza un diagnóstico preciso. Por lo tanto, es necesario identificar un biomarcador de la fase temprana de la CE.
Varios estudios han demostrado que la expresión aberrante de miRNAs está estrechamente relacionada con la patogénesis y el desarrollo de cáncer, y miRNAs poseen poder discriminatorio como biomarcadores de cáncer [ ,,,0],8]. Varios estudios han informado de que los miRNAs se expresan de forma aberrante en el tejido canceroso y plasma en pacientes con EC [9], [10]. Sin embargo, todavía no se ha informado de la expresión de los genes miARN en la saliva de los pacientes con EC. Debido a la extensa suministro de sangre en las glándulas salivales, la saliva se considera que es un producto terminal de la circulación de la sangre, y las moléculas que están presentes en el plasma también están presentes en la saliva. Por lo tanto, se cree que la saliva para reflejar la salud sistémica y reflejar las condiciones tales como el cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares,
etc
. [11]. Tejidos, plasma, saliva y miRNAs comparten similares perfiles de expresión [12] - [16]. Este estudio comprendió dos fases: la fase de descubrimiento y validación. En la fase de descubrimiento, se seleccionaron seis miRNAs que fueron significativamente más dysregulated en toda la saliva de los pacientes con EC por el análisis de microarrays Agilent como objetivos. En la fase de validación, los niveles de expresión de los seis miRNAs objetivo fueron validados por RT-qPCR utilizando enteros ambas muestras de saliva y sobrenadante de la saliva.
Materiales y Métodos
estimación del tamaño de muestra
En la fase de descubrimiento, de acuerdo con los resultados de microarrays Agilent, la sensibilidad de miR-144 para EC fue del 85,7%. La fórmula para la estimación del tamaño de la muestra fue el siguiente: n =
U
α
/2P (1-P) /
δ
2
En esta fórmula,
n
es el número necesario,
u
α
/2 es el nivel de la prueba,
α es el valor de corte
de distribución normal, dos colas
P
es el valor esperado de la sensibilidad, y
δ
es el error permisible.
de acuerdo con la capacidad de alcanzar el tamaño de la muestra para nuestro estudio, se optó por los valores de
α = 0,05
(
u
alfa
/2 = 1,96),
δ
= 0,11, y los valores fueron sustituidos en la fórmula. El resultado fue
n
= 1,96
2 × 0,857 × (1-0,857) /0.15
2 ≈38.9 = 39. Es decir, en la fase de validación de este estudio, el número mínimo de los casos necesarios para el grupo de EC fue de 39, y se eligieron 39 casos. De acuerdo con la capacidad de alcanzar el tamaño de la muestra de nuestro estudio, se asumió la proporción de casos en el grupo de CE a que en el grupo sano de ser 02:01. Se eligieron 19 casos en el grupo sano.
selección Asunto
46 y 46 de la saliva saliva total muestras de sobrenadante de 46 pacientes con EC y toda la saliva 22 y 22 muestras de sobrenadante de saliva de edad, el género y los individuos sanos emparejados étnicamente se obtuvieron a partir de Guangdong hospital general entre julio de 2011 y enero de 2012. los resultados histopatológicos de los pacientes fueron confirmados por biopsia endoscópica, y los pacientes de la CE no tenía enfermedades orgánicas, sistémicos, u orales concomitantes, como la hepatitis, la diabetes mellitus,
etc
, que podría influir en los niveles de expresión de la CE marcador. La estadificación del cáncer se basa en el sistema de estadificación /TMN UICC [17]. Las etapas I, II, y III se basaron en los resultados de histopatología después de la resección quirúrgica. El estadio IV se basó en los resultados de histopatología de la biopsia de punción de ganglios metastásicos o resultados de PET-CT. "N /A (no disponible)" se le asignó cuando los pacientes se negaron pruebas o tratamientos adicionales. Los sujetos sanos como controles se recogieron en base a los resultados negativos de examen de salud, incluyendo análisis de sangre, radiografías de tórax, exámenes orales, exámenes de ultrasonido abdominal, pruebas de sangre oculta en heces, y los exámenes rectales digitales. Ninguno de estos controles había sido diagnosticado con cualquier tipo de malignidad, ya sea anterior al estudio o en el momento de la recogida de muestras. Este estudio fue aprobado por el Comité de la Junta de Revisión Institucional y Ética del Hospital General de la provincia de Guangdong. Todos los participantes se les proporcionaron su consentimiento por escrito para que su información se almacena en la base de datos del hospital y se utiliza para la investigación.
