Extracto
virus persistentes se mantiene bajo control por los linfocitos específicos. El repertorio T clonal (TCR) contra el virus de Epstein-Barr (EBV), una vez establecido después de la infección primaria, exhibe una estabilidad robusta con el tiempo. Sin embargo, los determinantes que contribuyen a esta persistencia a largo plazo son todavía poco caracterizados. Tomando ventaja de un
in vivo
entorno clínico donde la homeostasis de linfocitos fue perturbado de forma transitoria, hemos estudiado las células T CD8 específicas de antígeno EBV antes y después de no mieloablativo linfático agotan la quimioterapia de pacientes con melanoma. A pesar de una mayor diferenciación de las células T avanzada, los pacientes mostraron células T composición clonal comparable a individuos sanos, compartiendo una preferencia por
TRBV20
y
TRBV29
uso segmento del gen TCR y varios clonotypes públicas codominantes. Además, nuestros datos revelaron la presencia de relativamente pocos clonotypes de células T específicas de antígeno EBV dominante, que en su mayoría persistió siguiente transitoria linfo-agotamiento (TLD) y la recuperación de linfocitos, probablemente relacionado con ausencia de reactivación EBV y
de novo
cebado de células T en estos pacientes. Curiosamente, clonotypes persisten frecuentemente memoria /genes expresados co-homing-asociado (
CD27
,
IL7R
,
Eomes, CD62L /venta
y
CCR5
) que apoya la idea de que son particularmente importantes para las respuestas de células T CD8 de larga duración. Sin embargo, la composición clonal de las células T CD8 específicas de VEB fue preservado en el tiempo con la presencia de los mismos clonotypes dominantes después de la quimioterapia no mieloablativo. La persistencia clonotipo observado demuestra alta robustez de la homeostasis de las células T CD8 y reconstitución
Visto:. Iancu EM, Gannon PO, Laurent J, Gupta B, Romero P, Michielin O, et al. (2013) La persistencia de células T CD8 clonotypes EBV antígeno-específicos en la homeostática de reconstitución inmunitaria en pacientes con cáncer. PLoS ONE 8 (10): e78686. doi: 10.1371 /journal.pone.0078686
Editor: Derya Unutmaz, Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: August 1, 2013; Aceptado: September 15, 2013; Publicado: 25 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Iancu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue patrocinado y apoyado por el Centro Nacional suizo de Competencia en Investigación (NCCR) Oncología Molecular y la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza otorga 32003B0-118123 y 310030-129670. P. O. Gannon es también el beneficiario de una beca de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR-IRSC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
virus primaria Epstein-Barr (EBV) se asocia con la replicación viral masiva. A pesar de la generación de una respuesta inmune específica robusta de células T, EBV establece una infección latente en las células B [1]. Sin embargo, las personas infectadas con EBV sanos permanecen asintomáticos durante toda su vida debido a la contención viral mediante la memoria específica de antígeno de linfocitos T CD8 [1-3]. Como se dedica una atención creciente a la optimización de las estrategias de vacunación terapéutica contra el cáncer, el control inmunológico de la infección crónica EBV representa un sistema modelo interesante para estudiar los mecanismos implicados en la generación y mantenimiento de las respuestas inmunes protectoras de toda la vida.
La reserva de células T CD8 cebado con antígeno es altamente heterogéneo y comprende las subpoblaciones de células T en los diferentes grados de diferenciación celular en base a su fenotipo, la función y la localización anatómica, con lo que la distinción entre "efector" y las células T citolíticos "memoria" desafiante [4- 6]. Generalmente, las células T de memoria de la exhibición supervivencia a largo plazo y la capacidad de auto-renovación, de alto potencial proliferativo, y la capacidad de producir con rapidez y eficacia las células efectoras en respuesta al antígeno reencuentro [7-9]. En contraste, las células T efectoras tienen la capacidad de migrar al sitio de la inflamación, para matar las células diana que llevan el antígeno y secretan varias citoquinas (por ejemplo, IFN, TNF) [10].
