Extracto
factor de escisión y poliadenilación específica 4 (CPSF4), un miembro del complejo CPSF, desempeña un papel clave en el ARNm y el ARNm de poliadenilación 3 'de maduración. Sin embargo, su posible papel en la patogénesis del cáncer de pulmón es desconocida. En este estudio, se investigó el papel biológico y la importancia clínica de CPSF4 en el crecimiento del cáncer de pulmón y la supervivencia y se aclararán sus mecanismos moleculares subyacentes. Se encontró que CPSF4 fue altamente expresado en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y el tejido tumoral, pero era indetectable en 8 tejidos humanos normales. También se encontró que la sobreexpresión CPSF4 se correlacionó con la supervivencia global en pacientes con mala adenocarcinomas de pulmón (
P Hotel & lt; 0,001). Los análisis de supervivencia multivariante, el mayor expresión CPSF4 fue un factor pronóstico independiente de la supervivencia global de los pacientes con adenocarcinomas de pulmón. Supresión de CPSF4 por las células de cáncer de pulmón inhibe la proliferación de siRNA, la formación de colonias, y la apoptosis inducida. Mecanismo estudios revelaron que se lograron estos efectos a través de la modulación simultánea de múltiples vías de señalización. Desmontables de expresión de siRNA CPSF4 marcadamente inhibida la fosforilación de PI3K, AKT y ERK1 /2 y las proteínas JNK. En contraste, la expresión ectópica de CPSF4 tenía los efectos opuestos. Por otra parte, CPSF4 desmontables también indujo la disociación de caspasa-3 y caspse-9 proteínas. En conjunto, estos resultados demuestran que CPSF4 juega un papel crítico en la regulación de la proliferación de células de cáncer de pulmón y la supervivencia y puede ser un potencial biomarcador pronóstico y diana terapéutica para el adenocarcinoma de pulmón
Visto:. Chen W, Guo W, Li M, Shi D, Tian Y, Li Z, et al. (2013) La regulación positiva de la escisión y poliadenilación factor específico 4 en adenocarcinoma de pulmón y su papel crítico para la supervivencia del cáncer de la célula y proliferación. PLoS ONE 8 (12): e82728. doi: 10.1371 /journal.pone.0082728
Editor: Chunhong Yan, Universidad Regentes de Georgia, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de Septiembre, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: 16 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación recibió el apoyo de los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81272195, 81071687, 81071687, 81372133), el Estado "Programa 863" de China (SS2012AA020403), el Estado "973 Programa" de China (2014CB542005), la Fundación de Doctorado Programas del Ministerio de Educación de China (20110171110077), y el Laboratorio Estatal de Oncología en el sur de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés en
Introducción
cáncer de pulmón primario es la causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es una forma importante de cáncer de pulmón y su incidencia ha ido en aumento en las últimas décadas. una visión novedosa sobre la biología del NSCLC han mejorado los resultados para ciertos pacientes [2], [3], sin embargo, la tasa de supervivencia global a los 5 años para los pacientes con NSCLC no se ha mejorado notablemente [4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una mayor comprensión de los mecanismos moleculares en la tumorigénesis del cáncer de pulmón y para la identificación de nuevas dianas terapéuticas, para mejorar el pronóstico de los pacientes
escisión y poliadenilación factor específico 4 (CPSF4;. Alternativamente conocido como CPSF30 o NEB1) fue descubierto originalmente como un componente esencial de la maquinaria de procesamiento del extremo 3 'del pre-ARNm celulares. La proteína es un miembro del complejo CPSF, que fue reportado a participar ARNm 3 'maduración y desempeñar un papel clave en la poliadenilación del ARNm con otros miembros del complejo CPSF [5] - [9]. Se ha propuesto que estos mRNA 3 'termina factores de maduración, incluyendo CPSF4 tal vez enlaza con la supresión de tumores [10], [11]. Por el contrario, otros estudios identifican que un potencial papel oncogénico de estos mRNA 3 'termina factores de procesamiento en múltiples cánceres humanos [12] - [15]. En las células infectadas por virus de la influenza, la proteína CPSF4 interactuaba con la proteína NS1 del virus y se inhibe 3 'de escisión de extremo y la poliadenilación del anfitrión pre-ARNm [16]. proteína CPSF4 funcionalmente interactuó con supresor de tumor Cdc73 y regulada la transcripción de genes específicos en INTS6 HeLa de células [10]. Aunque la función de CPSF4 se ha examinado en diferentes sistemas modelo, su papel potencial en los tumores no se ha investigado a fondo debido a la falta de datos relativos a la expresión CPSF4 y el crecimiento de las células tumorales.