recogida de saliva
Se les pidió que abstenerse de comer, beber, fumar y la higiene bucal procedimientos para al menos 2 horas antes de la recogida. Para estimular el flujo salival glandular, los sujetos recibieron una solución de ácido cítrico al 2% para la aplicación a las superficies laterales bilateral posterior de la lengua con un hisopo de algodón durante 5 s cada 30 s. La estimulación del ácido cítrico continuó a intervalos de 30 segundos durante todo el procedimiento de recogida. Hasta 5 ml de saliva de cada sujeto se recogió en un tubo de centrífuga de 50 ml. Un total de 2 ml de saliva se retiró del tubo como una muestra de saliva entera. El 3 ml restante de las muestras de saliva se centrifugó a 3000 ×
g
durante 15 min a 4 ° C para hacer girar hacia abajo células exfoliadas, y el sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga seguido de una segunda centrifugación a 12.000 ×
g
durante 10 min a 4 ° C para eliminar por completo los componentes celulares como muestras de saliva sobrenadante. Whole saliva es la saliva que no ha sido centrifugada. Puede contener exfoliada células de cáncer de esófago regurgitados desde el esófago debido a la obstrucción por tumor de esófago. La saliva es sobrenadante de la saliva que ha sido centrifugado y que no contiene ningún células exfoliadas y otros pellets. Por lo tanto sobrenadante saliva se considera que es el producto terminal de la circulación de la sangre y puede reflejar ambiente interno de nuestros Bodis. Las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. El procedimiento antes mencionado se debe acabar en el plazo de 2 h [18].
Agilent microarray en fase de descubrimiento
Debido a que esta es la primera investigación sobre los microARN salivales para la detección de la CE en el mundo, acaba de elegir 10 casos para realizar microarrays. Se seleccionaron siete muestras de saliva total del grupo de CE y 3 del grupo sanos al azar. La patología de los siete pacientes con EC fue el carcinoma de células escamosas; uno era el estadio I, una etapa II, 3 en estadio III y IV en dos etapas. Un total de 923 secuencias de genes miARN maduros se ensamblaron y se integra en nuestro diseño miARN microarrays. Los datos en bruto se normalizaron por el algoritmo de cuantiles, Gene primavera Software 11.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). 6 miRNAs fueron seleccionados como objetivos, y sus niveles de expresión fueron validados por RT-qPCR en la fase de validación. El método de selección fue la siguiente: el valor gTotalGeneSignal en la micromatriz Agilent ascendió al nivel de expresión de cada uno de los genes miARN. Por lo tanto, para los miRNAs idénticos, gráficos de barras se elaboraron de acuerdo con el valor de cada gTotalGeneSignal miARN. Se seleccionaron cinco miRNAs: miR-144, miR-10b *, miR-451, miR-486-5p, y miR-634, los valores de los cuales tendían a ser mucho más alto o más bajo en el grupo de EC que en el grupo sano y que también están estrechamente relacionados con el desarrollo de deseases. Mientras tanto, varios estudios han informado de que el miR-21 se expresa de manera aberrante en el tejido canceroso y el plasma de pacientes con EC [9], [10]; el valor gTotalGeneSignal de miR-21 no mostraron esta tendencia, pero también fue seleccionada como objetivo. Los gráficos de barras de los 6 miRNAs diana se presentan en la Figura 1. (Los siete barras delante representar el valor gTotalGeneSignal del grupo CE, y el 3 representan el valor detrás de gTotalGeneSignal del grupo sano. Eje Y representa el valor de gTotalGeneSignal ).