Si se mantienen las respuestas de células de memoria durante períodos prolongados o de forma periódica "renovada" sigue siendo un tema de debate. Es una cuestión particularmente difícil de abordar en los seres humanos, ya que requiere un análisis en profundidad de las respuestas inmunes protectoras durante períodos prolongados de tiempo. A este respecto, el receptor de células T (TCR) es un excelente marcador que permite a las respuestas específicas de antígeno a seguir a lo largo de la diferenciación de células T y en el tiempo [11]. análisis a fondo de ambas respuestas de células T CD8 específicas de antígeno virales y tumorales han revelado que el repertorio de células T específicas de antígeno se compone generalmente de muy frecuente (también definido como dominante), así como menos frecuente (definida como no dominante) de células T clonotypes [12,13]. A través de un proceso conocido como la selección clonotipo TCR, ciertos clonotypes pueden llegar a ser más dominante a lo largo de la diferenciación de células T [14 a 16] o en todo el curso del tiempo de la infección [17]. Persistencia de clonotypes de células T específicas del virus humanos lo largo de varios años se ha demostrado en los seres humanos con diversas infecciones virales: influenza [18], virus herpes simplex [19,20], EBV [21], el citomegalovirus (CMV) [14] y humana virus de la inmunodeficiencia (VIH) [22]. Recientemente, Klarenbeek y colegas [23] abordan la cuestión de si el repertorio clonal que se establece durante la fase temprana de infecciones contra CMV y EBV se mantiene durante largos períodos de tiempo. Ellos encontraron que las respuestas inmunes fueron muy estables, y una vez establecido no evolucionará durante los 5 años de seguimiento [23]. Si bien las respuestas de células T específicas de virus del herpes revelaron una estabilidad sin precedentes de la clonotipo repertorio TCR con el tiempo después de la infección primaria, se sabe menos acerca de su persistencia durante condiciones de estrés inmunológico en portadores asintomáticos.
En el presente estudio, se examinado la solidez de las respuestas específicas de antígeno EBV en un
in vivo
entorno en el que el equilibrio entre el virus y la respuesta inmune puede verse comprometida temporalmente después transitoria linfo-agotamiento (TLD). Específicamente, se evaluaron la composición EBV antígeno específico CD8 T clonotipo celular y la persistencia en pacientes con melanoma que fueron tratados con un régimen de quimioterapia no mieloablativo, seguido por la transferencia adoptiva de células (ACT) de células mononucleares de sangre periférica autólogas (PBMC) [24,25 ]. Para evaluar cuantitativamente las respuestas de células T específicas del virus, directa
ex vivo
clonotypic análisis combinado de perfiles de expresión génica de las células T específicas de antígeno individuales se llevaron a cabo [13]. Las respuestas anti-virales de células T en los pacientes eran más diferenciada en comparación con individuos sanos, que comprende tanto las células CD8 T efectoras de memoria y. Clonotypes dominantes de la cadena beta del TCR, incluyendo varias secuencias de TCR públicas, se encontró que persisten con el tiempo en individuos sanos y siguiendo TLD y ACT entre los pacientes. Luego estudió clonotypes de células T con frecuencias fluctuantes siguientes TLD y reconstitución inmune, y observamos que clonotypes con mayor frecuencia llevan a una memoria polifuncional /homing perfil de expresión génica (
CD27
,
IL7R
,
Eomes, CD62L /venta
y
CCR5
). En conjunto, nuestros datos sugieren que el repertorio de células T específicos para el VEB persiste no sólo bajo condiciones de estado estable, sino también durante perturbaciones transitorias inmunológicos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
los estudios clínicos se diseñaron y llevaron a cabo de acuerdo con las normas reglamentarias pertinentes, y aprobados por (i) la comisión de ética de la Universidad de Lausana, (ii) el Comité de Revisión de Protocolo LICR, y (iii) la autoridad reguladora nacional suizo (Swissmedic ). Han sido registrados en los ensayos clínicos del NCI con el número NCT00324623 y EU20607 (www.clinicaltrials.gov). Todas las muestras de sangre de pacientes se recogieron en el consentimiento informado por escrito. Las muestras de sangre periférica de donantes sanos bcl3 cuatro VEB positivo, BCL4, BCL7 y BCL8, con edades comprendidas entre los 25 y 45 años, fueron recogidos en dos puntos de tiempo, en los años 2002 y 2006, y todos los donantes dieron su consentimiento informado por escrito.