En este estudio, se investigó la expresión y la importancia clínica de CPSF4 en el adenocarcinoma de pulmón y exploraron sus funciones y mecanismos subyacentes para la supervivencia y la proliferación de células cancerosas. Hemos demostrado que CPSF4 se sobreexpresa en un subconjunto de los adenocarcinomas de pulmón, que se correlaciona con la supervivencia global pobre. Desmontables de CPSF4 en los cánceres de pulmón conduce a la reducción del crecimiento celular, la proliferación y aumento de la apoptosis en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón con altos niveles endógenos de CPSF4. Nuestros resultados indican que CPSF4 puede ser un potencial biomarcador pronóstico y la diana terapéutica para el adenocarcinoma de pulmón.
Resultados
CPSF4 es altamente expresado en líneas celulares de adenocarcinomas de pulmón y los tejidos tumorales
examinó por primera vez la expresión de la proteína en los pulmones CPSF4 líneas celulares de adenocarcinoma de Western Blot. Las líneas celulares de adenocarcinomas de pulmón expresan altos niveles de proteínas CPSF4 en comparación con el HBE (Fig. 1A). También se detectó la expresión de la proteína en el tejido CPSF4 adenocarcinomas de pulmón y 8 tejidos humanos normales (corazón, pulmón, hígado, riñón, cerebro, bazo, ovario, testículo y) por ensayo de inmunohistoquímica. Como se muestra en la Figura 1B, se observó una tinción positiva de CPSF4 en el núcleo de las células de cáncer de pulmón, mientras que la tinción CPSF4 no se pudo detectar en los 8 tejidos normales, lo que sugiere que CPSF4 podría ser un biomarcador potencial para adenocarcinomas de pulmón.
(a) La expresión de CPSF4 en HBE células de pulmón humano normal y diversas líneas de células de adenocarcinoma de pulmón se analizó por transferencia Western. (B) La expresión de CPSF4 en 8 tejidos humanos normales y tejidos de adenocarcinoma de pulmón se detectó por tinción inmunohistoquímica. (Ampliación, × 200). ADC, adenocarcinoma.
sobreexpresión CPSF4 se asocia con mal pronóstico de los adenocarcinomas de pulmón pacientes
Para investigar el significado clínico patológica de CPSF4 en adenocarcinomas de pulmón, se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica en un microarray tisular . tinción CPSF4-positiva se observó en el núcleo de las células de cáncer de pulmón, pero la tinción fue negativa en los tejidos pulmonares no malignas adyacentes (Fig. 2A y 2B).
(A) Los ejemplos representativos de fuerte, moderada, débil y la expresión CPSF4 negativo en tejidos de adenocarcinoma de pulmón. Los paneles superiores, × 40; paneles inferiores, × 400, de la zona de la caja en el panel superior respectivamente. (B) Comparación de los niveles de expresión CPSF4 entre los tejidos de adenocarcinoma de pulmón y los tejidos pulmonares no malignas adyacentes por inmunohistoquímica en el mismo paciente. Se muestran imágenes representativas de tejidos de adenocarcinoma de pulmón emparejados y tejidos pulmonares no malignas adyacentes (ampliación, × 400). Se utilizó análisis de la curva (C) ROC para determinar el punto de corte para alta expresión de la proteína CPSF4 en tejidos de adenocarcinoma de pulmón. La sensibilidad y especificidad para el sistema operativo se representaron;
p = 0,002
. análisis (D) de Kaplan-Meier de supervivencia global con la expresión alta o baja CPSF4 (
p Hotel & lt; 0,001, prueba de log-rank). análisis (E) de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes masculinos y femeninos con una expresión de alto CPSF4 (
p
= 0,56).
