Extracto
proteínas morfogenéticas
óseas (BMP) son altamente conservados morfógenos que son esenciales para el desarrollo normal. BMP-2 es altamente expresado en la mayoría de los no pequeñas carcinomas de pulmón (NSCLC), pero no en el tejido pulmonar normal o tumores pulmonares benignas. Los efectos de la cascada de señalización de BMP en el crecimiento y supervivencia de las células cancerosas es poco conocido. Mostramos que la señalización de BMP es basalmente activo en líneas celulares de cáncer de pulmón, que puede ser inhibida eficazmente con antagonistas selectivos de los receptores de BMP tipo I. líneas celulares de cáncer de pulmón expresan Alk2, Alk3, y ALK6 y la inhibición de un único receptor de BMP no fue suficiente para disminuir la señalización. se requiere la inhibición de más de un receptor de tipo I para disminuir la señalización de BMP en líneas celulares de cáncer de pulmón. antagonistas de los receptores BMP y el silenciamiento de tipo BMP receptores I con siRNA muerte celular inducida, inhibe el crecimiento celular, y causó una disminución significativa en la expresión de inhibidor de la diferenciación (Id1, Id2, e ID3) miembros de la familia, que se sabe que regulan el crecimiento celular y la supervivencia en muchos tipos de cánceres. antagonistas de los receptores BMP también disminuyeron el crecimiento de células clonogénicas. Desmontables de Id3 disminuyó significativamente el crecimiento celular y la muerte celular inducida de células de cáncer de pulmón. células H1299 que sobreexpresan de forma estable Id3 fueron resistentes a la supresión del crecimiento y la inducción de la muerte celular inducida por el antagonista de BMP DMH2. Estos estudios sugieren que la señalización de BMP promueve el crecimiento celular y la supervivencia de las células del cáncer de pulmón, que es mediada a través de su regulación de los miembros de la familia de identificación. Los antagonistas selectivos de los receptores del tipo BMP I representa un medio potencial para tratar farmacológicamente NSCLC y otros carcinomas con una cascada de señalización BMP activado
Visto:. Langenfeld E, Hong CC, LandTek G, J Langenfeld (2013) morfogenética ósea Tipo I antagonistas del receptor de la proteína Reducir el crecimiento y el inducir la muerte celular de las líneas celulares de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (4): e61256. doi: 10.1371 /journal.pone.0061256
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de enero de 2012; Aceptado: 11 de marzo de 2013; Publicado: 12 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Langenfeld et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores tienen el siguiente interés. Las pequeñas moléculas utilizadas en el experimento representan fármacos potenciales para el tratamiento de pacientes con cáncer. Una solicitud de patente provisoria se ha presentado en el uso potencial de estas moléculas en el cáncer. No hay otras patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El hueso proteínas morfogenéticas (BMP) son miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante (TGF). BMP son phytogenetically proteínas conservadas necesarias para el desarrollo embrionario de los insectos a los seres humanos. Aproximadamente 20 ligandos BMP se han identificado y clasificado en varias subclases. BMP-2 y BMP-4 cuota de 92% de homología y tienen actividad biológica intercambiables. Las BMP son proteínas que señalan a través de transmembrana serina secretada /treonina quinasas denominadas tipo I y tipo II receptores [1]. El tipo I receptores son alk1, Alk2 (ActR-1), Alk3 (BMPR-IA), y ALK6 (BMPR-IB) [1]. Los receptores de tipo II son BMPR-II y activina de tipo II receptores ActR-II y ACR-IIB [1]. receptores de BMP son promiscuos, y pueden ser activados por varios ligandos BMP [1], [2]. Cada ligando BMP también es capaz de activar receptores diferentes [1], [2]. La unión de la BMP ligandos al receptor de tipo I conduce a la fosforilación por el receptor constitutivamente activa de tipo II. El complejo receptor fosforila Smad-1/5, que entonces activa la transcripción de los genes diana [3].
