Extracto
Los adenovirus (Ads), especialmente HAdV-5, han sido genéticamente equipado con un potencial de replicación limitada al tumor para permitir aplicaciones en la terapia del cáncer oncolítico. Tales adenovirus oncolíticos han sido bien tolerado en pacientes con cáncer, pero su eficacia antitumoral necesita ser mejorada. En este sentido, se debe considerar que las células cancerosas, que dependen de su tejido de origen, pueden diferir sustancialmente de las células huésped normales para qué anuncios están adaptados por las interacciones virus-huésped complejas. En consecuencia, la eficiencia de la replicación viral, un determinante clave de la actividad oncolítico, podría ser subóptimo en las células cancerosas. Por lo tanto, hemos analizado tanto la cinética de replicación de HAdV-5 y el transcriptoma inducida por el virus en las células epiteliales bronquiales humanas (HBEC) en comparación con las células cancerosas. Este es el primer informe sobre el genoma en todo el perfil de expresión de anuncios en sus células huésped nativas. Hemos encontrado que la expresión de E1A y el inicio de la replicación del genoma viral son más rápidos en HBEC y un retraso considerable en las células del melanoma. En las células de carcinoma de pulmón de células escamosas, se observó intermedios HAdV-5 cinética de replicación. la producción de partículas infecciosas, la propagación viral y la actividad lítica de HAdV-5 fueron atenuadas en células de melanoma en comparación con HBEC. De perfiles de expresión en el inicio de la replicación del genoma viral reveló que HAdV-5 indujo a los cambios fuertes en el transcriptoma celular en HBEC, seguido de cáncer de pulmón y células de melanoma. Se identificaron regulación prominente de genes implicados en el ciclo celular y el metabolismo del ADN, replicación y el empaquetamiento en HBEC, que está de acuerdo con la necesidad de inducir la fase S para la replicación viral. Sorprendentemente, en células de melanoma HAdV-5 desencadenó la regulación opuestos de dichos genes y, en contraste con las células de cáncer de pulmón, no débil inducción fase S se detectó cuando se utiliza el promotor E2F como reportero. Nuestros resultados proporcionan un fundamento para la mejora de adenovirus oncolíticos, ya sea por adaptación de la infección viral a las células diana tumorales o mediante la modulación de las funciones celulares de tumor para apoyar mejor la replicación viral
Visto:. Dorer DE, Holtrup F, Fellenberg K, Kaufmann JK , Engelhardt S, Hoheisel JD, et al. (2011) Replicación y transcriptoma inducida por virus de HAdV-5 en células huésped normales frente a células de cáncer - Las diferencias de relevancia para adenovirus oncolisis. PLoS ONE 6 (11): e27934. doi: 10.1371 /journal.pone.0027934
Editor: Maciej S. Lesniak, La Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Junio, 2011; Aceptado: 28 Octubre 2011; Publicado: noviembre 30, 2011
Derechos de Autor © 2011 Dorer y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Asociación Helmholtz de Centros nacionales de Investigación (Helmholtz-Universidad Grupo de subvención), el Programa Intramural del Centro alemán de Investigación Oncológica (DKFZ, Deutsches Krebsforschungszentrum) y por becas de la Escuela Internacional de Helmholtz para la Investigación del cáncer de la DED, FH, y JKK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los adenovirus (Ads) son agentes terapéuticos de cáncer en base a su potencia de infectar y lisar células cancerosas emergente, un proceso denominado oncolisis viral [1], [2]. Este régimen presenta un efecto de amplificación único como las células tumorales infectadas producen virus de la progenie que se propagan a la infección en el tumor. Una ventaja adicional es que el modo de acción de Anuncios oncolíticos se diferencia de las terapias convencionales, a la que las células de cáncer con frecuencia desarrollan resistencia. La restricción de la replicación del virus a las células tumorales es esencialmente necesario para la aplicación de Anuncios en la terapia del cáncer. En este sentido, el amplio conocimiento de la estructura del anuncio, la organización del genoma y el ciclo de replicación combinada con tecnologías para la ingeniería anuncio facilita el desarrollo racional de Anuncios oncolíticos [2], [3]. De hecho, los virus oncolíticos con selectividad del tumor en circulación han sido diseñados en base a la estrecha relación HAdV-2 y HAdV-5. Esto se logró mediante la mutación de cualquiera de las funciones de genes que se complementan en las células cancerosas, pero no en las células normales, o por la orientación de la expresión de genes virales esenciales para las células tumorales [1], [2], [4]. Varios ensayos clínicos han demostrado que este tipo de anuncios Engineered son bien tolerados por los pacientes, pero que su potencia terapéutica necesita mejoras [5], [6]. En este contexto, la oportunidad para la ingeniería racional de Anuncios es de nuevo una ventaja clave, ya que facilita el desarrollo de agentes oncolíticos avanzados. En consecuencia, los estudios para mejorar la entrada de Ad en células cancerosas o para insertar genes terapéuticos en se han reportado Anuncios oncolíticos [2], [7], [8].
