Extracto
Antecedentes
Xenotropic murino retrovirus relacionados con la leucemia (XMRV) es un retrovirus descubierto recientemente que ha sido relacionado con el cáncer de próstata humana y el síndrome de fatiga crónica (SFC). Ambas enfermedades afectan a una gran parte de la población mundial, con el cáncer de próstata afecta a uno de cada seis hombres, y el síndrome de fatiga crónica que afecta a un estimado de 0,4 a 1% de la población.
Principales conclusiones
El cuarenta y cinco compuestos, incluyendo veintiocho medicamentos aprobados para su uso en seres humanos, se evaluaron contra la replicación del XMRV
in vitro
. Se encontró que el inhibidor de la integrasa retroviral, raltegravir, era potente y selectivo contra XMRV en concentraciones submicromolares, en las células LNCaP MCF-7 y, una línea celular de cáncer de cáncer de mama y de próstata, respectivamente. Otro inhibidor de la integrasa, L-000870812, y dos inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos, zidovudina (ZDV) y tenofovir disoproxil fumarato (TDF) también inhiben la replicación del XMRV. Cuando se combinan, estos fármacos muestran efectos sinérgicos en su mayoría contra este virus, lo que sugiere que la terapia de combinación puede retrasar o prevenir la selección de virus resistentes.
Conclusiones
Si XMRV resulta ser un factor causal en la próstata cáncer o síndrome de fatiga crónica, estos descubrimientos pueden permitir el diseño racional de los ensayos clínicos
Visto:. Singh IR, Gorzynski JE, Drobysheva D, L Bassit, Schinazi RF (2010) Raltegravir es un inhibidor potente del XMRV, un virus implicado en el cáncer de próstata y el síndrome de fatiga crónica. PLoS ONE 5 (4): e9948. doi: 10.1371 /journal.pone.0009948
Editor: Peter Sommer, Instituto Pasteur Corea, República de Corea
Recibido: 18 de febrero, 2010; Aceptado: 11 de marzo de 2010; Publicado: 1 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Singh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por el NIH subvención 2P30-IA-50409 (CFAR a RFS), y por el Departamento de Asuntos de Veteranos (RFS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. RFS es un fundador y principal accionista de RFS Pharma, LLC que se está desarrollando clínicamente Amdoxovir y él recibe regalías de las ventas de 3TC. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Xenotropic murino retrovirus relacionados con la leucemia (XMRV) es un agente infeccioso descubierto recientemente [1 ] que se ha relacionado con el cáncer de próstata humano [2] y el síndrome de fatiga crónica (CFS) [3]. Ambas enfermedades afectan a una gran parte de la población mundial, con el cáncer de próstata afecta a uno de cada seis hombres, y el síndrome de fatiga crónica que afecta a un estimado de 0,4 a 1% de la población [4], [5]. ácido nucleicos o proteínas XMRV se encuentran en 27% de los cánceres de próstata y en 68% de los pacientes con síndrome de fatiga crónica, y en menos de 4 a 6% de los controles normales, lo que sugiere una asociación entre el virus y la enfermedad humana [2], [3 ].
SFC, una enfermedad caracterizada por fatiga debilitante grave, ha tenido una etiología incierta, ya que su reconocimiento. Si bien se han propuesto una serie de agentes virales y las toxinas ambientales que se asocia con síndrome de fatiga crónica, nunca se ha presentado ninguna evidencia clara para ellos (revisado en [6]). La reciente asociación de XMRV con el síndrome de fatiga crónica del Instituto Whittemore Peterson en Reno, Nevada, mientras que lejos de ser probada de causalidad, es la asociación más fuerte viral que hacer todavía. Tres informes recientes, utilizando el ADN plásmido como controles positivos, no encontró XMRV en pacientes con SFC en Europa [7] [8] [9]. La prevalencia de XMRV en el cáncer de próstata en Europa es incierto, con un grupo alemán de información sobre la presencia de XMRV en próstatas humanas [10], y el otro no detectar ninguna [11]. Sin embargo, la idea de que un retrovirus podría estar implicada en el cáncer y una enfermedad neuroinmune en los seres humanos no tiene precedentes. T-célula humana virus linfotrópico, tipo 1 (HTLV-1), otro retrovirus, las causas del linfoma tanto de células T /leucemia, así como paraparesia espástica tropical, una mielopatía debido a defectos inmunes resultantes de la infección viral.
infecciosa XMRV se ha aislado a partir de sueros de pacientes con SFC [3]. La presencia de circulación de partículas de retrovirus infecciosos en la sangre invoca un escenario no muy diferente de la infección con otro retrovirus, virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Dado que no existe un tratamiento eficaz para esta enfermedad debilitante profundamente, el uso de agentes antirretrovirales que han demostrado ser razonablemente seguro para uso humano, puede ser de beneficio. El descubrimiento de agentes antirretrovirales eficaces contra el XMRV permitiría para el diseño racional de los ensayos clínicos para prevenir la progresión del cáncer de próstata o para tratar el síndrome de fatiga crónica.