pacientes y el tratamiento del melanoma
las muestras de sangre de cinco pacientes con melanoma con EBV positivo, con edades comprendidas entre 39 y 75 años, matriculados en la fase I de ensayos clínicos en el Departamento de Oncología del hospital Universitario de Lausana (Suiza) , fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo antes y después del tratamiento. Después de la recogida de las PBMC por leucaféresis (Leuka), los pacientes recibieron régimen de quimioterapia no mieloablativo que consiste en cualquiera de busulfán en 2 mg /kg (pacientes LAU 618 y Lau 672) o ciclofosfamida (CTX) a 30 mg /kg (LAU 1144 y primera ronda para la LAU 1013) o 60 mg /kg (LAU 936 y segunda ronda de LAU 1013) durante dos días y fludarabina a 30 mg /m
2 por 3 días [24,25]. Tres días después de la última inyección de fludarabina, PBMCs autólogas se vuelven a infundir y la vacunación con el péptido Melan-A péptido análogo emulsionado en adyuvante incompleto de Freund se daba por vía subcutánea como se describe anteriormente [24]. LAU 1144 paciente también recibió una proteína soluble LAG-3 como adyuvante. Se tomaron
Los niveles de anticuerpos contra EBV en pacientes con melanoma
muestras de plasma de todos los pacientes en varios puntos de tiempo antes y después del tratamiento linfo el ozono y se analizaron para las alteraciones en los niveles de anticuerpos conocidos por estar asociados con un estado de reactivación de EBV. En concreto, se compararon los niveles de anticuerpos plasmáticos contra EBV tres proteínas expresadas: EBNA-IgG (Epstein-Barr antígeno nuclear), EA-IgG (principios de antígeno), VCA-IgG e IgM (cápside viral antígeno). Los anticuerpos específicos de VEB se analizaron utilizando el sistema de ensayo EBV AtheNA Multi-Lyte (Zeus científica, Sommerville, NJ, EE.UU.) en un lector Luminex 200 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como unidades arbitrarias.
Preparación de las células y citometría de flujo
PBMCs se obtuvieron por centrifugación de densidad utilizando Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecia). linfocitos T CD8 se enriquecieron de manera positiva a partir de PBMCs crioconservados utilizando microperlas magnéticas recubiertas con anti-CD8 (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Alemania). multímeros * 0201 /péptido marcado con PE HLA-A se prepararon como se describe anteriormente [26] con el HLA-A2 restringido epítopo GLCTLVAML (referido como A2 /GLC) derivado de la proteína lítica EBV BMFL1. Las células se tiñeron primero con multímeros marcado con PE durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) en PBS, 0,2% de BSA, 50 uM de EDTA, y luego con anticuerpos apropiados (20 min a 4 ° C). Las células se analizaron ya sea directamente (flujo LSR II citómetro; BD Biosciences, San Diego, CA) o ordenados en poblaciones definidas utilizando una máquina FACSVantage SE (BD Biosciences). Los siguientes Abs monoclonales se compraron de BD Biosciences o BD PharMingen; anti-CD28-FITC, anti-CD8-aloficocianina /Cy7, anti-IgG de rata CCR7 el MAB, de cabra anti-IgG de rata-aloficocianina, y CD3-AmCyan-A. Anti-CD45RA-PE-Tejas mAb rojo fue adquirido de Beckman Coulter (Marsella, Francia).
Generación de clones de células T y la cultura
HLA-A2 /multímero
+ CD8
+ subconjuntos de células T se definen como efector de memoria (EM) CCR7
-CD45RA
-CD28
+ (EM28
POS), CCR7
-CD45RA
-CD28
- (EM28
neg) y CCR7 efector
-CD45RA
+ CD28
- (ARME), y fueron ordenados por citometría de flujo directamente
ex vivo gratis (Figura S1) . Las células clasificadas se clonaron por dilución limitante y se expandieron en RPMI 1640 suplementado con suero humano 8% (HS), 150 U /ml recombinante humano IL-2 (rhIL-2; un regalo de GlaxoSmithKline), 1 microgramo /ml de fitohemaglutinina (PHA ; Sodiag, Losone, Suiza) y 1x10
6 /ml irradiados PBMCs alogénicos (3'000 rad) como células alimentadoras. A2 /multímero
clones de células T + fueron expandido en periódicos (cada 15 días) la re-estimulación en placas de 24 pocillos con PHA, células alimentadoras irradiadas y hrIL-2.