Para desarrollar una puntuación razonable de corte de CPSF4 para su posterior análisis de supervivencia, sometimos a cada puntuación de IHC análisis de la curva ROC con respecto a la evolución del paciente. Como se muestra en la (Fig. 2C), la línea de corte CPSF4 IHC resultados de SG fue de 5,0. Por lo tanto, la expresión de CPSF4 en cada muestra se clasificó posteriormente como alto nivel (score & gt; 5) o de bajo nivel (puntuación ≤ 5). Las características clínico-patológicas de los 150 pacientes con adenocarcinomas de pulmón se muestran en la Tabla 1A. Se encontró que la tasa de expresión de alto CPSF4 fue mayor en los pacientes con posterior clasificación N (P = 0,033, prueba de chi-cuadrado) (Tabla 1). No hubo correlación significativa entre la expresión CPSF4 y otros parámetros clínico-patológicas, como el sexo del paciente, la edad (≥60 vs. & lt; 60 años), la clasificación T (P & gt; 0,05, Tabla 1). Los análisis de supervivencia demostró que la alta expresión de CPSF4 correlacionó significativamente con un menor tiempo de supervivencia global en pacientes con adenocarcinomas de pulmón (P & lt; 0,001, prueba de log-rank; Fig. 2D). La supervivencia también análisis mostraron que no hubo diferencia significativa del tiempo de supervivencia global entre el macho y la hembra de pacientes con niveles altos CPSF4 (P = 0,56, log-rank test; la figura 2E.)
También. se utiliza un análisis univariante para evaluar las asociaciones entre el pronóstico del paciente y varios factores clínico-patológicos incluyendo la expresión CPSF4 (alta versus baja), el sexo (masculino vs. femenino), edad (≥60 vs. & lt; 60 años), estadio pT (tamaño del tumor; T3-T4 vs T1-T2) y la etapa pN (metástasis de ganglios linfáticos; N2-N3 vs. N0-N1). Todos estos parámetros con excepción del sexo y la edad se asociaron significativamente con pronóstico inferior (Tabla 2). El análisis multivariado indicó, además, que el nivel y la etapa de alta CPSF4 pN fueron factores pronósticos independientes para la supervivencia global de los pacientes con adenocarcinomas de pulmón (Tabla 2). Todos estos hallazgos sugieren que CPSF4 puede tener un papel importante en la promoción de un comportamiento más agresivo de las células de cáncer de pulmón.
caída CPSF4 inhibe la proliferación celular de adenocarcinoma de pulmón y la supervivencia
Para evaluar si el las células que expresan altos niveles de CPSF4 dependen de ella para su supervivencia y proliferación, transfectadas siRNA oligonucleótidos dirigidos CPSF4 en células H1299 y A549, que expresan niveles significativos de CPSF4. Los resultados mostraron que las nanopartículas CPSF4 siRNA basados en DC marcadamente downregulated expresión de la proteína CPSF4 (Fig. 3A), y la caída de CPSF4 significativamente la viabilidad celular inhibida en comparación con la transfección con los grupos de siRNA no específicos mediante el ensayo de MTT (Fig. 3B).