En este estudio, se presenta el efecto de 45 compuestos sobre la replicación del XMRV en MCF 7 y LNCaP células, líneas celulares generadas a partir de los cánceres de mama y próstata humanos, respectivamente. Se estudiaron los fármacos utilizados en el tratamiento de infecciones por VIH-1, así como los compuestos utilizados para tratar otras infecciones virales en los seres humanos. XMRV es un gammaretrovirus, estrechamente relacionado con los virus de la leucemia murina (MLV) [1]. A nivel de aminoácidos, que comparte identidad considerable con secuencias de Moloney virus de la leucemia murina (MoMLV), un prototipo de MLV. La similitud máxima entre XMRV y proteínas MoMLV se encuentra en las secuencias para la proteasa viral (96% de identidad), y el menos similitud entre las dos proteínas de la envoltura (66% de identidad) [1]. Por desgracia, no hay muchos agentes antirretrovirales utilizados activamente-se han probado para la actividad contra MLV, con la excepción de ZDV, que suprime de manera efectiva MLV [12], y recientemente se ha demostrado que es eficaz contra el XMRV, así [13]. Por el contrario, mientras que hay una gran cantidad de información sobre la actividad antiviral contra 1-VIH proteínas esenciales, hay muy poca similitud entre las proteínas del VIH-1 y XMRV, con las proteasas (PR) de los dos virus comparten el 28% de identidad en el extremo amino nivel de ácido, las proteínas de la transcriptasa inversa (RT) que comparten el 17% y las proteínas integrasa (IN) comparten sólo el 14% de identidad. Esta baja similitud de secuencia hace que sea difícil predecir lo que, en su caso, de los agentes antirretrovirales que son eficaces contra el VIH-1 sería eficaz contra el XMRV. Elegimos varios fármacos de cada clase principal de agentes antirretrovirales: inhibidores nucleósidos y no nucleósidos de la RT (NRTI y NNRTI), inhibidores de la IN, e inhibidores de PR (PI). Las proteínas de la envoltura del XMRV y el VIH-1 son muy divergentes en tamaño (70 kD y 160 kD respectivamente), utilizan diferentes receptores para la entrada viral y no comparten ninguna similitud significativa. Por lo tanto, los peptidomiméticos que actúan sobre la proteína de envoltura del VIH-1 para prevenir la entrada viral no se incluyeron en nuestro estudio. También se evaluaron Unos inhibidores que se sabe que inhiben la replicación de virus distintos de los retrovirus. Un número significativo de compuestos analizados en nuestro estudio, a saber. 28 de un total de 45, ya están aprobados por la FDA para el tratamiento de la infección por VIH-1 u otros virus. Presentamos aquí por primera vez que el inhibidor de la integrasa, raltegravir (RAL), es extremadamente potente y selectiva contra XMRV, cuando se usa a bajas concentraciones submicromolares en ambos sistemas de cultivo celular. Otro inhibidor de IN, L-000870812, y dos NRTI, ZDV y tenofovir disoproxil fumarato (TDF), también inhiben la replicación XMRV, pero en concentraciones más altas. Cuando se combinan, estos compuestos presentan efectos sinérgicos, lo que sugiere modalidades combinadas para el tratamiento de la infección por XMRV, por tanto, retrasar o impedir la selección de virus resistentes.
Resultados
Hemos probado un total de 45 compuestos pertenecientes a diferentes clases de inhibidores de VIH-1, y algunos inhibidores de virus distintos de los retrovirus, por su capacidad para inhibir la replicación del XMRV en células cultivadas. células LNCaP y MCF-7 fueron elegidos por su capacidad de apoyar robusta
in vitro
la replicación del XMRV. MCF-7 células, debido a sus mejores propiedades de crecimiento en cultivo fueron utilizados inicialmente para poner a prueba los 45 compuestos (Figura 1). Los compuestos con actividad anti-XMRV se ensayaron posteriormente tanto en LNCaP y células MCF-7 (Tabla S1). Para determinar si una reducción en la liberación viral podría ser debido a la toxicidad del compuesto y no debido a la actividad antirretroviral específica, la morfología celular se controló cada 24 h por examen microscópico, y un MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difeniltetrazolio] ensayo colorimétrico se usó para medir la citotoxicidad potencial producido por los compuestos. Los sobrenadantes se recogieron cada 24 h y se ensayaron para la liberación viral mediante la medición de la actividad RT. La inhibición de la actividad de RT (ver la Figura 2) fue en promedio más de 3-6 experimentos, cada uno realizado por duplicado, y se usa para calcular la mediana (CE
50) y 90% concentraciones eficaces (CE
90) para cada compuesto (Figura 1). Para fines de comparación, todos los compuestos evaluados en estos estudios también se ensayaron contra el VIH-1
LAI en linfocitos humanos primarios.