Durante el desarrollo embrionario, BMPs regula las decisiones del destino celular, la supervivencia celular, y la vasculogénesis [4], [5 ], [6], [7], los procesos que también son comunes en la carcinogénesis. De hecho, BMP-2 se sobre-expresa en el 98% de NSCLC y otros carcinomas [8], [9]. expresión BMP se correlaciona inversamente con la supervivencia [10] y de alta expresión se asocia con la diseminación metastásica [11], [12]. BMP-2 mejora la angiogénesis del tumor [13], [14], [15] y estimula la invasión tumoral [8]. La expresión ectópica de BMP-2 en células de cáncer de pulmón A549 mucho mayor crecimiento metastásico en un modelo murino de cáncer de pulmón después de la inyección en la vena caudal [16]. Los estudios que utilizan proteínas BMP recombinantes o desmontables de un solo receptor BMP han sugerido que la BMP de señalización en células de cáncer no promueve el crecimiento celular e incluso puede actuar como un supresor de tumor (16-19). Los efectos de la inhibición de múltiples receptores de BMP en el crecimiento celular y la supervivencia en células de cáncer no se ha examinado. Por lo tanto, la importancia biológica de una cascada de señalización BMP basalmente activo en células de cáncer no se conoce.
Durante el desarrollo de los inhibidores de la /diferenciación (Id) de unión a ADN son mediadores directos de la señalización de BMP. Hay 4 miembros de la familia de identificación (ID1 ID2 ID3, y Id4). elementos de respuesta a BMP (BRE) en los promotores Id1, ID2 e ID3 son activados por Smad 1/5/8 (20-23). Los ID de proteínas inhiben el compromiso de linaje mediante la unión y secuestro de los factores básicos HLH de transcripción [17]. miembros de la familia Id han sido implicados en la transformación oncogénica en varios tipos de cáncer [18] [19], [20]. Id1 se ha informado para regular la invasión, la proliferación, la supervivencia y la propagación metastásica de las células del cáncer [18], [21], [22]. miembros de la familia id se expresan con frecuencia en no pequeñas carcinomas de pulmón de células [23], [24] y sobre-expresión se asocia con una enfermedad más corta supervivencia libre [25]. Estos estudios sugieren que la orientación vías de señalización que regulan la expresión de los miembros de la familia Id pueden tener importantes implicaciones terapéuticas. Aunque las proteínas recombinantes BMP2 inducen un aumento transitorio de la expresión de Id1 en el cáncer de pulmón de células [8], el papel de la cascada de señalización BMP en la regulación de los niveles basales de expresión de los miembros de la familia de ID en las células de cáncer no se ha dilucidado.
El objetivo de este estudio fue determinar en líneas celulares de cáncer de pulmón, que no han sido estimuladas con una proteína BMP recombinante, si las células tienen una señalización de BMP basalmente activo y determinar su efecto sobre el crecimiento celular, la supervivencia, y la expresión de Id miembros de la familia. Selectiva BMP tipo I receptor antagonistas y siRNA dirigidos a la BMP tipo I receptores revela que basalmente activa la señalización de BMP en líneas celulares de cáncer de pulmón es el crecimiento y la promoción de un importante regulador de la expresión de los miembros de la familia de identificación. la señalización de BMP está mediada a través de más de un receptor tipo I de BMP. DMH2 causó la mayor inhibición de la señalización de BMP e indujo la mayor reducción del crecimiento celular y la expresión de los miembros de la familia Id.
Resultados
BMP tipo I antagonistas del receptor Disminuir Smad 1/5/8 señalización
el uso de un indicador de luciferasa BMP-sensible (BRE-Luc), se examinaron los efectos de los diferentes antagonistas de los receptores de tipo BMP en Smad 1/5/8 actividad en las células H1299. Dorsomorphin, DMH1, DMH2, y LDN todo causó una disminución significativa en la expresión del reportero BRE-Luc en células H1299, lo que indica una disminución en la actividad Smad 1/5/8 (figura 1A). El análisis por inmunotransferencia reveló que selectivo BMP tipo I receptor antagonistas disminuyen la fosforilación de Smad 1/5/8 en H1299 y A549 (Figura 1B y la figura S1). La fosforilación de Smad 1/5/8 se redujo el plazo de 24 horas de tratamiento y persistió durante al menos 48 horas a partir de entonces.
H1299 células (A) fueron transfectadas con el reportero de luciferasa-BRE. Después de 48 horas las células fueron tratadas con DMSO, 10 mM Dorsomorphin, o 1 M DMH1, 1 M DMH2, o 1 M LDN durante 48 horas. actividad BRE-luciferasa se expresa como el porcentaje de las células de control DMSO tratados. Los datos representan la media de 3 experimentos por triplicado. La media de las células de control se comparó con la media de las células tratadas. * P & lt; 0,05. (B) El análisis por inmunotransferencia para fosforilados Smad 1/5/8 de H1299 células tratadas con 1 mM de DMSO, DMH1, o DMH2 para el 12, 24 y 48 horas.