A) Con la excepción de la muestra 4, los valores de las seis muestras de grupo EC fueron mayores que los de las tres muestras grupo sano. B) Con la excepción de la muestra 2, los valores de las seis muestras de grupo EC fueron mayores que los de las tres muestras grupo sano. C) Con la excepción de la muestra 10, los valores de las muestras del grupo CE, siete fueron mayores que los de las dos muestras grupo sano. D) Con la excepción de la muestra 10, los valores de las muestras del grupo CE, siete fueron más altos que los de las dos muestras grupo sano. E) Todos los valores del grupo de la CE fueron inferiores a los tres del grupo sano. F) Varios estudios han informado de que los miRNAs se expresan de forma aberrante en el tejido canceroso y el plasma de los pacientes de la CE; Sin embargo, el valor gTotalGeneSignal de miR-21 no fue diferente entre la CE y los grupos sanos. Sin embargo, también fue seleccionado como un miARN objetivo.
Fase de validación
Los niveles de expresión de los miRNAs 6 seleccionados fueron validados por RT-qPCR utilizando tanto las 58 muestras de saliva y enteros las 58 muestras de sobrenadante de saliva de 39 pacientes con EC y 19 controles sanos. El Kit mirVana PARIS (Ambion, EE.UU.) se utilizó para aislar el ARN total de 1 ml de saliva total o sobrenadante de la saliva, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Por último, el ARN se eluyó en 30 l de agua libre de nucleasa precalentado (95 ° C) y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Se determinó la calidad y la concentración de ARN total aislado utilizando un NanodropND-1000 (Thermo Scientific, Worcester, MA), con el valor por OD260 /280 alrededor de 2,0 indica una alta calidad o pureza. La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo primero con 11 l de mezcla que contiene 2 l de extracto de ARN, 2 l de cebador de RT (Ribo, China), y 7 l de agua libre de nucleasa. La mezcla de 11-l se incubó a 70 ° C durante 10 min y en hielo durante 2 min. A continuación, 5 l de tampón de RT, 2 l de dNTP (2,5 mM), 0,5 l de inhibidor de RNasa (40 U /l), 0,5 l de transcriptasa inversa (200 U /l), y 6 l de agua libre de nucleasa eran añadido a la mezcla de 11-mL. La reacción de transcripción inversa continuó a 42 ° C durante 60 min, 70 ° C durante 10 min, y 4 ° C para ∞. solución de ADNc (3 ml) se amplificó usando 9 ml de SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, China), 2 l de cebador directo miRNA, 2 l de cebador inverso de los genes miARN, y 4 l de agua libre de nucleasa en un volumen final de 20 mL. PCR cuantitativa se ejecuta en un Biorad CFX96 2,1 (BioRad Biosystems), y las mezclas de reacción se incubaron a 95 ° C durante 2 min, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 10 s. Al final de los ciclos de PCR, se realizó análisis de la curva de fusión para validar la generación del producto de PCR esperado. El ajuste de la curva de fusión fue de 65,0 a 95,0 ° C en incrementos de 0,5 ° C durante 0,05 min + lectura de placas. Cada muestra se analizó por triplicado. Todos los valores de Ct eran & lt; 36. Los niveles de expresión de cada uno de los genes miARN objetivo se normalizaron a la de miR-16. miR-16 es los microARN más utilizados de control interno en las muestras de fluidos corporales, incluyendo el plasma [10], [19]. Y lo más importante, en la fase de descubrimiento y validación, nuestro estudio demostró que el miR-16 podría expresar de forma estable en la saliva y el trabajo como un control interno para miRNAs salivales. Los datos en bruto en la fase de descubrimiento se pueden descargar desde la página web de GEO: www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/linking.html, y el número de acceso es GSE41268. El methodoloy, los datos en bruto e imágenes de la validación de miR-16 como un control interno en nuestra investigación se presentaron en los datos S1. Todos los niveles de expresión se calcularon utilizando la 2
-ΔΔCt método [20]. En pocas palabras: la muestra
iΔCt
target = muestra de miR
TIC
objetivo de miR-muestra
TIC
miR-16; muestra
iΔΔCt
target = muestra de miR
iΔCt
objetivo de miR -. el valor medio de Ct
objetivo de miR del grupo sano
estadístico El análisis
los niveles de expresión de miRNAs y edades se compararon mediante la prueba de Mann - Whitney o el test de Kruskall - Wallis H. Géneros se compararon mediante la χ