Todos los compuestos se evaluaron por duplicado al menos tres veces. Los valores mostrados son la media de los ensayos replicados. * (4
S
) -8-cloro-4-metil-5- (3-metilbut-2-enil) -3,4,5,6-tetrahidro-1H- [1], [3 ] diazepino [4,5,6-cd] indol-2 (2aH) tiona.
Los inhibidores de VIH-1 transcriptasa inversa
Los siguientes inhibidores de NRTI de VIH-1 RT se pusieron a prueba en nuestros ensayos de replicación XMRV: ZDV, 3'-azido-3'-desoxiadenosina (AZA), 3'-azido-3'-desoxiguanosina (AZG), 3'-azido-3'-desoxi-5-metil [(-) - FTC], tenofovir (TNV) y su forma de profármaco TDF, 9- (β-D-1,3-dioxolan-4-il) guanina, emtricitabina -cytidine (CS-92), lamivudina (3TC) (DXG) y su forma de profármaco, amdoxovir (DAPD, AMDx), (-) - carbovir (CBV), estavudina (d4T) y su correspondiente análogo de citosina (D4C), Videx (ddI), zalcitabina (ddC), y 3 ' fluoro-3'-desoxitimidina (FLT). También probamos el efavirenz NNRTI, y un derivado de TIBO que ha demostrado ser eficaz en un sistema murino [14]. Entre estos, los inhibidores más potentes eran XMRV ZDV y TDF (Figura 2, A, B). La CE
50 y EC
90 en células MCF-7 fueron de 0,11 M y 7,3 M durante ZDV, y 0,24 M y 15,3 M durante TDF, respectivamente (ver Figura 1). La CE
50 y CE
90 valores se determinaron también en las células LNCaP, una línea celular de cáncer de próstata, y no había una diferencia constante de hasta 5 veces entre las dos líneas celulares, que puede estar relacionada con su diferente las tasas de captación de nucleósido y bioconversión al análogo de nucleósido trifosfato activo. La CE
50 y EC
90 en células LNCaP fueron de 0,14 M y 1,1 M durante ZDV, y 0,9 M y 4,2 M durante TDF, respectivamente. CBV, AZA, FLT y D4T todos mostraron una inhibición mayor que 70% de la replicación del XMRV (ver Tabla S1), pero a la mayor concentración de 100 mM. AZG, CS-92, (-) - FTC, 3TC, ddI, DAPD y DXG eran esencialmente inactivos a 100 mM (Figura 1). TFV también fue ineficaz contra XMRV, probablemente debido a su naturaleza polar, que puede no permitir la suficiente fármaco para penetrar en las células. El efavirenz NNRTI (EFV) y el derivado TIBO, no demostraron ninguna actividad importante contra el XMRV.
liberación viral de las células LNCaP XMRV infectadas en presencia de concentraciones crecientes de ZDV (B) TDF (A) ( C) RAL y (D) L-000870812, se determinó midiendo la actividad de RT en los sobrenadantes. El porcentaje de inhibición se calculó sobre la base de las células infectadas expuestas a DMSO solo se establece en 0% de inhibición, y células de los animales en la ausencia de cualquier compuesto que figuran en el 100% de inhibición. La viabilidad celular se comprobó mediante microscopía, cuantificado mediante el ensayo de MTT, y representada por barras sombreadas. Los datos para cada compuesto se derivaron de un promedio de al menos tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.
Los inhibidores de la integrasa del VIH-1
EN inhibidores de raltegravir (RAL o MK también se evaluó 0518) y L-000870812 [15] para su capacidad para inhibir XMRV en los dos sistemas celulares (Figura 1, Figura 2 C y D). De ensayaron todos los compuestos, RAL fue el más potente, con una CE
50 de 0.005 micras y un EC
90 de 3,5 mM en las células MCF-7, y un EC
50 de 0,03 micras y un CE
90 de 0,46 M en las células LNCaP (Tabla S1). L-000870812, mostró que la actividad contra la replicación del XMRV en concentraciones considerablemente más altas, con una CE
50 y CE
90 de 0,16 M y 26,9 M en las células MCF-7, y 0,7 M y 4,5 M en las células LNCaP, respectivamente .
Los inhibidores de la proteasa del VIH-1
se evaluaron nueve conocidos inhibidores de la proteasa del VIH-1 para la actividad contra el XMRV (Figura 1). El más efectivo fue el nelfinavir, aunque con un EC
50 de 34,3 M. La siguiente inhibidores de la proteasa tenía muy modestas actividades anti-XMRV: atazanavir (CE
50 de 64,8 M), amprenavir (CE
50 de 68,0 M), lopinavir (CE
50 de 72,2 M), y ritonavir ( CE
50 de 76,4 M). Darunavir, indinavir, saquinavir y tipranavir fueron esencialmente ineficaz contra el XMRV
in vitro
, cuando se probó hasta 100 mM.
Los inhibidores de virus distintos del VIH-1