BMP tipo I Disminución Antagonistas de los receptores Id expresión de miembros de la familia
RT-PCR cuantitativa se utilizó para determinar si la cascada de señalización de BMP regula la expresión de miembros de la familia de ID en líneas celulares de cáncer de pulmón. Dorsomorphin, DMH1, y DMH2 disminuyó significativamente la expresión de Id1, ID2, ID3 y en A549 y líneas celulares H1299 (Figura 2A-B). Los antagonistas de BMP causaron una mayor reducción de miembros de la familia de ID en las células H1299 comparación con las células A549. Por análisis de transferencia de Western, Dorsomorphin, DMH1, DMH2, y LDN causó una disminución en los niveles de proteína de Id1 y ID3 en A549 y células H1299 (Figura 2C-D y la figura S2). Los antagonistas de BMP disminuyó la expresión de los miembros de la familia de identificación dentro de 12 a 24 horas que persistieron durante al menos 48 horas. DMH1 y DMH2 causaron una mayor reducción de Id1 en células H1299 comparación con las células A549. DMH2 causada consistentemente una mayor reducción de la expresión de la proteína Id1 que DMH1.
(A-B) RT-PCR cuantitativa para Id1, Id2 y Id3 en A549 (A) y (B) H1299 células tratadas con DMSO, 10 M Dorsomorphin, 1 M DMH1, o 1 M DMH2 durante 48 horas. Los datos representan la media de al menos 3 experimentos realizados por duplicado y se presentan como el porcentaje de las células tratadas de control. La media de las células de control se comparó con la media de las células tratadas. * P & lt; 0,05. (C-D) Western blot para Id1 e ID3 en A549 (C) y (D) H1299 células tratadas con DMSO 1 M o 1 M de tipo selectivo BMP I receptor antagonista para el 12, 24, y 48 horas. Estos estudios se realizaron al menos 3 veces.
múltiple BMP tipo I receptores median la señalización
A continuación, se evaluó si un receptor específico de tipo I BMP media la señalización de BMP, basales activo en el cáncer de pulmón líneas celulares. Por RT-PCR cuantitativa, se examinó la expresión de BMP tipo I receptores. Alk1 no se expresó en células H1299 (Figura 3A) o A549. Como era de esperar, ALK1 se expresó en células endoteliales humanas (datos no mostrados). mRNA Alk2, ALK3, y ALK6 se expresan en A549 y líneas celulares H1299 (Figura 3A). El uso de siRNA, la expresión de cada receptor de tipo I se redujo en aproximadamente 40% o mayor (Figura 3B). Para probar la especificidad de la siRNA, desmontables de cada receptor de tipo I se realizó RT-PCR y realiza para Alk2, Alk3, y ALK6. Desmontables de Alk2 causó un aumento significativo en la expresión de ALK6 (figura 3C). Desmontables de Alk3 y ALK6 causó una pequeña disminución en la expresión de los otros receptores de tipo I (Figura 3C). RT-PCR cuantitativa mostró que el silenciamiento de Alk2 o Alk3 en las células H1299 provocó una disminución de aproximadamente 20 a 25% en la expresión de Id1 mRNA (Figura 3D), mientras que el silenciamiento de ALK6 tendió a causar un aumento en la expresión de Id1. Silenciando tanto Alk2 y Alk3 causó una reducción significativamente mayor en la expresión de Id1 que desmontables de cualquier receptor sola (Figura 3D). El análisis de transferencia Western mostró que desmontables de un único receptor de tipo IA solo no disminuyó la expresión de Id1 (figura 3E). El silenciamiento de ambos Alk2 y Alk3 o el silenciamiento de Alk2, Alk3, y ALK6 causó una disminución en la expresión de la proteína Id1 (figura 3E). RT-PCR cuantitativa demostró que desmontables de múltiples receptores condujo una disminución en todos los receptores de BMP de tipo, que fue mayor que la observada para caídas de receptores individuales (Figura 3F).