directa ex vivo de células de clasificación, la amplificación de cDNA y de un solo gen específico de células PCR
alícuotas individuales o cinco células fueron ordenados directamente
ex vivo
de subconjuntos de células T de interés y preparación de ADNc y amplificación de cDNA mundial realizaron como se describe anteriormente [27,28]. firma genética de células T individuo fue identificado por PCR de genes específicos como se describe [28] y los productos de PCR se visualizaron después de la electroforesis en un gel de agarosa al 2,5%. Se utilizaron los siguientes cebadores:
GAPDH
: 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 '; rev-5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ',
beta 2 microglobulina
: 5'-CCAGCAGAGAATGGAAA GTC-3'; rev-5'-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3 ',
CCR7
: 5'-CCAGGCCTTATCTCC AAGACC-3'; rev-5'-GCATGTCATCCCCACTCTG-3 ',
CD27
: 5'-ACGTGACAGAGTGCC TTTTCG-3'; rev-5'-TTTGCCCGTCTTGTAGCATG-3 ',
IL7R gratis (IL-7RA /CD127): 5'-ATC TTGGCCTGTGTGTTATGG-3'; rev-5'-ATTCTTCTAGTTGCTGAGGAAACG-3 ';
Eomes gratis (eomesodermin): 5'-AGCAGGCTGTGAACATTGG-3 '; rev-5'-TTGACTCCTGGG CCTAGTATC-3 ',
CCR5
: 5-TCAGCAGGAAGCAACGAAGG-3'; rev-5'-TCTTTGACTTG GCCCAGAGG-3 ',
KLRD1 gratis (CD94): 5'-GTGGGAGAATGGCTCTG CAC-3'; rev-5'-TGAGCTGTTGCTTACAGATATAACGA-3 ',
IFNG gratis (IFN): 5'-GCCAAC CTAAGCAAGATCCCA-3'; rev-5'-GGAAGCACCAGGCATGAAATC-3 ',
PRF1 gratis (perforina): 5'-TTCACTGCCACGGATGCCTAT-3'; rev-5'-GCGGAATTTTAGGTGGCCA-3 ',
GZMB gratis (granzima B): 5'-GCAGGAAGATCGAAAGTGCGA-3'; rev-5'-GCATGCCAT TGTTTCGTCCAT-3 ',
VENTA gratis (CD62L): 5'-CCGTCTGTGAATTGGACCAT-3'; rev-5'-AAC AGCAAAACCCCCAAACT-3 '.
TCR spectratyping, secuenciación y TCR clonotyping
TCR spectratyping [14] fue utilizado para identificar todos los clonotypes TCR, que fueron clasificados de acuerdo a los inmunogenética (IMGT) nomenclatura propuesta por Lefranc y sus colegas (http : //imgt.org/) [29]. Para identificar rápidamente el uso segmento TRBV, reservas de ADNc de EBV antígeno-específicos de células T CD8 fueron sometidos inicialmente a PCR individual utilizando un conjunto de cebadores marcados con fluorescencia hacia adelante previamente validados específico para el TCR 22
BV
subfamilias y uno no marcado revertir cebador específico para la región constante de la cadena beta del TCR [30]. Este análisis spectratyping TRBV-CDR3 representa un paso de preselección que permite el tiempo y reactivos de ahorro (datos no mostrados). Una vez que se identificaron subfamilias TRBV positivos, cDNA muestras individuales generadas a partir de cualquiera de
ex vivo
ordenados muestras de células individuales (n = 477) y las muestras de 5-celulares (que representa el equivalente de 300 a 450 células T CD8 específicas por EBV donante sano o paciente con melanoma) o de
in vitro
clones generados de células T (donantes sanos, n = 530 clones; pacientes con melanoma, n = 779 clones) se sometieron a PCR TRBV-específicos. Separación y detección de fragmentos de PCR amplificados que contenía todo el segmento CDR3 se realizaron en presencia de marcadores de tamaño fluorescentes en un ABI PRISM 310 Genetic Analizador (Applied Biosystems /Life Technologies Corporation, Zug, Suiza) y los datos se analizaron con GeneScan 3.7.1 ( Applied Biosystems). En el último paso, los productos de PCR de interés se purificaron y se secuenciaron directamente con el cebador inverso (Fasteris SA, Ginebra, Suiza). La mayoría de los productos de la PCR fueron secuenciados, sin embargo, para varios clonotypes TCR dominantes (n = 8 para HDs; n = 10 para los pacientes), cebadores únicos que corresponden a la
CDR3
segmento de gen fueron diseñados y utilizados para clonotyping PCRs como descrito anteriormente [15]. Todos los
ex vivo sola célula, 5-célula, y
in vitro
generados muestras de cDNA clon de células T de donantes sanos y pacientes con melanoma se procesaron en el mismo enfoque riguroso.