oncolisis adenoviral requiere la replicación de Ad eficiente en células de cáncer específicas. El trabajo previo en el campo no ha considerado adecuadamente que las células cancerosas, que dependen del tejido de origen, pueden diferir sustancialmente de las células huésped Ad normales. Por lo tanto, el virus no viene a través del entorno celular que se adapta a las interacciones integrales de células virus-huésped. En consecuencia, la replicación de AD, la lisis celular y propagación pueden ser subóptima. Específicamente, HAdV-2 y -5 están adaptados evolutiva de replicarse en las células epiteliales de las vías respiratorias [9], pero se están desarrollando para la terapia de una gran variedad de dianas tumorales. De hecho, se han notificado mutaciones de HAdV-5 que aumentan la replicación del virus y la propagación en células tumorales [10] - [12]. Un ejemplo es la eliminación de
E1B19K
, que tiene actividad anti-apoptótica. Supresión de
E1B19K
se ha traducido en fuerte aumento de la replicación HAdV-5 y oncolisis en células de cáncer de pulmón. Sin embargo, la reducción de la replicación se ha informado en las células cancerosas derivadas de otros tejidos, incluyendo las células de melanoma [11], [13] - [15]. Estas observaciones apuntan de nuevo al tipo de célula dependencia de las interacciones de células Ad-anfitrionas y, en consecuencia, la eficacia de replicación de anuncio: Diferencias en la programación de la apoptosis entre las células normales y cancerosas, sino también entre diferentes células de cáncer causa más probable de la diferente permisividad a
E1B19K
-eliminado HAdV-5.
Como parásitos intracelulares obligatorios Anuncios dependen de la producción de energía celular y la maquinaria biosintética. De hecho, anuncios han implementado diversos mecanismos moleculares y complejos para establecer las condiciones en la célula huésped que asegurar la reproducción del virus eficiente. Éstos son los más estudiados para HAdV-2 y -5 ([16], [17] y las referencias en él). Correspondientemente, los productos de la expresión génica viral temprana - además de proporcionar las proteínas necesarias para la replicación del genoma viral - manipular el entorno celular para apoyar la replicación del virus por múltiples mecanismos, especialmente por la modulación directa e indirecta de la transcripción celular ([17] - [19] y las referencias en él). El primer gen viral expresado durante la infección Ad es E1A, que codifica una familia de proteínas que resultan de corte y empalme alternativo. proteínas de E1A inducen la expresión de otros genes dC y manipular la transcripción de genes celulares, directa o indirectamente [20], [21]. La proteína E1A más grande (13S) contiene un dominio de transactivación potente que induce la transcripción de E1A cuando interactúa con las proteínas de unión al ADN. Ambas proteínas 13S y 12S del E1A se unen a pRb, lo que resulta en la liberación de factores de transcripción E2F de los complejos pRb-E2F. Las proteínas E2F continuación, activan la transcripción de genes virales y celulares a través de sitios de unión E2F-([17], [19], [22], [23] y las referencias en él). E2Fs ampliamente inducen genes celulares implicados en la fase S del ciclo celular, que también son necesarios para la replicación del genoma Ad. Otras actividades de la transcripción de las proteínas E1A están mediados por la interacción con un panel de factores celulares que inhiben o activan la transcripción, por ejemplo acetilasas histonas ([17] y las referencias en él). Otra proteína temprana anuncio, E1B55K, contiene un dominio de transcripción fuerte represión. Por unión al dominio de transactivación de p53, se cambia funcionalmente p53 a partir de un activador de la transcripción a un represor [24]. Además, E1B55K junto con E4ORF6 degradación de activación de p53 [25]. El cierre resultante de los genes pro-apoptóticos sensible a p53 contrarresta la inducción de la apoptosis desencadenada por la estimulación anormal del ciclo celular por el E1A.
