Extracto
crecimiento y la diseminación del cáncer se han estudiado ampliamente desde hace mucho tiempo. Sin embargo, muchas nuevas observaciones sobre la anatomía y la histopatología de los acontecimientos del cáncer están siendo reportados como la formación de una red de origen vascular similar dentro de los tumores agresivos. En esta investigación, los nuevos tipos de micro-conductos, llamados vasos primo, se encontraron dentro de la cavidad abdominal de los modelos murinos xenoinjertos de cáncer de pulmón NCI-H460. Estos hilos vasculares se distribuyeron en gran parte en las superficies de varios órganos y, a menudo estaban conectados a los nódulos tumorales peritoneales. investigaciones histológicas y de inmunofluorescencia mostraron que los primo-vasos tenían rasgos característicos que eran claramente diferentes de los de los vasos linfáticos de aspecto similar. Tenían múltiples canales rodeados con matrices collageneous sueltos, lo que es en contraste con la estructura de un solo canal de otros sistemas vasculares. Los núcleos en forma de varilla alineados longitudinalmente a lo largo de los canales se supone que las células endoteliales de los vasos primo, pero LYVE-1, un marcador específico de los linfáticos, no se expresó, lo que indica una clara diferencia a partir de células endoteliales linfáticas. Tomados en conjunto estos resultados en y caracterización de las nuevas estructuras vasculares filiformes en modelos de cáncer puede tener importantes implicaciones para el pronóstico del cáncer y para la terapia
Visto:. Yoo JS, Ayati MH, Kim HB, Zhang Wb, Soh KS ( 2010) Caracterización del Sistema de Primo-vascular en la cavidad abdominal del cáncer de pulmón de ratón del modelo y de sus diferencias con el sistema linfático. PLoS ONE 5 (4): e9940. doi: 10.1371 /journal.pone.0009940
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 27 de enero de 2010; Aceptado: 9 Marzo 2010; Publicado: 1 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Yoo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación el apoyo de una infraestructura de Biología de Sistemas Establecimiento subvención del Instituto Gwangju de Ciencia y Tecnología. Jung Sun Yoo fue apoyada por la beca de Ciencia Seúl. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Primo-vasos (conductos Bonghan) son nuevos tipos de micro-conductos y se supone que son el fundamento mecanicista de los meridianos de acupuntura en la medicina tradicional oriental. A principios de la década de 1960, Bong-Han Kim, de Corea del Norte afirmó haber descubierto estos conductos, que llevan su nombre, que formaron un novedoso sistema circulatorio a través del cuerpo de un animal [1]. No lo hizo, sin embargo, reveló su método para observar el sistema en detalle, por lo que hasta hace poco, no hay confirmación exacta de su trabajo fue siempre logra a pesar de muchos intentos en China, Japón y Rusia, a excepción, para una reproducción parcial por un anatomista japonesa , Fujiwara [2].
Las observaciones de Primo-buques en conejos, ratas y ratones se hizo recientemente mediante la aplicación de técnicas de bio-imágenes modernas [3], que no ha sólo confirmó las afirmaciones de Kim sino que también proporcionó nuevos hallazgos y la información, como
in vivo
tinción de los primo-vasos con azul tripán [4] y la existencia de primo-vasos dentro de los tejidos grasos [5] y en las superficies de los tejidos tumorales subcutáneos [6]. Por otra parte, algunas pruebas para una función de conductor de fluido del sistema primo-vascular ha sido proporcionada por las mediciones de la velocidad de circulación [7] y la viscosidad del fluido [8].