los análisis estadísticos
Tal como se indica en el texto, Kruskal-Wallis no paramétrico, ANOVA de una vía y de correlación de Spearman se realizaron con Prism 5.0 (la Jolla, California, EE.UU.) y
P
& lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. gráficos circulares co-expresión se compararon entre sí utilizando 10'000 permutaciones calculados con la especia Software 5.2 (NIH, Bethesda, EE.UU.).
Resultados
mejorado la diferenciación de células efectoras de las células T CD8 específicas de antígeno EBV siguiente transitoria linfo-agotamiento y la reconstitución inmune
Los ensayos recientes han demostrado que la inmunoterapia linfático inducida por el agotamiento quimioterapia no mieloablativo favorecía la expansión posterior de las células T adoptivamente transferidas por mecanismos homeostáticos ([31]; Figura 1A). Para perfeccionar esta estrategia, habíamos analizado previamente el impacto de tres regímenes de quimioterapia de acondicionamiento no mieloablativo en diferentes linfo-agotamiento y la reconstitución en pacientes con melanoma [24,25]. Los tres regímenes quimioterapéuticos inducidas significativa depleción transitoria de los linfocitos, seguido de la recuperación eficiente de los linfocitos totales [24,25] y células T CD8 (Figura 1B, panel izquierdo) cuenta a los niveles normales después de cuatro semanas de transferencia de células adoptivas (post-ACT).
A. Representación esquemática de la no-Hodgkin de la myeloablating tratamiento de ozono seguida de ACT de PBMCs de pacientes con melanoma. Las muestras de sangre se analizaron para todos los pacientes en la leucaféresis punto de tiempo (Leuka) antes de la quimioterapia TLD y post-ACT (punto de tiempo T1), que correspondía a día 32 (LAU paciente 1144), día 45 (LAU 1013), o día 60 (LAU 618, 936 LAU, y LAU 672). B. El panel izquierdo; el recuento total de células T CD8 de cinco pacientes con melanoma en Leuka y post-ACT. Panel derecho; fenotipo de las células totales T CD8 que muestran proporciones de disociados temprano (EM28
pos; CCR7
negCD45RA
negCD28
pos) y diferenciada tarde (que comprende de EM28
neg; CCR7
negCD45RA
negCD28
neg y ARME; CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) subconjuntos de cuatro donantes sanos (HDS) y de cinco pacientes de melanoma en Leuka y post-ACT. C. El panel izquierdo; el recuento total de células específicas de VEB T CD8 en la sangre periférica de cinco pacientes con melanoma en Leuka y los valores post-ACT. Panel derecho; fenotipo de las células T CD8 específicas de VEB muestran proporciones de disociados temprano (EM28
pos; CCR7
negCD45RA
negCD28
pos) y tardía diferenciado (que comprende de EM28
neg; CCR7
negCD45RA
negCD28
neg y ARME; CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) subconjuntos de cuatro donantes sanos y de cinco pacientes con melanoma en Leuka y post-ACT. D. niveles de anticuerpos EBV específicos medidos en muestras de plasma de cinco pacientes con melanoma en varios puntos de tiempo antes y después del tratamiento linfo-ozono. Día 0 en el eje x representa el día de ACT. Los resultados se representan como unidades arbitrarias en una escala del índice relativo. la evolución del nivel plasmático se muestra por separado para cada anticuerpo anti-EBV (anti-VCA IgM e IgG, anti-EBNA IgG y anti-EA IgG), y la barra gris representa el punto de corte entre el estado negativo y positivo para cada marcador.