El conocimiento excepcional de la infección Aviso ha sido adquirida por extensos estudios que eran en su mayoría realizado con otras células de cáncer de HAdV-2 o -5 en HeLa y y centrado en los genes de anuncios individuales [17]. Por lo tanto, la infección por el anuncio en su entorno normal de las células huésped nativas, por ejemplo, células epiteliales primarias de las vías respiratorias para HAdV-5, hasta ahora poco estudiado (la mayoría de estos estudios analizaron la selectividad de Anuncios oncolíticos, véase el debate). Tenga en cuenta que las células HeLa se diferencian de las células huésped Ad normales, ya que son de origen cáncer de cuello uterino y han sido ampliamente pases. Por otra parte, contienen genes de virus del papiloma humanos que afectan a las funciones celulares importantes para la replicación de Ad. Los estudios que investigan cómo los genes individuales Ad afectan las funciones celulares no tienen en cuenta la compleja red de interacciones virus-huésped durante la infección por el virus. En este sentido, la tecnología de microarrays representa una poderosa herramienta para el seguimiento de todo el genoma de la expresión de genes celulares reprogramados durante la infección por Ad. De hecho, los estudios de microarrays anteriores han revelado que HAdV-2 y -5 infecciones objetivos múltiples vías celulares [26] - [30]. Estos estudios se han realizado con células HeLa y fibroblastos primarios. Cómo infecciones Ad modulan la expresión de genes en todo el genoma de sus células huésped nativas no se ha investigado hasta la fecha. En consecuencia, un análisis comparativo de los perfiles de expresión de genes inducidos por el anuncio de las células tumorales frente a las células anfitrionas anuncio nativas, lo cual es de interés para el desarrollo de Anuncios oncolíticos, no está disponible hasta la fecha.
En este estudio, por tanto, hemos explorado cómo la infección de las células cancerosas anuncio difiere de la infección con Ad de sus células huésped normales. Con este fin, se realizó un análisis comparativo de HAdV-5 cinética de replicación y la actividad lítica en las células epiteliales bronquiales primarias, células de carcinoma de células escamosas de pulmón y células de melanoma. Elegimos este conjunto de células, ya que representan las células normales HAdV-5 anfitrionas, células de tumores derivados de HAdV-5 células huésped y células tumorales derivadas de un tipo de célula no relacionado, respectivamente. Posteriormente, se realizó un genoma en todo el perfil de la expresión de HAdV 5-infección en células epiteliales bronquiales normales y células tumorales. las diferencias del tipo de célula dependientes en el transcriptomes celulares inducidas por HAdV-5 se evaluaron mediante análisis bioinformático.
Resultados
lítica potencia y la eficiencia de la replicación HAdV-5 en células epiteliales bronquiales humanas normales y el cáncer células
En primer lugar, se evaluó si la eficiencia de HAdV-5 lisis celular propagación dependiente de la replicación y la diferencia entre HAdV-5 células huésped nativas y las células cancerosas. Se utilizaron células humanas primarias epiteliales bronquiales (HBECs) en nuestro estudio, ya que representan los nativos HAdV-5 células huésped del epitelio respiratorio más de cerca. Ellos se compararon con las células de cáncer de pulmón SK-MES-1, SW900 (tanto de carcinoma de células escamosas), y A549 (adenocarcinoma), a células de melanoma Las células normales primarias más humanos SK-MEL-28 y Mel624, y para, es decir, fibroblastos y queratinocitos . En un ensayo de citotoxicidad, se observó que la lisis celular propagación dependiente de HAdV-5 fue igualmente eficientes en HBECs, SW900 y las células A549, pero atenuada en SK-MES-1 en las células y aún más en las dos líneas celulares de melanoma (Fig. 1A ). Citotoxicidad de HAdV-5 para queratinocitos fue similar a