En el presente trabajo, hemos observado primo -los aparatos en las superficies de los órganos abdominales y alrededor de los nódulos tumorales peritoneales en modelos de ratón de cáncer de pulmón. Para dilucidar los patrones de distribución de los primo-buques en el contexto de la biología del cáncer, se han utilizado dos tipos de modelos de cáncer, es decir, subcutánea (sc) modelo de xenotrasplante y la intraperitoneal (ip) modelo experimental de metástasis mediante la administración de NCI-H460 de pulmón humano células del cáncer [9], [10]. Tinción con azul tripán en
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y
en condiciones in situ
[4], [11] se aplicó para revelar la extensión de los primo-vasos en ratones portadores de tumores, lo cual fue posible gracias al medio de contraste se absorbe preferentemente en la estructura suelta de Primo-vasos en comparación con otros tejidos abdominales.
también realizamos investigaciones histológicas y de inmunofluorescencia para distinguir los primo-vasos de los vasos linfáticos de aspecto similar. La distinción entre primo-vasos y los vasos linfáticos ha sido una cuestión inminente debido a las similitudes de estas características morfológicas. Aunque este problema se resolvió parcialmente mediante el uso de la histología convencional y microscopía electrónica [12], [13], un examen más convincente, tales como inmunohistoquímica con un marcador fiable molecular de las células endoteliales linfáticas, LYVE-1 [14], [15], [16], no se había intentado hasta que esta investigación. En el que se realizó la inmunotinción con LYVE-1, además de utilizar diversos exámenes histológicos convencionales, para mostrar la distinción entre primo-vasos y vasos linfáticos.
Resultados
La visualización intraoperatoria de Primo-vasos en SC Xenoinjertos
Para visualizar primo-buques en s.c. xenoinjertos de ratón, se realizó una cirugía abdominal cuidadosa dos a ocho semanas después de la inoculación de 1 x 10
7 de cáncer de pulmón humano NCI-H460. La Figura 1 presenta imágenes anatómicas del sistema vascular, primo-teñidos con azul de tripano (color azul), dentro de los abdómenes de s.c. tumor-teniendo ratones.
In situ
tripán azul de propagación en condiciones vivas reveló primo-vasos semitransparentes (flechas) en los tejidos grasos (figuras 1A & amp;. 1B) o alrededor de los órganos gonadales (. Las figuras 1C & amp; 1D) o en las superficies de diversos órganos, incluyendo el intestino delgado, el riñón y el hígado (Figs 1E, 1F & amp;. 1H), o en la pared abdominal (Fig 1G.). Otras estructuras conocidas, como los vasos linfáticos, el tejido adiposo, vasos sanguíneos y nervios, no eran
in vivo
teñido con azul de tripano en nuestros varios intentos. Rectas, delgadas primo-vasos eran a menudo visibles, pero a veces también se encontraron muchas ramas bifurcadas con un cruce (un asterisco). Podríamos levantar primo-vasos largos y elásticos con una pinza mientras que los vasos linfáticos son comúnmente fijadas dentro de los tejidos (fig. 1B).
In situ
tripán azul propagación reveladas semitransparentes primo-vasos (flechas) que se distribuyen en las superficies de diversos órganos debido a una mayor infiltración del colorante en la estructura extracelular suelta de Primo-vasos en comparación con otros tejidos. Rectas primo-vasos finos a menudo eran visibles, pero a veces también se encontraron muchas ramas bifurcadas con un cruce (un asterisco). Tenga en cuenta que primo-buque es elevable por fórceps, en contraste con los vasos linfáticos (B). LI; intestino grueso, SI; intestino delgado, O; oviducto, L; hígado, K; riñón, AW; pared abdominal.
La visualización intraoperatoria de Primo-buques en i.p. Xenoinjertos
A las imágenes intraoperatorias similar se realizó con la vía intraperitoneal xenoinjertos de ratón. La Figura 2 representa el sistema de primo-vascular unida a nódulos tumorales intraperitoneales. Los primo-vasos (flechas), teñidas con azul de tripano, se localizaron principalmente en torno a los nódulos tumorales (puntas de flecha) que se habían formado a las 4 semanas después de la inyección i.p. inyección con 1 × 10
7 células NCI-H460. Especialmente, algunos primo-vasos mostraron patrones de distribución bien va dentro o alrededor de los nódulos tumorales y es probable que sean nuevos crecimientos de Primo-buques impulsados por las necesidades del tumor.