(A) Análisis de la expresión CPSF4 por Western blot 3 días después de la transfección de siRNA. , Simulacro de control del vehículo; Control de siRNA, siRNA inespecífico; CPSF4 siRNA-1 y CPSF4 siRNA-2, CPSF4 siRNA. viabilidad (B) de la célula se midió mediante el ensayo de MTT. La media y la obtenida a partir de tres experimentos independientes se representan (*,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01). (C) Las células se trataron con CPSF4 siRNA o control siRNA (50 nmol /L) cada 3 días y se hicieron crecer durante 14 días; se contaron las colonias teñidas con cristal violeta. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (***,
P Hotel & lt; 0,001). (D, E) A los 3 días después de la transfección siRNA, el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo utilizando tinción con PI. se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes (D). El porcentaje de células en cada fase (E). células H1299 y A549 (F) se sembraron en la cámara de los cultivos polarizados cubiertos con matriz de Matrigel. La invasividad de las células se determinó por células contadas que pasan a través de la matriz de Matrigel a la parte basal de los cultivos polarizados. * P & lt;. 0,05 en comparación con el grupo control de siRNA inespecífico
Para confirmar la inhibición mediada por siRNA CPSF4 del crecimiento celular, el próximo realizaron experimentos de formación de colonias y encontraron que CPSF4 caída disminuyó significativamente la formación de colonias en células H1299 y A549 (Fig. 3C). Desde que se observó un efecto inhibidor del crecimiento en las células transfectadas con siCPSF4, se analizaron los transfectantes para los parámetros del ciclo celular por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3D y 3E, la acumulación de células G1 aumentó notablemente en el grupo tratado con siRNA CPSF4 en comparación con los controles no específicos siRNA (75% vs. 55% en H1299 y 73% vs. 46% en A549). Además, también mostró que desmontables de CPSF4 por siRNA considerablemente la invasión de células inhibe tanto en células A549 H1299 y (Fig. 3F). Estos resultados indican que desmontables de CPSF4 en células de cáncer de pulmón dio como resultado una inhibición significativa de la proliferación celular y la invasión celular.
caída CPSF4 inactiva PI3K /AKT y MAPK señalización
Para identificar los posibles mecanismos moleculares por el cual CPSF4 caída supervivencia de las células del cáncer de pulmón inhibida y la proliferación, se analizaron las actividades de varias proteínas pro-supervivencia por Western blot. Los resultados mostraron que CPSF4 caída tanto en las células H1299 y A549 suprimió drásticamente la fosforilación de PI3K, AKT, ERK1 /2 y las proteínas JNK, pero aumentó considerablemente la fosforilación de proteínas p38 (Fig. 4A), lo que conduce a una inactivación de la vía PI3K /AKT y MAPK vías de señalización.
(A) A las 72 horas después del tratamiento siRNA, la expresión de la proteína CPSF4 y la Akt total y fosforilada, PI3K, ERK1 /2, las proteínas JNK y p38 en H1299 y A549 se detectó por Western blot. GAPDH sirvió como control de carga. (B) La apoptosis en células H1299 y A549 se determinó por citometría de flujo 72 h después de la transfección de siRNA utilizando un kit V-FITC /PI-tinción con anexina. Se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. (C) La apoptosis se calcula en función de la FITC-positivas en las células. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (*,
P Hotel & lt; 0,05). (D) A las 72 horas después del tratamiento siRNA, la expresión de Bcl-2, se escindió de la caspasa-3 o 9 proteínas en H1299 y A549 se detectó por Western blot. GAPDH se utilizó como control de carga.
caída CPSF4 induce la apoptosis en células de cáncer de pulmón
A continuación se investigó el efecto de la caída en la apoptosis CPSF4 por Anexina V-FITC staining- /PI análisis FACS base (Fig. 4B). Desmontables de CPSF4 de siRNA resultó en una inducción significativa de la apoptosis celular en las células H1299 y A549 (Fig. 4C). La activación de caspasas es un evento importante en la vía de señalización de apoptosis. A continuación se detectó el efecto de CPSF4 caída en la expresión y la activación de dos proteínas pro-apoptóticas clave: la caspasa-3 y caspasa-9, en H1299 y células A549 por Western blot. Como se muestra en la Fig. 4D, CPSF4 caída inducida por la activación de la caspasa-3 y -9, dando como resultado un marcado aumento en los niveles de caspasa-3 escindidos y escindidos de caspasa-9 proteínas. Desmontables de CPSF4 también downregulated la expresión de Bcl-2, una proteína anti-apoptótica importante, tanto en las células H1299 y A549 (Fig. 4D) .Así, estos resultados indican que CPSF4 puede controlar varios aspectos de la señalización de apoptosis.