HBECs, mientras que no se observó muerte celular por fibroblastos primarios en el momento de la medición. Estos resultados muestran claramente que lítico potencia de HAdV-5 es del tipo de célula dependiente y puede ser fuertemente reducida en las células de cáncer en comparación con HBECs. De nota, la reducción de potencia lítica de HAdV-5 en células SK-MEL-28 y Mel624 no se puede atribuir a la celda viral ineficiente de unión y la entrada, ya que estas células mostraron una fuerte expresión de la CAR receptor HAdV-5 (Fig. S1) y eran incluso más susceptibles a la transducción por un HAdV-5 vector de replicación deficiente que HBECs, A549 y células SW900 (Tabla S1). Esto es una clara evidencia de que la reducción de la actividad lítica de HAdV-5 en células de melanoma se determina en un paso posterior a la entrada de la replicación del virus. Por el contrario, los fibroblastos carecían de expresión de CAR y eran difíciles de transducir. Como las células se tiñeron 8 días después de la infección, lo que permite varias rondas de replicación del virus, los resultados de el ensayo de citotoxicidad indican diferencias en la eficacia de HAdV-5 la replicación y la propagación entre las células de melanoma y HBEC. Por lo tanto, el próximo compararon HAdV-5 replicación en HBECs, SW900 y SK-MEL-28 más directamente mediante la cuantificación de la producción de partículas de virus infeccioso durante una ronda de replicación (Fig. 1B). la producción de partículas de virus infecciosas por HBECs era & gt; 100 veces más alta que para SK-MEL-28 a las 36 h y 48 h después de la infección. Los títulos de virus alcanzó su punto máximo de HBEC a las 48 horas, mientras que continuaron aumentando hasta 72 h para SK-MEL-28, cuando alcanzaron un máximo de un título sigue siendo inferior a la de HBECs. la producción de partículas infecciosas por las células SW900 mostró una cinética similar a HBECs, pero se mantuvo aproximadamente 10 veces menor. Concluimos que HAdV-5 se retrasa la replicación en las células SK-MEL-28 en comparación con HBECs y células SW900, que esté de acuerdo con los datos de citotoxicidad
(A) Citotoxicidad:. Varios tipos de células se infectaron con cualquiera el tipo silvestre HAdV-5 (
en peso) o el virus de control de replicación deficiente HAdV 5-CMV-GFP (
gfp
) a las MOI de 10
1 a 10
-4 TCID
50 /célula. Las células fueron células humanas primarias epiteliales bronquiales (HBEC, se muestran las células de uno de los dos donantes que dan resultados similares), carcinoma de células escamosas del pulmón (SK-MES-1, SW900), adenocarcinoma de pulmón (A549), el melanoma (SK-MEL -28, Mel624) primarios de prepucio humano (HFF) fibroblastos y queratinocitos humanos primarios (PHK). Después de la incubación durante ocho días, las células supervivientes se fijaron y se tiñeron con cristal violeta. las células pulmonares (
paneles de la izquierda
) mostraron citotoxicidad global más fuerte en comparación con las células de melanoma (
paneles medias
). (B) de replicación: HBEC, SW900 o SK-MEL-28 células se infectaron con 1 TCID
50 /célula de HAdV-5. Después de una hora de incubación, los inóculos se retiraron y las células se lavaron tres veces. Las células y los sobrenadantes se recogieron a intervalos de tiempo indicados y partículas de virus infecciosos se cuantificaron mediante la determinación de TCID
50. Las barras representan valores medios de las infecciones por triplicado y las barras de error desviaciones estándar. Los asteriscos indican la significación estadística (
p = 0.05
) de las diferencias entre SK-MEL-28 y HBEC, así como SK-MEL-28 y SW900 (*), o entre SW900 y HBEC (**). Los aumentos de los títulos virales fueron significativas (
p = 0.05
) para HBEC hasta 48 h, y para SK-MEL-28 hasta 72 h después de la infección. Para SW900 títulos virales mostraron ningún aumento significativo después de 36 h (
p = 0,056 para 48 h frente a 36 h
).