Primo-vasos (flechas) manchadas con tripán azul que se encuentra principalmente en torno a los nódulos tumorales (puntas de flecha) que eran visibles después de 4 semanas de IP inyección con células NCI-H460. Especialmente algunos primo-vasos mostraron patrones de distribución bien va dentro o en los alrededores de nódulos tumorales. SI; intestino delgado, AW; pared abdominal
histológico Caracterización de Primo-vasos con H & amp;. E y tinción MT
Una caracterización más lejos para encontrar una morfología distintiva para los primo-vasos se llevó a cabo mediante el uso de un histopatholgic examen. La Figura 3 muestra típicos primo-nodos y primo-vasos obtuvieron de xenoinjertos de cáncer de pulmón. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tricrómico y Masson de (MT) tinción reveló múltiples lúmenes (flechas) con flotante células (puntas de flecha) en todas las muestras, y esta estructura multi-lumen es distinto de la estructura de un solo lumen de vasos linfáticos o sanguíneos . Además, MT tinción reveló un sistema de primo-vascular que consiste en fibras de colágeno sueltas (color azul) alrededor de los lúmenes. Este resultado muestra que la primo-barcos no pueden confundirse con fibrinas coagulada o de otros artefactos
(A) que se muestran son un hematoxilina representativa y eosina (H & amp; E). Teñidas sección transversal primo-nodo (arriba) y tricrómico de Masson un (MT) teñidas sección adyacente (inferior). cifras correctas son imágenes ampliadas de las figuras que quedan. (B) Se representan los primo-vasos secciones transversales que se tiñeron con H & amp; E (izquierda) y MT (derecha). (C) H & amp; E tinción de una sección oblicua que contiene tanto un primo-nodo (una flecha doble) y un primo-buque (una flecha de puntos). Una imagen de la primo-nodo se ha magnificado en la figura de la derecha. Hay múltiples lúmenes (flechas) con células flotantes (puntas de flecha) en todas las muestras que son distintos de una única estructura de lumen de vasos linfáticos o sanguíneos. Por otra parte, MT tinción reveló sistema de primo-vascular consiste en fibras de colágeno sueltas (color azul) que rodean lúmenes.
La inmunotinción con un marcador linfático de los linfáticos, LYVE-1 |
Para discriminar de manera convincente primo-vasos de los vasos linfáticos, que llevan a cabo el próximo examen inmunohistoquímico con LYVE-1. La Figura 4 representa los resultados de la tinción de inmunofluorescencia de la primo-buque en un xenoinjerto de cáncer de pulmón. Primo-recipiente y las secciones transversales de los vasos linfáticos fueron tratados con anti-LYVE1 anticuerpo policlonal (verde) o anticuerpo policlonal de control de isotipo y se observaron con el microscopio confocal de fluorescencia. También se tomaron imágenes de fluorescencia de DAPI (azul) y los núcleos -exhibiting DIC imágenes. Las células endoteliales linfáticas con una fuerte tinción positiva están claramente situados en el límite interior del vaso linfático (Fig. 4A), mientras que no hay células positivas LYVE-1 se observan en la primo-recipiente (Fig. 4C). tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo no mostró ninguna señal fluorescente, lo que demuestra los resultados de la tinción de ser fiable. Una parte de la misma muestra que se había tratado sólo con DAPI sin seccionar y había sido montado longitudinalmente reveló núcleos en forma de barra alineados en torno a los lúmenes, que los núcleos se supone que son las células endoteliales de la primo-buque (Fig. 4E).
secciones transversales Primo-vasos fueron tratados con anti-LYVE1 anticuerpo policlonal (verde) o anticuerpo de control policlonal de tipo iso (C, D) y se observaron con el microscopio confocal. secciones transversales vaso linfático se tiñeron con los mismos anticuerpos y se observaron como controles positivos (A, B). También se tomaron imágenes de fluorescencia de DAPI (azul) y los núcleos que muestran imágenes DIC. células endoteliales linfáticas con una fuerte tinción positiva claramente situados en el límite interior de los vasos linfáticos, mientras que no se observaron LYVE-1 células positivas en el primo-buque. Una parte de la misma muestra que se trató sólo con DAPI sin seccionar y montado reveló alineados longitudinalmente núcleos de varilla de forma que rodean lúmenes asumidos para ser células endoteliales de primo-recipiente (E).