sobreexpresión CPSF4 promueve el crecimiento de células de cáncer de pulmón y activa PI3K /AKT y MAPK señalización
Para confirmar aún más el papel de CPSF4 en la regulación del crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de la PI3K /AKT y MAPK vías de señalización, se transfectaron células H1299 con un vector de expresión que codifica CPSF4 (pcDNA3.1-CPSF4) o un vector de control que carece CPSF4 (pcDNA3.1). Los resultados mostraron que la sobreexpresión CPSF4 marcadamente promovió la viabilidad celular (Fig. 5A) y la formación de colonias (Fig. 5B), en comparación con la transfección con los grupos de control de vector. Para identificar los mecanismos moleculares subyacentes por los cuales ovexexpression CPSF4 aumento en el crecimiento de células de cáncer de pulmón, se analizó el efecto de CPSF4 en la activación de AKT y MAPK señalización por Western blot. Como se muestra en la Fig. 5C, CPSF4 ovexexpression marcadamente upregulated la fosforilación de PI3K, AKT, ERK1 /2 y las proteínas JNK. Por tanto, estos resultados mostraron que la expresión ectópica de CPSF4 promovió el crecimiento de células parcialmente a través de la activación de la vía PI3K /AKT y MAPK señalización en células de cáncer de pulmón
.
H1299 células (A) se transfectaron con CPSF vector que expresa, en 3 o 4 días de viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (*,
P Hotel & lt; 0,05). (B) células H1299 se transfectaron con CPSF4 expresar vectores o vector de control cada 3 días y se cultivó durante 8 días, las colonias se tiñeron con violeta cristal y se contaron. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (*,
P Hotel & lt; 0,05). Células H1299 (C) se transfectaron con CPSF vector que expresa, a las 72 horas después de la transfección, la expresión de CPSF4 así como Akt total y fosforilada, PI3K, ERK1 /2 y las proteínas JNK se detectó por Western blot. GAPDH se utilizó como control de carga.
Discusión
En este estudio, se demostró que CPSF4 fue altamente expresado en líneas celulares de adenocarcinomas de pulmón y los tejidos tumorales en comparación con las células del pulmón normal y tejidos pulmonares cancerosos, respectivamente. La expresión de CPSF4 en 8 tejidos humanos normales fue deficiente. Por otra parte, los datos clínico-patológicas de nuestro microarrays de tejidos mostraron que los adenocarcinomas de pulmón pacientes con CPSF4 altamente expresado tienen períodos de supervivencia más cortos que aquellos con baja expresión CPSF4. El análisis multivariado mostró que CPSF4 alta expresión es un factor pronóstico independiente de la supervivencia global de los pacientes con adenocarcinomas de pulmón. Los resultados de nuestro
in vitro
experimentos sugirieron que CPSF4 ejerce su función oncogénica mediante la regulación de la proliferación y la apoptosis de las células de adenocarcinoma de pulmón
CPSF4 pertenece el factor de escisión y poliadenilación especificidad (CPSF) compleja., cuyos otros miembros son CPSF160, CPSF100, CPSF73 y Fip1 [17]. Recientemente, algunos estudios se han centrado en el papel de los factores de procesamiento final algunos ARNm 3 'en el cáncer, incluyendo FIP1L1, CSTF50, CSTF2 y Neo-PAP [11] - [15]. Por ejemplo, Aragaki y sus colegas encontraron que la CSTF2 fue altamente expresado en el cáncer de pulmón, mientras que su expresión era apenas detectable en cualquiera de los 29 tejidos humanos normales, excepto testículos. Además, la caída de CSTF2 por siRNA inhibió el crecimiento de células de cáncer de pulmón. Más importante aún, CSTF2 sobreexpresión se asocia con un mal pronóstico para los pacientes con cáncer de pulmón. En este informe, aportar pruebas clínicas de que CPSF4 sobreexpresión predice un mal pronóstico en pacientes con adenocarcinoma de pulmón. La supresión de la expresión CPSF4 inhibió el crecimiento de células de cáncer de pulmón
in vitro. México La importante valor pronóstico de CPSF4 podría explicarse por su función de pro-supervivencia en las células de cáncer de pulmón. Todavía no se sabe por qué CPSF4 se sobreexpresa en células de cáncer de pulmón; Sin embargo, en base a los hallazgos del presente estudio, creemos que CPSF4 puede ser un objetivo de diagnóstico y /o terapéutico potencial en adenocarcinomas de pulmón.