Cinética de la expresión génica viral y la replicación del genoma de HAdV-5 en HBECs y células de cáncer de
a continuación se investigó la cinética de HAdV-5 replicación en HBECs y las células cancerosas en más detalle mediante la cuantificación de la expresión génica viral y la replicación del genoma (Fig. 2). Como se utilizaron estos experimentos para definir el punto de posterior de perfiles de expresión génica de tiempo, que se realizaron con los procedimientos correspondientemente estandarizados, es decir, células se cultivaron en medio de crecimiento de microarrays y se infectaron con los títulos de virus resultantes en la eficiencia de infección del 80% para cada tipo de célula (Tabla S1). El inicio de la replicación del ADN viral se retrasó por las células del melanoma (SK-MEL-28, 20 h; Mel624, 24 h) células (20 h) y 1 SK-MES-en comparación con las células SW900 (16 h) y HBEC (16 ho 12 h, dependiendo de la donante) (Fig. 2B). fibroblastos primarios mostraron una tarde (24 h), pero primaria queratinocitos una (16 h) la aparición temprana de la replicación del ADN viral. Estas diferencias en HAdV-5 cinética de replicación entre los tipos de células correlacionan bien con diferencias de lisis viral y la producción de partículas infecciosas (véase la Fig. 1). Análisis de E1A mRNA expresión cinética reveló que las diferencias en el inicio de la replicación del ADN entre los tipos de células reflejan diferencias correspondientes en la expresión del gen temprano: HBEC, SW900 y queratinocitos mostraron un rápido inicio de la expresión de E1A mRNA alcanzar niveles casi máximos a las 8 h después de la infección . En contraste, para las células de melanoma, SK-MES-1 y fibroblastos un aumento más lenta y continua en la expresión de E1A mRNA se observó (Fig. 2A). La razón de las diferencias en la expresión de E1A entre las líneas celulares no está claro. experimentos de transfección transitoria con un plásmido indicador que contiene la primera 557 pb del HAdV-5 genoma no revelaron diferencias importantes en la actividad E1A potenciador /promotor entre tipos de células (Fig. S2). la expresión del gen viral Late refleja la cinética de la replicación del genoma viral, como se esperaba (Fig. 2C). Concluimos que HAdV-5 replicación y lisis son considerablemente más rápida en HBECs que en las células de melanoma. La replicación y lisis en células de cáncer de pulmón es, depende de la línea celular, el rápido o intermedio. Para otras células primarias, la cinética de replicación eran dependientes del tipo de células: queratinocitos epiteliales mostraron fibroblastos rápidos y mesenquimales, como se informó antes [27], [30], mostraron cinética de replicación lenta
células primarias humanas (
paneles de la izquierda
) y líneas celulares tumorales (
paneles de la derecha
) fueron infectados con HAdV-5 en los títulos resultantes en la eficiencia de la infección por el 80% (
ver
Fig. 1
para los nombres de los tipos de células; d1 HBEC, HBEC d2 son HBEC de diferentes donantes
). Inóculos se retiraron después de una hora de incubación. El ARN total y el ADN se recogió por cada punto de tiempo indicado y se analizó para E1A (A) y de fibra de niveles (C) de ARNm y para copias virales del genoma (B), respectivamente, por qPCR. Los resultados de los experimentos representativos se muestran; experimentos de repetición produjeron puntos de tiempo idénticos para el inicio de la expresión de E1A y el ARNm de la fibra y la replicación del genoma de virus. Para HBEC d2, el número de copias del genoma no se determinaron a 20 h y 24 h, a causa de un número limitado de células de este donante.
Análisis comparativo de los cambios inducidos por HAdV-5 a la expresión de genes celulares en las células de cáncer en comparación con HBECs
a continuación se investigó si la expresión de genes celulares es diferente afectada por la infección con Ad en el cáncer frente a las células normales. Por lo tanto, se realizó un análisis comparativo de HAdV-5 cambios de infección inducida en transcriptomes de HBECs (2 donantes diferentes), células de cáncer de pulmón de células escamosas (SK-MES-1, SW900) y células de melanoma (SK-MEL-28, Mel624 ). Las células se cultivaron usando condiciones y medios de comunicación normalizados (véase Materiales y Métodos para detalles) y se infectaron con HAdV-5 a títulos resultantes en la eficiencia de transducción de 80% para cada tipo de célula o fueron modelo de infectados. Las células fueron cosechadas en el punto de inicio de la replicación del genoma viral tiempo, porque en ese momento se esperaba que los cambios fundamentales en el transcriptoma celular en la preparación de la replicación del ADN viral. Por otra parte, estudios previos han mostrado menos cambios en los puntos de tiempo anteriores para otras células [27], [28], [30]. Por elegir este punto de tiempo para cada célula de tipo individual, de acuerdo con la cinética que se muestran en la Fig. 2, podríamos ajustar las diferencias en la cinética de replicación virales entre los tipos de células. El ARN total se purificó y se utiliza para perfiles de expresión. están disponibles en línea los datos de microarrays en la base de datos ArrayExpress (número de E-MEXP-3125). Durante el análisis bioinformático la expresión génica en muestras no infectadas se definió como estado estable y se compara con los niveles de expresión de genes en muestras infectadas. De esta manera, se determinó el transcriptoma celular inducida por el virus, es decir, cambios de expresión génica de la infección específica para cada tipo de célula individual sin crear un sesgo a través de variaciones de tipo de células entre otras por diferentes orígenes genéticos (véase Materiales y Métodos para más detalles).