(A) RT-PCR cuantitativa de la A549 y H1299 células que muestran expresión de Alk2, Alk3, y ALK6 pero no ALK1 (n = 3). (B) células H1299 se transfectaron con siRNA dirigidos a cada tipo I receptor BMP y cuantitativa de RT-PCR se realizó para que el receptor de BMP. (C) Derribo de cada tipo BMP I receptor en las células H1299 y se realizó RT-PCR cuantitativa a cabo durante los 3 receptores de tipo I. (B-C) Los datos representan la media de 2 experimentos realizados por duplicado. (D) caída en células H1299 de un solo tipo BMP I receptor o ambos Alk2 y Alk3. Después de 48 horas la expresión de Id1 se examinó por RT-PCR cuantitativa. Los datos representan la media de 3 experimentos realizados por duplicado. (E) Análisis de transferencia Western para Id1 en células H1299 con desmontables de un solo tipo de receptor I BMP o combinación desmontables de Alk2 y Alk3, o todos 3 Tipo de BMP I receptores. Los estudios se realizaron al menos 2 veces. Los estudios muestran silenciar para requerir más de un receptor para disminuir la expresión Id1. (F) RT-PCR cuantitativa del tipo I BMP receptores después de desmontables de Alk2 y Alk3, o todos 3 Tipo de BMP I receptores. Los estudios realizados 3 veces por duplicado informaron como porcentaje de control. (G) H1299 células fueron co-transfectadas con el vector sin inserto, ALK3 constitutivamente activa (CA-Alk3), o ALK6 constitutivamente activa vectores de expresión (CA-ALK6) y el reportero BRE-luciferasa. Las células se trataron después con DMSO 1 M o 1 M antagonista del receptor de BMP durante 24 horas y la actividad de luciferasa medida. Los datos demuestran la media de al menos 3 experimentos independientes se muestran como el porcentaje de control.
Se utilizó un segundo conjunto de siRNA dirigidos a cada receptor BMP tipo I para evaluar mejor la señalización de BMP. Estos siRNA también causó una disminución significativa en la expresión del receptor de objetivo en el A549 y células H1299 (figura S3). El examen de la especificidad de estos ARNsi también demostró que desmontables de un solo receptor causó una cierta regulación a la baja de la otra receptores de tipo I BMP (figura S3). Estos datos sugieren que existe una regulación cruzada entre los diferentes receptores de tipo I BMP. Una vez más, desmontables de un solo tipo I del receptor de BMP no fue suficiente para disminuir la expresión de Id1, ya sea en la A549 y las células H1299 (figura S3). Para examinar adicionalmente la señalización del receptor de BMP, cada receptor fue silenciado y Smad 1/5/8 actividad determina utilizando el ensayo BRE-luciferasa. Silenciamiento de un único receptor de BMP de tipo I no provocó una disminución de Smad-1 /5/8 actividad (figura S3). Por QRT-PCR, desmontables de los 3 receptores de tipo I BMP en las células A549 causó una reducción significativa en la expresión de Id1 (figura S3). La caída de todo tipo I (BMP receptores Alk2, Alk3, y ALK6) se confirmó mediante QRT-PCR (Figura S3). El análisis de transferencia Western mostró de nuevo que desmontables de un único receptor en las células H1299 no era suficiente para disminuir la expresión de Id1 (figura S3). En consonancia con nuestro otro conjunto de siRNA, desmontables de Alk2 + Alk3 o Alk2, Alk3, y ALK6 causó una reducción en la expresión de proteínas de Id1 (figura S3). Estos datos apoyan que la señalización de BMP es mediada a través de más de un receptor de BMP tipo I en líneas celulares de cáncer de pulmón.
En la línea celular de mioblastos de ratón C2C12, DMH1 inhibida se informó Alk2 y la actividad Alk3 pero que tienen efectos inhibitorios insignificantes en ALK6 [26]. DMH2 es conocida para inhibir Alk2 y LDN inhibe eficazmente Alk2, Alk3, y ALK6 [26]. Para probar la selectividad de receptor de DMH1, DMH2, y LDN en células de cáncer de pulmón, Alk3 constitutivamente activa (ca-Alk3) o ALK6 (ca-ALK6) se co-transfectadas con el reportero BRE-luciferasa en células H1299 (Figura 3G). DMH2 causó una mayor reducción de la actividad de Alk3 DMH1 y LDN en las células H1299. Los antagonistas de BMP causados alguna inhibición de ALK6 pero menos que la observada para Alk3 (figura 3G).