En este estudio, se observó que CPSF4 mediada por siRNA desmontables inhibe el crecimiento celular y la apoptosis inducida en células de cáncer de pulmón que expresan altos niveles de CPSF4. Para investigar los mecanismos moleculares de subrayado, se examinaron PI3K AKT, MAPK y las vías de señalización de apoptosis alteración /. se observó inactivación de PI3K /AKT, MAPK vías de señalización por CPSF4 caída, como se indica por suprimido la fosforilación de PI3K, AKT, ERK1 /2 y JNK, en líneas celulares de cáncer de pulmón. Las vías PI3K /Akt y MAPK están involucrados en una amplia variedad de procesos celulares tales como el crecimiento, la proliferación, la diferenciación, la regulación de la transcripción, y el desarrollo [18], [19]. Estas dos vías de señalización se activan en el cáncer de pulmón y se han identificado como nueva diana para la terapia [20] - [22]. Por lo tanto, CPSF4 podría ejercer su efecto regulador del crecimiento, al menos en parte, por la modulación de la vía PI3K /AKT y MAPK vías de señalización en células de cáncer de pulmón. A pesar de que los análisis adicionales detallados son necesarios para determinar los blancos directos de CPSF4, los hallazgos de este estudio implican la importancia biológica de CPSF4 en la regulación del crecimiento celular del cáncer de pulmón y la supervivencia. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan un fundamento para la investigación farmacológica de CPSF4 como una potencial diana terapéutica en el cáncer de pulmón.
En resumen, CPSF4 fue altamente expresado en líneas celulares de cáncer de pulmón y los tejidos tumorales y se correlacionó positivamente con el mal pronóstico de pacientes con adenocarcinomas de pulmón. Desmontables de expresión de siRNA CPSF4 crecimiento celular significativamente inhibida y la apoptosis inducida en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón a través de la inactivación simultánea de la PI3K /AKT y MAPK señalización y la activación de las vías de apoptosis dependiente de caspasa. En contraste, la expresión ectópica de CPSF4 tenía los efectos opuestos. Por lo tanto, estos resultados indican que CPSF4 juega un papel importante en la regulación del crecimiento y la supervivencia de las células de adenocarcinoma de pulmón y puede ser una posible diana terapéutica para el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Sun Yat-sen Centro de cáncer de la Universidad. Todas las muestras utilizadas en este estudio fueron anónimas y recogidas de pacientes para el uso rutinario patología. No se obtuvo el consentimiento informado (escrito o verbal) para el uso de muestras de tejido retrospectivos de los pacientes en este estudio, ya que la mayoría de los pacientes habían fallecido y el consentimiento informado no se ha considerado necesario y liquidarse por la Comisión de Ética.
líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de NSCLC humano (H1299, A549, H1975, H1437) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad , CA), suplementado con suero bovino fetal 10%. Normal del epitelio bronquial humano (HBE) se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10%. Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada y un 5% de CO
2 a 37 ° C.
Western blot
Los lisados celulares se separaron por electroforesis en un 8-12% de sodio dodecil sulphate- minigel gradiente de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirió electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western blots se probaron con anticuerpos contra CPSF4 (Proteintech Group, Inc., Chicago, EE.UU.), fosfo-p85 PI3K (Tyr458) /p55 (Tyr199), PI3K, fósforo-Akt (Ser473), Akt, pTyr202 /Y204-ERK1 /2, ERK1 /2, pThr183 /Tyr185-SAPK /JNK, SAPK /JNK, exfoliados caspasa-3, caspasa-9 escindida y GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) .Las bandas de proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)
pulmón tejido adenocarcinomas microarray
Tissue microarrays (diámetro, 1,5 mm;. profundidad, 4 micras) que se utiliza para la inmunotinción análisis de expresión de la proteína CPSF4 fue adquirido de Shanghai aventajan Biotech (Shanghai, china, http://www.superchip.com.cn/). El microarray consistió en 150, los adenocarcinomas de pulmón incluidos en parafina y fijados en formalina correspondientes tejidos malignos de pulmón no adyacentes. Estas muestras de tejido se habían obtenido a partir de pacientes que no tienen tratamiento contra el cáncer antes de la resección del tumor. Las muestras de tejido se examinaron histológicamente y se clasificaron utilizando el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud de 2004 [23]. información clínica y patológica detallada, incluyendo tumor-nódulo-metástasis clínica y patológica etapa (TNM) y la duración de la supervivencia global (SG) estaba disponible para todos los casos. El estado TNM patológico de todos los adenocarcinomas de pulmón se evaluó según los criterios de la edición de siete del Comité Conjunto sobre el Cáncer (2010).