Nos encontramos los cambios fuertes en la expresión génica por HAdV-5 infección en HBECs, seguido de las células del cáncer de pulmón, mientras que la expresión de genes se ve mucho menos afectado por la infección HAdV-5 en células de melanoma (véase también el análisis de correspondencias en la Fig. S3). Tanto el número de genes celulares regulados de manera significativa por HAdV 5-infección (Tabla 1) y las veces los cambios en la expresión génica (ArrayExpress, E-MEXP-3125) fueron más altos para HBECs y eran más bajo para las células del melanoma. Estos resultados se correlacionan con la eficacia de la replicación del HAdV-5 para estas células: HBECs mostraron tanto más eficiente la replicación HAdV-5 y más fuerte de la expresión génica inducida por el virus, mientras que para las células del melanoma ambas eficiencia de replicación y los cambios inducidos por virus en la expresión génica fueron los más bajos.
a medida que el perfil de expresión de la infección con Ad de células epiteliales respiratorias normales no se ha informado antes, se evaluó por primera vez el transcriptoma celular inducida por HAdV-5 en HBEC. Nuestros resultados muestran la inducción de genes implicados en la replicación del ADN y el ciclo celular, la organización de la cromatina, y el metabolismo de nucleótidos, mientras que los genes implicados en la diferenciación, la regulación (en su mayoría negativo) de la proliferación, y la regulación de la muerte celular fueron reprimidos (Tabla 2 y la Tabla S2).
A continuación, se comparó la expresión de genes firmas de HAdV-5 en la infección HBECs y las células cancerosas por diferentes análisis bioinformáticos. La agrupación jerárquica de genes regulados diferencialmente de los cinco tipos de células analizadas destacó dos grupos de genes que muestran la regulación de oposición en células de melanoma en comparación con HBECs, es decir, genes que son inducidos en HBECs, pero reprimida en una o ambas de las líneas celulares de melanoma (enmarcado en la figura . 3A, ampliada en la Fig. S4). Curiosamente, el grupo más grande muestra una acumulación muy significativa de genes implicados en la replicación del ADN, el metabolismo de nucleótidos, la regulación del ciclo celular y la respuesta al daño del ADN (Fig. 3B), que también se encontraron en el grupo más pequeño (aquí importancia de la acumulación no se alcanzó porque del pequeño número de genes). genes seleccionados se listan en la Tabla 3. Estas funciones celulares se han notificado ampliamente ser inducida por la infección con Ad [17] y estos grupos contienen varios de los genes más fuertemente inducidos en HBECs (véase la Tabla 2). Por lo tanto llama la atención que HAdV-5 falla para inducir o con frecuencia incluso reprime estos genes /funciones celulares en las células del melanoma. Los datos de expresión génica obtenidos por el análisis de microarrays se validaron mediante PCR cuantitativa (Fig. S5). Como otros bioinformática enfoque para identificar vías celulares más regulados diferencialmente por HAdV 5-infección de células de melanoma en comparación con HBECs, se realizó un análisis de la vía El ingenio de los datos de expresión génica. Identificamos la red de transición G1 /S fase de reglamentación con genes pro-S clave (
E2F
,
CCNE
,
CDK2
,
Cdc25A
) indujo en HBECs, pero reprimido o no regulada en células de melanoma (Fig. S6). Llegamos a la conclusión de que HAdV-5 infección de las células de melanoma no induce un panel de genes de fase S implicados en la regulación del ciclo celular, el metabolismo de nucleótidos y la replicación y reparación del ADN, que son inducidas en los HAdV-5 células nativas, HBEC.