Discusión
el presente estudio es la primera investigación anatómica demostración y de inmunofluorescencia del sistema primo-vascular, una nueva red vascular conductor de fluido, en modelos de ratón de cáncer de pulmón. En gran parte se observaron primo-vasos distribuidos en las superficies de los órganos abdominales en conjunción con el crecimiento del tumor. Primo-buques podrían ser objeto de discriminación de los vasos linfáticos de aspecto similar 1) por su alto
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afinidad con tinción con azul de tripano, 2) por sus características histológicas, es decir, la estructura de múltiples lúmenes con matrices collageneous sueltos, y 3) por su característica inmunoquímica, es decir, expresión negativa de LYVE-1.
tinción preferencial de Primo-buques por el azul de tripano en
in vivo | condiciones actuales se informó anteriormente [4]. En este artículo, se quitan y 0,1% de azul de tripano bajo aire, prevención de la propagación generalizada por toda la cavidad abdominal, para revelar toda la distribución de Primo-vasos con alto contraste de tejidos de fondo. Esta alta infiltración y la tinción de azul de tripano sobre el Primo vasos pueden ser explicadas por los primo-barcos cuya matriz de tejido más suelto con algunas aberturas y poros en el límite exterior de otros tejidos. Trypan azul es un colorante vital bien conocido y se ha utilizado para visualizar el endotelio corneal en cirugía del segmento anterior [17] o la cápsula anterior en la cirugía de cataratas [18] o membrana epirretiniana en cirugía vitreorretinopatía proliferativa [11]. Este trabajo confirma la eficacia del uso de la tinción vital con azul de tripano para visualizar la distribución de Primo-vasos abdominales.
Nos encontramos redes abdominales bien desarrollados de primo-vasos en ratones portadores de tumores por primera vez. Especialmente, a menudo observado primo-vasos conectados a los nódulos tumorales, con el crecimiento de esta nueva arquitectura probablemente impulsado por las necesidades del tumor, es decir, proporcionando para el suministro nutricional al tumor y para el transporte eficiente de las células tumorales independientes para la metástasis. Aunque otros estudios cuantitativos sobre la carga tumoral y la morfometría de Primo-buques deberán dirigirse, estos hallazgos anatómicos preliminares pueden proporcionar importantes implicaciones para el pronóstico del cáncer y para la terapia
Debido a la similitud morfológica aparente -. Estructura fina transparente - entre los vasos linfáticos y los vasos primo, distinguiendo entre ellos es crítico. Una distinción basada en características anatómicas brutos [19] y los detalles histológicos [12] en conejos se informó antes. Los primo-cascos flotantes en el interior del flujo de los vasos linfáticos de ratas y conejos manifiestamente demostraron que son dos sistemas diferentes [20], [21], [22]. En esta investigación, hemos logrado no sólo un histológico convencional, sino también el examen de inmunofluorescencia de Primo-vasos obtenidos de ratones portadores de tumores de verificar las conclusiones relativas a los informes anteriores. H & amp; E y tinción MT revelaron múltiples lúmenes rodeadas de fibras de colágeno sueltas en primo-vasos, y esas estructuras multi-lumen eran distintos de la estructura de un solo lumen de vasos linfáticos o sanguíneos. Este resultado muestra que la primo-barcos no pueden confundirse con los vasos linfáticos, fibrinas coagulada, u otros artefactos. Además, un marcador específico de los linfáticos, LYVE-1, no se expresó en absoluto en primo-vasos proporcionar una clara diferencia entre primo-vasos y los vasos linfáticos. núcleos alineados longitudinalmente alrededor de los lúmenes de Primo-vasos con forma de varilla, y aunque se supone que estos núcleos de pertenecer a las células endoteliales, que no eran células endoteliales linfáticas.