La inmunohistoquímica (IHC) e histológica de evaluación
La inmunohistoquímica fue llevado a cabo usando el kit Envisionþ /HRP (DakoCytomation). En resumen, los portaobjetos se sumergen en la solución de recuperación de destino (pH 9; DakoCytomation) y se hierve a 108 ° C durante 15 minutos en un autoclave durante la recuperación de antígenos. Se añadió anticuerpo CPSF4 (01:50 dilución) a cada diapositiva después de bloquear de peroxidasa endógena y las proteínas, y las secciones se incubaron con marcado con HRP anti-IgG de conejo [Histofine simple manchas MAX PO (G); Nichirei] como el anticuerpo secundario. Sustrato-chromogenwas añadido, y las muestras fueron contraste con hematoxilina. Un control negativo se obtuvo mediante la sustitución del anticuerpo primario con una IgG de conejo normal
.
Las inmunorreacciones se evaluaron de forma independiente por dos patólogos cegados a la información clinicopatológica. intensidad de la tinción nuclear fue categorizado: tinción ausente como 0, débil como 1, moderada como 2, y fuerte como 3. El porcentaje de células teñidas se accedió mediante el uso de un sistema de cinco escala de puntuación: 0 (no hay células positivas), 1 (& lt ; 25% de células positivas), 2 (25% -50% de células positivas), 3 (50% -75% de células positivas), y 4 (& gt; 75% de células positivas). La puntuación para cada tejido se calculó multiplicando la intensidad y el valor del porcentaje (el rango de este cálculo fue, por tanto, 0-12). El receptor se empleó el análisis de funcionamiento característico (ROC) para determinar la puntuación de corte para el tumor "alta expresión" utilizando el 0, 1-criterio. En pocas palabras, la sensibilidad y especificidad para la evolución de los pacientes en estudio en cada puntuación se trazó para generar una curva ROC. La puntuación fue seleccionado como el valor de corte, que era el más cercano al punto tanto con la máxima sensibilidad y especificidad. Los tumores designados como "baja expresión" para CPSF4 era aquellos con puntuaciones por debajo o igual al valor de corte, mientras que los tumores "alta expresión" eran aquellos con puntuaciones por encima del valor. Para facilitar el análisis de la curva ROC, se clasificó según las características clínico-patológicas:. Estado de supervivencia (la muerte debido a los adenocarcinomas de pulmón en comparación con censurado)
Preparación de nanopartículas de CC y la encapsulación siRNA
DOTAP-colesterol (DC) era comprado de Avanti Polar-Lipids Inc. (Birmingham, AL, EE.UU.). cloroformo de calidad de HPLC se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.) .Las nanopartículas se prepararon por un EmulsiFlex-B3 homogeneizador de alta presión (HPH) (Avestin Inc., Ottawa, Canadá) [24], [25]. Los nanosomas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 h antes de su almacenamiento durante la noche a 4 ° C.