2 test. Un modelo de regresión logística multivariante se estableció para los factores de riesgo 4: fumar, consumo de alcohol, beber o comer a temperaturas calientes, y nacionalidad Chaoshanese. El odds ratio (OR) de los 4 factores de riesgo se calcularon por LR hacia adelante. Cada O se comparó con la χ
2 test. Características del receptor de funcionamiento (ROC) se utilizaron para evaluar el poder discriminatorio de cada miARN para la diferenciación de los pacientes y controles. La correlación de cada nivel de expresión de los genes miARN entre toda la saliva y la saliva sobrenadante se analizó mediante la prueba de correlación de Spearman. Las diferencias entre los poderes discriminatorios de miRNAs objetivo se compararon con el método de Delong usando el software MedCalc12.2.1. Otros análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS, versión 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). A p
valor de. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
toda la saliva Perfil |
Diez muestras de saliva enteros (7 de los pacientes con CE y 3 de los controles sanos) fueron evaluados por Agilent microarrays. Un total de 923 secuencias de genes miARN maduros se ensamblaron y se integra en nuestro diseño miARN microarrays. Se detectaron un total de 461 miRNAs en la saliva total (el valor de la señal de la sonda de estos miRNAs estaba presente en al menos una muestra). De estos 461 miRNAs, 452 fueron detectados en muestras de CE y 391 en las muestras de control sanos. Se detectaron un total de 232 miRNAs en las 10 muestras. Se detectaron un total de 261 miRNAs en los 7 muestras de la CE, y 243 miRNAs en los 3 muestras de control. Veinticinco miRNAs mostraron diferencias significativas en la expresión entre el grupo de EC y el grupo sano. 6 (miRNAs miR-144, miR-10b *, miR-21, miR-451, miR-486-5p, y miR-634) se sometieron a la validación de sus niveles de expresión por RT-qPCR. El número de miRNAs detectados en cada muestra se presenta en la Tabla 1.
Características de los pacientes y controles sanos de la CE en la fase de validación
En la fase de validación, 39 pacientes con EC fueron seleccionado, 32 (82,1%) de los cuales tenían carcinoma de células escamosas, 4 (10,3%) tenían adenocarcinoma, y 3 (7,7%) tenían carcinoma de células pequeñas. La estadificación del cáncer de los pacientes con EC fue de la siguiente manera: 0 (0%) estaban en el estadio I, 12 (30,8%) en estadio II, 11 (28,2%) en el estadio III, 10 (23,6%) en estadio IV, y 6 no estaban disponibles. Los datos relativos a los pacientes de la CE y los controles sanos se presentan en la Tabla 2. Todos los pacientes con EC fueron & gt; 40 años de edad, principalmente de Chaoshan, provincia de Guangdong, informó beber o comer a altas temperaturas, y los bebedores de alcohol, y la mayoría eran varones fumadores. De acuerdo con el modelo de regresión logística, las RUP de individuos Chaoshanese y beber o comer a una temperatura alta fueron estadísticamente significativas (41.984 y 31.594, respectivamente).
poder discriminatorio de toda la saliva y la saliva de sobrenadante de miRNAs CE
los niveles de expresión de los miRNAs 6 de destino seleccionados (miR-10b *, miR-144, miR-21, miR-451, miR-486-5p, y miR-634) fueron validados por RT qPCR utilizando enteros ambas muestras de saliva y sobrenadante de la saliva. 3 miRNAs (miR-10b *, miR-144 y miR-451) en toda la saliva del grupo EC fueron significativamente upregulated (p
= 0,001, 0,012 y 0,002, respectivamente; los factores de cambio, 58,7 , 45.6 y 42.4, respectivamente). Los otros 3 miRNAs (miR-21, miR-486-5p, y miR-634) no mostraron diferencias significativas entre el grupo de EC y el grupo sano (
p = 0,110
, 0,078 y 0,157, respectivamente). Se establecieron curvas ROC para evaluar el poder discriminatorio de la saliva completa de miR-10b *, miR-144 y miR-451; las AUC eran 0,762, 0,706, y 0,756, respectivamente. Se necesita un valor óptimo de corte para la curva ROC para definir el poder discriminatorio. Cuando el índice Younden (Younden = índice de sensibilidad especificidad + -1) alcanza el valor máximo, el valor de corte correspondiente será el valor óptimo de corte [21].
Los valores de corte de los 3 miRNAs saliva total (MIR -10b *, miR-144 y miR-451) fueron determinados para ser 0.74530111, 0.78