(a) la agrupación jerárquica de genes utilizando Multi-Experimento de visualización (
MeV 4.5.1
) basado en el aprox. 1000 genes regulados significativamente mayor (
ver
Materiales y Métodos
de los criterios de filtración de datos
). Grupos de genes que muestran la regulación por oponerse HAdV-5 HBEC infección en comparación con las células del melanoma están enmarcadas. Aumentos de estos grupos se presentan en la Fig. S4. (B) Las listas de los genes dentro de grupo 2 fueron sometidos a análisis de genes ontología utilizando la base de datos para anotación, y Visualización Integrada Discovery (
DAVID;
david.abcc.ncifcrf.gov). P-valores de los términos de GO fueron corregidos para múltiples ensayos utilizando el algoritmo de Benjamini-Hochberg.
Análisis de la inducción de fase S por HAdV-5 infección usando el promotor E2F-1 como reportero
Como perfiles de expresión génica indicó que HAdV-5 falla para inducir los genes implicados críticamente en procedimientos en fase S en células de melanoma, a continuación realizó un ensayo biológico independiente para investigar S fase de inducción por HAdV 5-infección. El promotor E2F-1, que está fuertemente inducida durante la fase S, se utilizó como un reportero para la entrada en la fase S inducida por Ad [31]. HBEC, SW900, SK-MES-1, A549, SK-MEL-28 y Mel624 células fueron transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa que contenían el promotor E2F-1 o el promotor de SV40 constitutivo como control. Las células transfectadas se superinfectaron posteriormente, ya sea con HAdV-5 o con HAdV-5 CMV-GFP como control de virus con deleción de E1, de replicación deficiente. La cuantificación de la expresión del gen indicador (Fig. 4) reveló que en las células de cáncer de pulmón, la infección con HAdV-5 induce el promotor E2F-1, pero no el promotor de SV40, mucho más fuerte que el control de virus de replicación deficiente. Por el contrario, E2F-1 promotor de la inducción por HAdV-5 infección era mínimo o inexistente en las células del melanoma. Estos resultados están de acuerdo con nuestro perfil de expresión génica de datos y muestran que S fase de inducción por HAdV-5 es eficiente en HBEC, pero pobre en células de melanoma.
luciferasa plásmidos de gen indicador (A) que contienen E2F-1 o fragmentos de promotor de SV40 se transfectaron en las líneas celulares indicadas. Después de 24 horas, las células se infectaron con HAdV-5 (
peso
) o de replicación deficiente HAdV-5 CMV-GFP (
gfp
) a títulos resultantes de la infección 80%. La actividad de luciferasa se cuantificó veinte horas después de la infección. Las columnas representan los valores medios de las transfecciones por triplicado /infecciones y las barras de error reflejan la desviación estándar. Los asteriscos indican la significación estadística para las comparaciones de HAdV-5 con HAdV 5-CMV-GFP (
* p = 0.05, p≤0.01 **, *** p≤0.001
). (B) Representación diferente de los datos que se muestran en el panel A:. Pliegue del cambio en la actividad promotora por HAdV-5 en comparación con HAdV 5-CMV-GFP
Discusión
infección por Ad productivo es depende de un entorno celular que soporta las diferentes etapas del ciclo de replicación viral. Por lo tanto, anuncios han desarrollado estrategias para manipular el ambiente celular en células huésped. proteínas virales tempranas y principios de inmediato establecer una red compleja de interacciones con las funciones de la célula huésped con el fin de contrarrestar las defensas del huésped e inducir vías celulares necesarios para la replicación del genoma viral. Esto incluye la re-programación de la expresión génica celular. A continuación, describimos por primera vez el HAdV-5 transcriptoma la infección inducida por HBECs, en representación de sus células huésped nativas. Se determinó primero la cinética de HAdV-5 replicación en HBECs, que es como sigue: la expresión de E1A se inicia antes de 4 horas después de la infección (h.p.i.) y alcanza una meseta a 8 h.p.i .; el primer incremento en virales del genoma y de ARNm de fibra de copias se produce a 8 o 12 hpi, dependiente del donante, y la producción de partículas infecciosas alcanza una meseta a 48 hpi. Esto