Inhibición de BMP tipo I receptores disminuye el crecimiento celular
A continuación, los efectos de bloqueo de tipo I BMP receptores sobre el crecimiento celular se examinó mediante la realización de recuentos de células. BMP tipo I del receptor de los antagonistas causó una reducción significativa en el número de células después de 7 días, tanto en el A549 y líneas celulares H1299 (Figura 4A). Los antagonistas de los receptores BMP selectivos causaron una mayor reducción en el crecimiento celular en las células H1299 comparación con las células A549. DMH2 causó significativamente más la inhibición del crecimiento de DMH1 en ambas líneas celulares (Figura 4A). Para eliminar posibles ligandos BMP en el medio de cultivo celular, las células H1299 se cultivaron en medio libre de suero y se trataron con DMH2. DMH2 también causó una inhibición significativa del crecimiento celular de H1299 células cultivadas en medio libre de suero (SFM) (figura 4B), lo que sugiere que BMP mayo de señalización se produce de una manera auto-autónoma. La proliferación se examinó mediante la determinación de bromodesoxiuridina incorporación (BrdU). DMH2 causó una disminución dependiente de la dosis en la proliferación de las células H1299 en 24 horas (Figura 4C) y un efecto más profundo se observó a las 48 horas (Figura 4C). Desmontables de los 3 receptores de tipo I BMP (Alk2, Alk3, y ALK6) en las células H1299 también causó una disminución significativa en la incorporación de BrdU (Figura 4D). Desmontables de Alk2, Alk3, y ALK6 utilizando el segundo conjunto de siRNA también causó una reducción significativa de la proliferación en las células H1299 (Figura S3). RT-PCR cuantitativa mostró que con este segundo conjunto de siRNA dirigidos a todos los receptores BMP I 3 tipo en las células H1299 causó regulación a la baja de Alk2 y ALK6 pero no Alk3 (figura S3). Esto sugiere que la inhibición de Alk2 y ALK6 es suficiente para disminuir la señalización de BMP en células H1299.
(A) A549 y H1299 células cultivadas en DMEM FCS al 5% se trataron con DMSO, 10 mM Dorsomorphin, 1 M DMH1, 1 M DMH2, o 1 M LDN durante 7 días y se realizaron recuentos de células. (B) H1299 células cultivadas en SFM se trataron con DMSO 1 M o 1 M DMH2 durante 7 días y los recuentos de células realizado. incorporación (C) BrdU de células H1299 tratadas con DMSO o 1 M o 5 M DMH2 durante 24 y 48 horas. incorporación (D) BrdU de células H1299 transfectadas con siRNA dirigidos a todo tipo I receptores BMP o control de siRNA. (C-D) Los datos son la media de 3 experimentos por triplicado reportados como el porcentaje de células tratadas de control. (E-G) el crecimiento de colonias de A549 y H1299 células tratadas con DMSO 1 M o 1 M de antagonista selectivo del receptor de BMP. (E) La fotografía de un experimento representativo. (F-G) Los datos muestran la media de al menos 3 experimentos independientes reportados como el porcentaje de control. (G) DMH1 disminuye anclaje independiente crecimiento de líneas celulares de cáncer de pulmón. células A549 y H1299 en agar blando se trataron con DMS0 1 M o 1 M DMH1 durante 2 semanas y el número de colonias contadas. Los datos mostrados son la media de 3 experimentos independientes reportados como el porcentaje de control.
BMP tipo I antagonistas del receptor de disminuir el crecimiento clonogénico
El efecto de los antagonistas de los receptores BMP sobre el crecimiento celular clonogénico fue examinado. DMH1, DMH2, y LDN todo causó una reducción significativa del crecimiento clonogénico tanto en el A549 y líneas celulares H1299 (figura 4E-G). clonigénicas crecimiento fue inhibido por más DMH2 y LDN que DMH1 (figura 4E-G). A fin de evaluar los efectos de DMH1 sobre el crecimiento clonogénico, se examinó el crecimiento de anclaje independiente. DMH1 redujo significativamente el crecimiento de anclaje independiente, tanto en las células H1299 (Figura 4H) y A549. Estos datos muestran que la señalización de BMP basalmente activo estimula la proliferación y aumenta el crecimiento clonogénico de células de cáncer de pulmón.