CPSF4 siRNA y no específicos de siRNA fueron adquiridos de Shanghai Co. GenePharma (Shangai, China). Las secuencias de los siRNA-CPSF4 específica humanos fueron 5'-CAU ACG CCC UCG AUU UGA ATT-3 '(siRNA-1) y 5'-CUG GGU CAC CAA UUA GUG UTT -3' (siRNA-2); siRNA inespecífico, 5'-NVND UCC GAA UGE GUC ACG UTT-3 '. Los vectores CPSF4 sobreexpresión pcDNA3.1-CPSF4 y los pcDNA3.1 vector de control fueron diseñados y sintetizados por cyagen (cyagen Biosciences Inc., Estados Unidos). Para la entrega de siRNA o CPSF4 CPSF4 vector de expresión en células de cáncer de pulmón, el siRNA o plásmido vector se encapsulan en nanosomas DC que había validado previamente [26] - [28].
La proliferación celular y la formación de colonias de ensayo
la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo MTT (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se determinó después de la transfección con CPSF4 siRNA o CPSF4 vectores que expresan. A las 48 horas después del tratamiento, se recogieron las células (H1299 y A549), se contaron y sembraron células individuales (400 células /pocillo) por triplicado en placas de 6 pocillos. Se trataron las células con vectores que expresan CPSF4 o CPSF4 siRNA cada 3 días y se cultivaron durante 8-14 días [29]; colonias se tiñeron con cristal violeta durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se contaron las colonias que contenían más de 50 células.
in vitro invasión de ensayo
El
in vitro
ensayo de cámara de invasión se llevó a cabo con Millicell Cultivo Celular Insertar (24 pocillos PCF 8,0 l, Millipore). Brevemente, los insertos se colocan en placa de cultivo celular de 24 pocillos se recubrieron con 100 l 1 mg /ml de Matrigel Matrix (BD Falcon, EE.UU.) en suero libre de RPMI-1640 y se seca al aire. se cosecharon 48 horas después del tratamiento CPSF4 siRNA, las células (H1299 y A549), se contaron, y 100 l de medio libre de suero que contiene 5 × 10
se añadieron 4 células a la inserción. El compartimiento inferior contenía 0,5 ml de medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS. Esto se sigue de incubación en 5% de CO
2 a 37% durante 24 horas. Luego fijaron las células que penetran en la membrana hacia el lado inferior con formalina y estas células se tiñeron por cristal violeta. La invasividad de las células se determinó contando las células que penetran en el lado inferior del filtro a través de los poros bajo un microscopio con un aumento de x100. Estamos analizarse 3 veces y se seleccionaron al azar 3 campos fueron contados para cada ensayo.
Apoptosis y análisis del ciclo celular
Para la detección de la apoptosis y el ciclo celular, las células (H1299 y A549) transfectadas con siRNA eran se analizaron por citometría de flujo. A las 72 h después de la transfección, las células (1 × 10
5 células /ml) fueron teñidas con 5 l AnnexinV-FITC y 5 l PI (yoduro de propidio) utilizando un Anexina V-FITC kit /PI-tinción (Becton Dickinson, CA, EE.UU.), colocado en la temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad, y después se analizó por citometría de flujo (EPICS XL, Beckman Coulter). La apoptosis se calcula en función de la FITC-positivas en las células. Análisis del ciclo celular se realizó mediante tinción con PI. Las células transfectadas se recogieron con tripsina, se fijaron en etanol al 70% frío durante 30 minutos. Después del tratamiento con 100 mg /ml de RNasa (Sigma-Aldrich), las células se tiñeron con 50 mg /ml PI (Sigma Aldrich) en PBS. La citometría de flujo (EPICS XL; Beckman Coulter) se realizó inmediatamente. Se analizaron los datos en bruto utilizando multiciclo para Windows (Beckman Coulter).
se utilizó la prueba t de análisis estadístico
de Student para comparar dos grupos independientes de datos. La puntuación mediana tinción inmunohistoquímica se utilizó como el valor de corte para dividir los pacientes en grupos de expresión CPSF4 bajas y altas. Se aplicaron las pruebas de Chi-cuadrado para analizar la relación entre la expresión y el estado clínico patológica CPSF4. supervivencias de Kaplan-Meier se representaron gráficamente y se realizaron pruebas de log-rank. Los análisis univariados y multivariados se realizaron con el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para determinar las asociaciones entre variables clinicopatológicas y la mortalidad relacionada con el cáncer. Un
P
valor. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo en todos los casos