a continuación, analizamos las células T CD8 específicos para el VEB proteína lítica BMFL1 de cinco pacientes con melanoma en estadio IV antes y después del dominio de nivel superior (Figura S1) y de cuatro donantes sanos. El porcentaje total de células T específicas de antígeno EBV antes y después del tratamiento se mantuvo sin cambios (Figura 1C, panel izquierdo;
P = 0,625
, Kruskal-Wallis). En comparación con los individuos sanos, las células BMFL1 específica T CD8 de pacientes con melanoma mostraron diferenciación de las células efectoras más avanzado de mayores porcentajes de EM28
neg (definida como CCR7
negCD45RA
negCD28
neg) y ARME ( definida como CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) subconjuntos ya antes del tratamiento (es decir, en el momento de leucoféresis) (Figura 1C, panel derecho). Estos subconjuntos aumentaron aún más y se volvieron dominantes post-ACT. En donantes sanos, tal diferenciación de células efectoras avanzado no se observa típicamente dentro de las células T CD8-EBV específica, que se asemeja más estrechamente a las respuestas de células T específicos de CMV [14,32]. En un grado más débil, la diferenciación avanzada célula efectora también se observó en el conjunto total de células T CD8 (Figura 1B, panel derecho), lo que sugiere que precede historias de la progresión del tumor y tratamientos recibidos, como la quimioterapia y la inmunoterapia, puede haber afectado la CD8 T compartimento celular.
Transient linfo-agotamiento no resulta en EBV reactivación
para examinar la capacidad de la respuesta de células T CD8 EBV antígeno específico para controlar la actividad viral durante situaciones de control inmune disminuida, a fin de determinar si la quimioterapia no mieloablativo podría haber dado lugar a la reactivación del VEB. los niveles de anticuerpos de plasma para antígeno de la cápside viral (VCA) IgG y IgM, antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA) IgG, y el antígeno temprano (EA) IgG se midieron antes y después de TLD y tratamientos de ACT (Figura 1D) [33]. Los anticuerpos específicos de VEB se mantuvieron estables durante varios meses después del tratamiento en todos los pacientes. Esto es consistente con una infección por VEB latente sin reactivación viral, aunque este último no puede ser completamente excluida. El ADN EBV número de copias por millón PBMCs estaba por debajo del nivel de detección por reacción PCR en tiempo real en muestras de sangre antes y después de TLD (datos no mostrados).
El ex vivo EBV antígeno específico repertorio de células T CD8 siguiente transitoria linfo-agotamiento revela la persistencia clonotipo pesar de las fluctuaciones de frecuencia
previamente desarrollado una estrategia de amplificación de cDNA a nivel mundial 5-célula adecuada para la directa
ex vivo
evaluación de TCR BV-CDR3beta (TRBV) uso del tramo de genes individuales [14,34]. Brevemente, las reservas de ADNc de células T CD8 específicos de epítopo EBV se generaron inicialmente y se utiliza como una pantalla para las familias TRBV recurrentes. Posteriormente, el predominio de cada familia TRBV se determinó mediante la prueba de cada muestra de 5 de una sola célula, que comprende la piscina para las familias TRBV positivos, y que representa el equivalente de 300 a 450 células T CD8 específicos del virus por individuo. Los segmentos de genes TRBV-CDR3-JB amplificados fueron secuenciados en última instancia, o PCR-clonotyped para identificar la única firma TCR de cada clonotipo de células T, como se describe en Materiales y Métodos. Con este enfoque, que inicialmente se comparó el repertorio TCR de clonotipo directamente
ex vivo
ordenadas 5-celular de las células T específicas de VEB con la de las células T individuales generadas por
in vitro
cultivos de dilución limitantes en . proporciones comparables de firmas clonotipo TCR individuo se encontraron cuando se utiliza el
ex vivo
clasificado 5-célula y el
in vitro enfoques
T clonación de células (Figura S2A), de acuerdo con estudios anteriores [14 , 15,28]. Por otra parte, se realiza de forma independiente
ex vivo
clasificación experimentos en células T específicas de antígeno de virus individuales, reveló frecuencias relativas similares de clonotypes de células T dominantes (Figura S2B). En conjunto, estos resultados indican que nuestro
ex vivo
enfoque directo permite la caracterización molecular de alta resolución del repertorio clonotipo
in vivo
subpoblaciones específicas de antígeno en bien definidos.