Inhibición de BMP tipo I receptores induce la muerte celular
El efecto de la señalización de BMP en la supervivencia celular se examinó . La muerte celular se cuantificó usando un ensayo de absorción de bromuro de etidio. El bromuro de etidio sólo es captado por las células que han perdido la integridad de membrana, que se produce cuando las células están muriendo por necrosis o apoptosis [27]. Bmh2 indujo la muerte celular en las células H1299 dentro de las 12 horas, y por 48 horas todos los antagonistas causó un aumento significativo en el porcentaje de células muertas (Figura 5A). Dentro de las 48 horas, Dorsomorphin, DMH1, y DMH2 causó un aumento significativo en la muerte celular en las células A549 (Figura 5B). A fin de evaluar la muerte celular, las células H1299 cultivaron en DMEM 5% FCS se trataron con DMH2 durante 4 días y el porcentaje de células muertas determinado por tinción con azul de tripano. DMH2 causó un aumento significativo en la muerte celular, que era dependiente de la dosis (Figura 5C). El porcentaje de células muertas fue aún mayor en H1299 células cultivadas en SFM (figura 5D). Un colorante fluorescente amina reactiva se utilizó para detectar la muerte celular, que también mostró que DMH2 indujo la muerte celular en las células H1299 (Figura 5E). A fin de verificar que los antagonistas de BMP inducen la muerte celular mediante la inhibición de la señalización de BMP, triples desmontables de Alk2, Alk3, y los receptores ALK6 se realizó. Desmontables de Alk2, Alk3, y los receptores de ALK6 causó un aumento significativo en el porcentaje de células muertas en comparación con las células tratadas con ARNsi de control (figura 5F). Un segundo conjunto de siRNA dirigidos Alk2, Alk3, y ALK6 también causó un aumento significativo en el porcentaje de células muertas (Figura S3). Estos estudios muestran que antagonizar la actividad de la BMP tipo I receptores induce la muerte celular en células de cáncer de pulmón.
(A-B) H1299 y A549 cultivadas en DMEM 5% FCS se trataron con DMSO o un antagonista del receptor de BMP (10 M Dorsomorphin o 1 M de antagonista selectivo). A continuación se determinó el porcentaje de células que ocupan bromuro de etidio. Los datos se indica como la media de al menos 3 experimentos independientes. (C) H1299 células cultivadas en DMEM 5% FCS se trataron con DMSO, 1 M y M μ5 de DMH2 durante 7 días, se tiñeron con azul Typan, y los recuentos de células a cabo. Los datos representan la media de 4 experimentos reportados como las células muertas por ciento. (D) H1299 células cultivadas en SFM se trataron con DMSO o 1 M de DMH2 durante 7 días, teñidas con azul Typan, y los recuentos de células a cabo. Los datos representan la media de 5 experimentos reportados como el porcentaje de células muertas. (E) La muerte celular se determinó usando citometría de flujo de detección de absorción de un colorante fluorescente reactivo con amina en células H1299 tratadas con DMS0 o DMH2 durante 4 días. Los datos representan la media de 3 experimentos independientes. células (F) El H1299 fueron transfectadas con siRNA control y la orientación ARNsi Alk2, Alk3, y ALK6. Después de 2 días se determinó el porcentaje de células con tinción de bromuro de etidio. Los datos se reporta como la media de 6 experimentos independientes.
BMP señalización está regulada en un auto-autónoma Manner
La inducción de la muerte celular y la supresión del crecimiento inducida por antagonistas de los receptores BMP de cáncer de pulmón líneas celulares que crecen en SFM sugirieron que la señalización de BMP se produce de una manera auto-autónoma. Estudios anteriores han demostrado que las líneas celulares de cáncer de pulmón producen la proteína BMP2 maduro, que es la forma activa [8]. Para asegurarse de que las células de cáncer de pulmón secretan BMP2, se realizó un ELISA de los medios de cultivo celular. proteína BMP2 no se detectó en DMEM con 5% de ternera fetal (FCS) o en medio sin suero (SFM) (figura 6A). BMP2 se detectó en el medio cuando las líneas celulares de cáncer de pulmón fueron cultivadas en cualquiera de SFM o DMEM con 5% de FCS (figura 6A). Desde otro BMPs podría estar en FCS, los efectos de antagonistas de los receptores de BMP en la regulación de la señalización BMP se examinó en SFM. Fosforilados Smad 1/5 y expresión Id1 se detectó en las células H1299 cultivadas en medio libre de suero (figura 6B). BMP tipo I del receptor de los antagonistas disminuyeron pSmad 1/5 y Id1 expresión de H1299 células cultivadas en SFM (figura 6B).