En el presente trabajo nos hemos centrado en la diferencia entre el primo-vasos y los vasos linfáticos debido a su similitud en aparente aspecto. Nosotros no subrayar el carácter distintivo de los primo-vasos de los vasos sanguíneos, porque estos dos son manifiestamente perceptibles en el examen anatómico. Primo-vasos en la cavidad abdominal son la estructura de múltiples lúmenes y no se adhieren a la peritoneo de los órganos internos (Figs. 1 y 2). En contraste, los vasos sanguíneos son la estructura de un solo lumen y se encuentran en el peritoneo. Primo vasos son semi-transparente, de color blanco lechoso y se tiñen bien con azul de tripano en
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condiciones mientras que los vasos sanguíneos son de color rojo y apenas se tiñeron con azul de tripano. Dado que el sistema primo-vascular es un sistema completamente diferente del sistema cardio-vascular, su formación debe ser un proceso distintivo de la angiogénesis. Será que vale la pena probar esto mediante el uso de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-CD31 anticuerpo que es ampliamente utilizado para revelar las células endoteliales de origen de los vasos sanguíneos.
Primo vasos a menudo se encuentran a lo largo del exterior de los vasos sanguíneos, lo que podría haber una fuerte correlación entre la densidad de microvasos y primo-vasos. En el momento actual, sólo podemos mencionar que existe una indicación de que la densidad de vasos micro y densidad primo vasos tienen una correlación positiva en relación con el crecimiento tumoral y la metástasis. Nuestra investigación no es el primero en informar de nuevos conductos que son distintivamente diferente de la sangre o los vasos linfáticos relacionados con los acontecimientos del cáncer. Hendrix et al. encontrado redes matrices extracelulares ricas en el interior de tejido tumoral agresivo en 1999 [23]. Se formaron por una reversión de las células tumorales a un fenotipo indiferenciado y recapitulan vasculogénesis embrionaria, el llamado mimetismo vasculogénica [15]. De una manera similar primo-vasos pueden ser formados por procesos de vasculogénesis-como embrionarias. Desde primo-vasos se desarrollaron en la fascia del tejido subcutáneo en ratones portadores de tumores [6], que es un tema importante para aclarar la posible conexión o relación de las redes vasculogenic-like y los primo-vasos entre el interior y el tumor fuera tejido.
en conclusión, hemos demostrado la amplia presencia de Primo-vasos en ratones portadores de tumores y la diferencia importante entre el histológicos y las características inmunoquímicas de Primo-vasos y las de los vasos linfáticos. Estos hallazgos y análisis, que indican una nueva función del sistema primo-vascular, diferente de la de los vasos linfáticos, en conjunción con acontecimientos del cáncer, pueden servir de base para una nueva terapia para controlar el crecimiento y la diseminación del cáncer.
materiales y Métodos
Cell Cultura y
células de cáncer de pulmón humano NCI-H460 se obtuvieron de la célula de Corea Línea de banco (Seúl, Corea). Las células se cultivaron en un medio RPMI-1640 (Gibco-Invitrogen, EE.UU.) suplementado con 1% de penicilina-streptomcyin y suero bovino fetal al 10% (FBS) en 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
Modelo de cáncer de Animales
ratones desnudos hembra (BALB-c-nu /nu, de 5-7 semanas de edad, con un peso de 15-20 g, n = 20; Japan SLC, Inc., Hamamatsu, Japón) se utiliza de acuerdo con las directrices institucionales en virtud de los protocolos aprobados. Se utilizaron dos conjuntos de modelos de cáncer. El primer modelo es el modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo estándar (por vía subcutánea) [9]. Diez ratones fueron inoculados s.c. en el dorso con 1 × 10
células NCI-H460 7 de cáncer de pulmón humano (en un medio de 1 ml RPMI-1640) para la formación de tumor bajo la piel. El otro modelo es el tumor por vía intraperitoneal modelo de metástasis experimental. Se inyectaron i.p. células de cáncer de pulmón humano NCI-H460 como una suspensión de células en ratones desnudos (1 × 10
7 células por animales, n = 10) como se describe anteriormente [9], [10]. Toda la investigación con animales han sido aprobados por el laboratorio Instisute de Recursos Animales de la Universidad Nacional de Seúl.