A continuación se determinó la persistencia de células T clonotypes EBV-BMFL1 específicos en individuos sanos con el tiempo. La mayoría de clonotypes estuvieron presentes en ambos puntos de tiempo tempranos y tardíos (Figura 2A). Por otra parte, una correlación mostró una asociación estadísticamente significativa entre las frecuencias de clonotypes detectados durante un período de 4 años (Figura 2B; Rho = 0,739,
P Hotel & lt; 0,001, correlación de Spearman). Pudimos observar la aparición de nuevas clonotypes lo largo del tiempo, sin embargo, estos clonotypes recientemente detectados eran de bajas frecuencias (
& lt; 5%) (Figura 2 B). En conjunto, estos resultados están en línea con los informados previamente por nuestro grupo [14] y otros [23], e indican que una vez establecido en adultos sanos, la composición clonal durante el herpes crónica virus de la infección se mantiene estable por lo menos durante varios años.
a y C. TRBV composición clonotipo de las células T CD8 específicas de VEB en PBMC de dos donantes sanos (a) en temprano (2002) y tardía (2006) puntos de tiempo, y en PBMCs de pacientes con melanoma (cuatro C) en Leuka punto de tiempo y después de la ACT. Cada clonotipo está representada por su familia TRBV específico y su número de código (clono). frecuencias clonotipo se calculan por la presencia de cada secuencia clonotypic entre las muestras 5 de células individuales (donantes sanos, n = 142; pacientes con melanoma, n = 344) ordenados directamente
ex
vivo
. Es de destacar que sólo las frecuencias ya sea de nuevo "el aumento" o "disminución" clonotypes se representan. B y D. La correlación de frecuencias clonotipo individuales obtenidos a partir de
ex
in vivo
ordenados muestras de células 5 (B) entre muestras de sangre a los primeros (2002) y tardía (2006) puntos de tiempo de dos donantes sanos y (D) entre Leuka y post-ACT de cinco pacientes de melanoma (correlación de Spearman). El recuadro muestra la correlación entre clonotypes TCR con frecuencias inferiores a 10% de donantes sanos y el 20% de los pacientes.
Se evaluó además la EBV antígeno específico repertorio TCR en cinco pacientes de melanoma para determinar el potencial de recuperación de clonotypes células T dominantes siguiente TLD y ACT (Figura 2C). De manera similar a los donantes sanos, el repertorio TCR general persistió después de TLD y actuar con la gran mayoría de clonotypes siendo detectable antes y después del tratamiento (Figura 2C). Excepto para los pacientes LAU 936, los clonotypes que, o bien han desaparecido o se presentaron fueron de baja frecuencia (& lt; 5%), lo que puede estar relacionado con la sensibilidad de la técnica más de la aparición real o desaparición de un clonotipo específica. No obstante, encontramos más marcadas fluctuaciones de las frecuencias de las clonotypes detectables en los pacientes en comparación con los donantes sanos, lo cual fue especialmente evidente para los clonotypes con frecuencias & lt; 20% (Figura 2D). En conjunto, nuestros datos muestran que la composición clonal de las células T CD8 específicas de VEB se mantuvo a nivel global en los pacientes con melanoma sometidos TLD y seguido de reconstitución inmune, a pesar de las fluctuaciones en las frecuencias dentro pacientes específicos y para clonotypes detectables en las frecuencias más bajas.
clonotypes de antígenos específicos de EBV que llevan secuencias TRBV públicas menudo se comparten entre los donantes sanos y pacientes con melanoma
Una similitud importante de las células T CD8 específicos de epítopo EBV entre los adultos sanos y pacientes fue el preferencial
in vivo
selección de clonotypes dominantes con cadenas TRBV pertenecientes a la
TRBV14
,
TRBV20
y
TRBV29
familias (Figura 2). También se identificaron al menos catorce secuencias TRBV públicas, con dos motivos CDR3 RDxTGNGY y VGxGGTNEKL, que fueron excesivamente representados y se comparte dentro de los individuos sanos y pacientes de melanoma (Figura 3A). clonotypes públicas se definen por la presencia de la misma secuencia TRBV-CDR3-BJ idéntica encontrado en por lo menos dos individuos no relacionados. De acuerdo con los informes anteriores [35], varios de los clonotypes TRBV públicas identificadas en el presente estudio fueron codificados por dos o tres diferentes variaciones de la secuencia de nucleótidos. Cuando se compararon las frecuencias de clonotypes TRBV públicos dentro de las respuestas de células T CD8 específicas de VEB en general, un tercio de ellos representado clonotypes dominantes (con frecuencias & gt; 5%) (Figura 3B). Entre el 35 al 48% de clonotypes de antígenos específicos de EBV se encontraron en las frecuencias bajas (entre 1 y 5%), mientras que alrededor del cuarto se encontraron sólo una vez en donantes sanos o pacientes. En conjunto, nuestros datos muestran evidencia de un alto nivel de similitud de las células T CD8 EBV BMFL1 específicas entre los pacientes con melanoma y de los individuos sanos, tal como se ilustra por (i) el intercambio de secuencias de TRBV público frecuentes y (ii) la persistencia de estas TRBV público clonotypes con el tiempo y después de TLD.