(A) A BMP2 ELISA se realizó en el DMEM 5% de FCS y SFM en ausencia de células (medio). A BMP2 ELISA se realizó en el DMEM 5% de FCS y medio de cultivo celular que contiene SFM A549 y células H1299 durante 48 horas. Los experimentos representan la media de al menos 5 experimentos realizados por triplicado. antagonistas (B) disminuyen BMP BMP de señalización de las células del cáncer de pulmón cultivadas en SFM. células H1299 cultivadas en SFM fueron tratados con 1 mM DMSO, 1 M de DMH2 o 1 M de LDN durante 48 horas y análisis de transferencia Western realizado. (C) RT-PCR cuantitativa para la expresión BMP2 48 horas después de la transfección de las células H1299 con el control de siRNA o siRNA dirigidos BMP2. Los datos representan el porcentaje de control de la media de 4 experimentos independientes. (D) Western blot de células H1299 en SFM 48 horas después de haber sido transfectadas con siRNA control o siRNA dirigidos BMP2. knockdown BMP2 causa una disminución en la expresión de pSmad 1/5 y Id1. (E) Derribo de BMP2 induce la muerte celular. células H1299 en SFM fueron transfectadas con siRNA control o siRNA dirigidos BMP2. Después de 48 horas el porcentaje de células muertas se determinó mediante tinción con bromuro de etidio. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes realizados por triplicado.
A fin de examinar la señalización auto-autónoma de la cascada de señalización de BMP, la expresión de BMP-2 fue derribado mediante siRNA. RT-PCR cuantitativa mostró que el siRNA dirigidos BMP2 causó una reducción mayor que 60% en la expresión de BMP2 (figura 6C). Desmontables de BMP2 de H1299 células cultivadas en SFM causó una disminución en la expresión de proteínas de fosforilados Smad 1/5 y Id1 (figura 6D). BMP2 caída causó un aumento significativo en el porcentaje de células de cáncer de pulmón muertos que crecen en SFM (figura 6E). Estos estudios sugieren que la actividad de BMP basal de líneas celulares de cáncer de pulmón se estimula de manera auto-autónoma, que puede ser inhibida por antagonizar los receptores del tipo BMP I.
Desmontables de Id1 e ID3 disminuye el crecimiento celular y la célula induce muerte
a continuación, se examinó si Id1 y /o Id3 regula la supervivencia celular y el crecimiento de células de cáncer de pulmón. Desmontables de Id1 usando siRNA causó una reducción en el nivel de proteínas de Id1 pero no Id3 (figura 7A). Desmontables de Id3 causó una reducción de los niveles de proteína id3 sin efectuar la expresión de Id1 (figura 7A). RT-PCR cuantitativa también mostró una reducción en Id1 e ID3 respectivamente (Figura 7B). Desmontables de Id1 o ID3 en células H1299 causó un aumento significativo en el porcentaje de células muertas según se determina por tinción con bromuro de etidio (Figura 7C). Los recuentos de células utilizando tinción de azul de tripano mostraron que desmontables de Id1 disminución del crecimiento celular y la muerte celular inducida, pero no alcanzó significación estadística (figura 7D, F). Desmontables de Id3 causó una muerte muy significativo en el crecimiento celular y la inducción de la muerte celular en comparación con los controles (figura 7d, F). Estos estudios sugieren que la reducción de la expresión de Id es al menos en parte el mecanismo por el que los antagonistas del receptor de BMP inducen la muerte celular y disminuyen el crecimiento celular. En las células H1299, Id3 puede tener un papel más importante en la regulación de la señalización de BMP que Id1.
(A) Western blot para Id1 e ID3 48 horas después H1299 células fueron transfectadas con siRNA control y siRNA dirigidos Id1 o ID3. (B) RT-PCR cuantitativa para Id1 e ID3 después H1299 células fueron transfectadas con siRNA control y siRNA dirigidos Id1 o ID3. Los datos representan el porcentaje de control de la media de 2 experimentos. H1299 células (C) fueron transfectadas con siRNA control o siRNA dirigidos Id1 o ID3. Después de 48 horas se determinó el porcentaje de células con tinción de bromuro de etidio. Los datos se indica como la media de 4 experimentos independientes. células (D-F) H1299 fueron transfectadas con siRNA control y siRNA dirigidos Id1 o ID3. Después de 7 días, las células se tiñeron con azul de tripano y se determinó el número de células vivas y muertas. Los datos representan el porcentaje de cambio desde el control de siRNA de (D) vivo o (F) las células muertas. (E) representa el porcentaje de células que estaban muertos. Los datos representan la media de 4 experimentos independientes.