intraoperatoria Imaging
Para identificar el sistema primo-vascular en el interior de la cavidad abdominal por vía subcutánea y por vía intraperitoneal modelos de cáncer de pulmón, se realizó una cirugía de dos ratón para ocho semanas después de la inoculación de las células NCI-H460 bajo anethesis general por vía intraperitoneal inyección de Zoletil /rompun. En primer lugar, la línea media del abdomen del ratón se realizó una incisión y los órganos intra-abdominales se expusieron cuidadosamente. A continuación, una solución de azul de tripano al 0,1%, se filtra previamente a través de papel de filtro de tamaño de poro de 0,22-m, se aplicó gota a gota en los órganos expuestos [4]. Después de enjuagar el tinte con solución salina caliente, Primo-nodos y primo-vasos se identificaron mediante la visualización directa de la anatomía quirúrgica con un microscopio quirúrgico (SZX12, Olympus, Japón). Por último, las imágenes fueron capturadas con una cámara CCD (DP 70, Olympus, Japón).
Los análisis histológicos
Después de las imágenes intraoperatorias del sistema primo-vascular,
ex vivo
examen se realizó con tinción histológica de las muestras. Para este propósito, primo-linfáticos y los vasos se fijaron en 10% tamponada neutra de formalina (NBF) durante 12 horas a 4 ° C, se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se deshidrataron en una serie de etanol, se aclara en xileno, y embebidos en PARAPLAST (Sigma, EE.UU.). secciones transversales PARAPLAST, 6 micras de espesor, se cortaron con un micrótomo fueron próxima teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para la observación morfológica general y con tricrómico de Masson (MT) para visualizar las fibras de colágeno. A continuación, las secciones fueron montadas con Neomount, y se examinaron con un microscopio de luz (BX51, Olympus, Japón). Las imágenes fueron adquiridas con una cámara CCD (Axiophot, Zeiss, Alemania).
La inmunohistoquímica
Para caracterizar primo-vasos contra los vasos linfáticos, se realizó una investigación inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-LYVE-1 IgG policlonal anticuerpo (pAb), un marcador específico de los linfáticos. Primo vasos y los vasos linfáticos en la superficie de los órganos abdominales en ratones portadores de tumores se cosecharon, embebido en OCT y se congelaron en nitrógeno líquido. Las secciones transversales (10 m) se fijaron en acetona enfriada en hielo durante 5 min, se lavaron en PBS, y se bloquearon con solución CAS-Block (Invitrogen, EE.UU.) durante 2 horas a 37 ° C. Los portaobjetos se incubaron con conejo LYVE-1 (2,5 g /ml, Abcam, UK) anti-ratón durante la noche a 4 ° C, seguido de lavados y la detección con IgG de conejo de cabra anti conjugados con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1:500 , ESTADOS UNIDOS). Los portaobjetos se trató con DAPI para contratinción nuclear, coverslipped en antifade reactivo (Molecular Probes, USA). Una parte de la misma muestra se trató sólo con DAPI y longitudinalmente todo ello montado en el reactivo antifade. Las muestras se visualizaron por microscopía confocal (LSM500, Zeiss, Alemania).
Reconocimientos
gracias Byung-Cheon Lee y Ahn Saeyoung útil para los debates.