a. Compilación de las 14 secuencias TCR beta-aminoácidos de dominio público detectadas entre los tres individuos sanos y cinco pacientes con melanoma. Cada clonotipo de cadena beta de TCR se describe por el segmento TRBV, secuencia CDR3-beta, el segmento TRBJ, el número de secuencia de nucleótidos variantes identificadas para cada secuencia de aminoácidos, así como la proporción de donantes sanos y pacientes de los que se identificó cada secuencia. B. Distribución de secuencias públicas dentro de las células totales específicos de VEB T CD8 en donantes sanos y en pacientes en función de su frecuencia relativa; clonotypes dominantes (con frecuencia & gt; 5%) están representados en negro, bajo dominante (1-5%) en las secuencias de grises y únicas en blanco.
gen mejorada expresión polifuncionalidad por las células T CD8 específicas de antígeno EBV individuales después transitoria linfo-agotamiento y la reconstitución inmune
Para investigar más a fondo el efecto de TLD y ACT, que caracteriza la evolución de la respuesta de las células EBV-epítopo específico CD8 T en LAU paciente 1013 que se sometió a dos ciclos sucesivos de TLD y reconstitución inmune (Figura 4A), sin mostrar signos de EBV reactivación (Figura 1D). La frecuencia de los disociados finales EM28
células específicas de VEB-diferenciada principios de "memoria-como" EM28
pos y neg /ARME T CD8 fueron comparables entre los dos puntos de tiempo de leucoféresis (Leuka I y Leuka II) ( Figura 4B). De acuerdo con los datos que se muestran en la Figura 1, se observó una mayor diferenciación de células efectoras de las células T específicas de VEB antes de (en Leuka I) y siguiendo linfo-agotamiento (Leuka II), en comparación con las células T específicas del virus de donantes sanos .
A. Horario del régimen de tratamiento para el paciente LAU 1013, que recibió dos rondas de dominio de primer nivel (representado como cuadros grises). Las flechas grises indican leucoféresis (Leuka I y II Leuka) y la reinfusión de las PBMC, respectivamente. Las muestras de sangre fueron tomadas en el día 45 (post-Leuka I) y en el día 15/22 (post-Leuka II) después de la reinfusión. B. El fenotipo de las células T CD8 específicas BMFL1-EBV (panel izquierdo) y las células T CD8 totales (panel de la derecha) que muestra las proporciones de EM28
pos-diferenciada temprana (; CCR7
negCD45RA
negCD28
POS) y tardía diferenciado (que comprende de EM28
neg; CCR7
negCD45RA
negCD28
neg y ARME; CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) subconjuntos en PBMCs tomado de LAU paciente 1013 en puntos de tiempo Leuka I (n = 2) y Leuka II (3 n =). Las barras de error (media +/- SD) representan réplicas experimentales independientes. C. directa
ex
in vivo
expresión acumulada de memoria genes /homing-asociado (
CD62L /venta
,
CCR5
,
IL7R
,
CD27
y
Eomes
) y los genes relacionados efectoras (
PRF1
,
KLRD1 /CD94
,
IFNG
y
GZMB
). las células T CD8 individuales específicas de VEB fueron ordenados desde EM28-diferenciada temprana
pos y ARME diferenciadas tarde en Leuka I (n = 266) y Leuka II (n = 162) puntos de tiempo y se procesaron para la amplificación de cDNA mundial como se describe en Materiales y Métodos.
P-valores
fueron realizados por una sola vía ANOVA; ns: no significativo.