células que sobreexpresan Id3 son resistentes a DMH2
Para definir aún más si Id1 e ID3 median en la señalización de BMP, Id1 e ID3 vectores de expresión fueron establemente transfectadas en células H1299. La expresión forzada de Id1 causó un aumento en la expresión de proteínas de Id1 pero no Id3 (figura 8A). La expresión forzada de Id3 provocó un aumento de la expresión Id3 pero no Id1 (figura 8B). Había un pequeño aumento en la expresión de actina en las células H1299 /ID3. Desde actina podría ser de hasta regulada por la sobreexpresión Id3, se examinó la expresión de GAPDH. Por análisis de transferencia de Western demostró que la expresión de GAPDH fue la misma entre las células de control de vector y las células H1299 /ID3. DMH2 causó una reducción similar en el crecimiento celular de las células H1299 /Id1 en comparación con las células de control de vector (Figura 8C). DMH2 no causó la inhibición del crecimiento (figura 8C) o inducir la muerte celular (Figura 8D) de las células H1299 /ID3. Estos datos apoyan aún más que los efectos biológicos mediados por los antagonistas de los receptores BMP implica ID de proteínas.
H1299 células fueron transfectadas establemente con vectores de expresión de Id1 e ID3 o el vector sin inserto. (A-B) Análisis de transferencia Western que muestra el aumento de expresión de (A) Id1 o (B) Id3 en la línea celular transfectada. (C-D) H1299 /células Id1 y H1299 /id3 fueron tratados con 1 mM DMSO o 1 M DMH2 durante 7 días y el porcentaje vivo y las células muertas determinados. (C) DMH2 causó la supresión del crecimiento de control de vectores y células H1299 /Id1 pero no las células H1299 /ID3. muerte (D) DMH2 celular inducida en las células de control de vector (H /con) pero no en las células H1299 /ID3 (H /Id3). Los datos representan la media de al menos 3 experimentos reportados como el porcentaje de las células tratadas de control. (E) DMH2 decesos crecimiento celular de células inmortalizadas normales humanos epiteliales bronquiales (HBEC), pero no las células endoteliales aórticas humanas (HAEC). Las líneas celulares que crecen en SFM fueron tratados con DMSO 1 M o 1 M durante DMH2 de 7 días y los recuentos de células realizados. Los datos representan la media de al menos 3 experimentos reportados como el porcentaje de las células tratadas de control. (F) Análisis de transferencia Western que muestra la expresión más alta de pSmad 1/5 y Id1 en comparación con HBEC EAEH. 1 M de DMH2 durante 48 horas disminución de la expresión de pSmad 1/5 y ID1 en HBEC pero no EAEH.
DMH2 suprime el crecimiento de las células normales epiteliales bronquiales, pero no las células endoteliales
La BMP2 cascada de señalización es esencial para el desarrollo del pulmón temprano con alta expresión en células progenitoras epiteliales y vasculares [28]. A la finalización de la morfogénesis pulmonar BMP descensos de señalización con la expresión apenas detectable en el tejido pulmonar normal adulto [9], [28], [29]. la señalización de BMP se vuelve a activar en las células epiteliales bronquiales adultos normales por la inflamación y lesión de tejidos [28], [29]. Para definir aún más la especificidad de los antagonistas del receptor de BMP, se examinó si las células normales humanas bronquiales epiteliales (HBEC) inmortalizadas sin oncoproteínas virales [30] y las células aórticas endoteliales humanas normales (HAEC) son sensibles a DMH2. Como era de esperar DMH2 causó una reducción significativa en el crecimiento de células H1299 (57%) y una reducción similar en HBEC (42%) (figura 8E). DMH2 sólo causó una reducción del 15% en el crecimiento celular de EAEH (figura 8E). HBEC tenía un mayor nivel de expresión de pSmad 1/5 y Id1 que EAEH (figura 8F). DMH2 causó una reducción en la expresión de pSmad 1/5 y Id1 en HBEC pero no en el HAEC. antagonistas de BMP también disminución de la expresión Id1 y la inhibición del crecimiento inducida de las células epiteliales bronquiales humanas normales inmortalizadas con SV40 del gen del antígeno T grande (células BEAS-2B) [31] (Figura S4 y los datos no muestran).