es seguido por una propagación eficiente del virus en la monocapa de células, como se observa por la citotoxicidad ensayo después de la infección con títulos bajos. Genoma en todo el perfil de la expresión de HBECs infectados por el HAdV-5 en el inicio de la replicación del genoma viral, cuando se espera que las principales modificaciones a la célula huésped por los genes virales tempranos, reveló un aumento significativo en la expresión de 424 y una disminución de 519 de 18631 evaluado genes. De este modo la represión de genes era prominente en este punto de tiempo, incluso teniendo en cuenta que es más difícil de detectar que la inducción de genes debido a la media vida de mRNA presente antes de la infección. Los genes implicados en el ciclo celular, la replicación del ADN, y organización de la cromatina de nucleótidos metabolismo se acumularon en la población de genes upregulated. Esto incluyó
E2F-2
, que muestra el mayor aumento en la expresión de ARNm (11,5 veces),
CCNE1
y
CCNE2 gratis (ciclina E1 y E2; 7.9- y 6.2 -fold),
RRM2 gratis (ribonucleótido reductasa M2; 5,2 veces),
CDC25A gratis (3,5 veces),
MCM2
,
7 Opiniones y
10 gratis (3-, 3.3- y 3.3 veces),
EXO1 gratis (exonucleasa 1; 3,1 veces),
RFC3
y
4
(factor de replicación C3 y 4; 2,8 y 2,1 veces),
PCNA gratis (antígeno de proliferación celular nuclear; 2,2 veces) y varios histona, factor de ensamblaje de la cromatina y los genes centrómero. Estos resultados están de acuerdo con estudios anteriores que han establecido, aunque en otros tipos de células, que S inducción de fase en células de AD infectadas se requiere para la replicación viral de proceder. El número de genes y las tasas de inducción que reportamos podría ser aún subestimado, ya que no se ha sincronizado HBECs antes de la infección con el fin de permitir una comparación válida para las células cancerosas. Los genes con actividad en la diferenciación, la regulación negativa de la proliferación (incluyendo
CDKN1A
; -2.9 y
CDKN2B
; -2,73), y la regulación de la muerte celular se acumularon en la población de genes reprimidos (más fuerte era la represión de la hormona paratiroidea similar a las hormonas, 16,1 veces). Es de destacar, que no identificó la acumulación de genes implicados en la inmunidad en la reserva genética regulada por incremento
.
HAdV-5 infección rara vez se ha investigado en las células epiteliales respiratorias normales antes. Varios estudios de los anuncios oncolíticos han comparado las células epiteliales respiratorias principalmente con células tumorales en ensayos de citotoxicidad y la producción de partículas infecciosas para evaluar la selectividad y eficacia de los mutantes de virus [32] - [39]. Estos estudios han demostrado que la producción de infecciosas HAdV-5 partículas en las células epiteliales respiratorias primarias es eficiente y picos alrededor de 48 h p.i. [37], [39], que está de acuerdo con nuestros resultados.
Los estudios previos sobre perfiles de expresión de la infección con Ad se han realizado con células HeLa y fibroblastos humanos. Para las células HeLa, se informó de la infección HAdV-2 a una MOI 100 para regular 76, 60, o 382 genes más de 1,5 veces a las 6 h, 10 h o 20 hpi, respectivamente (12.000 se analizaron a 6 h, 7.500 genes en 10 hy 20 h) [26], [28]. Otro estudio encontró 75 de 4.600 genes regulados más de dos veces por HAdV-5 a 24 h.p.i. de células HeLa [40]. Si el menor número de genes regulados en comparación con HBECs en nuestro estudio se debe a la transformación de las células HeLa es difícil de juzgar debido a las diferencias en la metodología. En este sentido, nuestro estudio mostró un menor número de genes regulados por las dos líneas celulares de cáncer de pulmón y melanoma en comparación directa con HBECs (véase más adelante). Se informó S genes de fase para ser inducida por la infección con Ad en células HeLa, incluyendo
CDC25A gratis (1,8 a las 10 h),
UNG gratis (1,6) y los genes de las histonas [28], que nos pareció también en HBECs. Solapamientos también se encuentran en los genes regulados negativamente:
MYC
(-1,9 frente a -2,4 en HBEC);
THBS1 gratis (trombospondina-1; -2.6 -9.4 en comparación con HBEC);