Extracto

Antecedentes

La respuesta de las células epiteliales al estrés implica la transmisión de señales entre las células contiguas que se pueden visualizar como una onda de calcio. En algunos tipos de células, esta onda depende de la liberación de trinucleótidos extracelulares de las células lesionadas. En particular, el ATP extracelular se ha informado que son críticos para la respuesta de las células epiteliales a la tensión y recientemente se ha demostrado ser upregulated en tumores
in vivo
.

Metodología /Principales conclusiones

a continuación, identificamos stanniocalcin-1 (STC1), una proteína secretada pleiotrophic, como un mediador crítico de calcio propagación de ondas en monocapas de pulmonar (A549) y de próstata (PC3) células epiteliales. La adición de STC1 mejorada y el bloqueo de STC1 disminuyó la distancia recorrida por una onda de calcio dependiente de ATP extracelular. Se observaron los mismos efectos cuando el calcio se estimuló mediante la adición de ATP exógeno. Descubrimos un bucle de retroalimentación positiva en la que STC1 promueve la liberación de ATP a partir de células
in vitro
y
in vivo
.

Conclusiones /Importancia

La resultados indicaron que STC1 juega un papel importante en la respuesta temprana a la lesión mecánica de las células epiteliales mediante la modulación de la señalización de ATP extracelular. Este es el primer informe para describir STC1 como modulador o señalización de los receptores purinérgicos

Visto:. Bloquear GJ, DiMattia GD, Prockop DJ (2010) Stanniocalcin-1 regula la ATP extracelular inducida por las ondas de calcio en las células cancerosas epiteliales humanas mediante la estimulación ATP liberación de las células Espectador. PLoS ONE 5 (4): e10237. doi: 10.1371 /journal.pone.0010237

Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido

Recibido: 16 de diciembre de 2009; Aceptado: March 16, 2010; Publicado: 20 Abril 2010

Derechos de Autor © 2010 Block et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Con el apoyo de NIH subvenciones P40 RR 17447 y HL P01 075161. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no compiten existen intereses.

Introducción

Stanniocalcin-1 (STC1) es una proteína de ácido amino 247 que se secreta a partir de células como un homodímero glicosilado. STC1 fue descrito originalmente como un regulador endocrino de la homeostasis del calcio y fosfato en el pescado [1], [2]. En los vertebrados, STC1 puede regular el metabolismo mineral [3] a través de su modulación de resorprtion fosfato en el riñón [4] y el intestino [5]. STC1 también estaba implicado en el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa [6], la inhibición de la migración de macrófagos
in vitro
[7] y
in vivo
[8], la prevención de permeabilización vascular [9], y tanto los efectos pro-y anti-apoptóticos [10], [11], [12]. Hasta la fecha, no se ha establecido un mecanismo por el cual STC1 ejerce sus efectos pleiotrópicos. Más recientemente, se ha hecho evidente que STC1 es un factor de respuesta de estrés (Chang et al., 2003), consistente con las observaciones recientes de que la transcripción STC1 es rápidamente hasta reguladas siguiente señales perjudiciales [10], [13], [14] .

el papel de STC1 en la homeostasis del calcio y la lesión de tejidos sugiere que puede estar involucrado en el movimiento de calcio y de señalización que se activan por una variedad de esfuerzos mecánicos y de otro tipo a las células. Por ejemplo, la reparación de las monocapas epiteliales siguiente disrupción mecánica depende de una onda de calcio intercelular propagado desde el lugar de la interrupción de las células adyacentes [15], [16], [17], [18], [19]. La propagación de la onda de calcio se ha atribuido ya sea para la transferencia mediada brecha de la salida de calcio o de bajo peso molecular segundos mensajeros, o para la liberación de los nucleótidos intracelulares de las células dañadas, que luego se unen a los receptores en las células vecinas [20], [ ,,,0],21], [22]. Varios informes han demostrado que extracelular trifosfato de adenosina (ATP) promueve la reparación en los cultivos interrumpidos mediante la estimulación de la migración y proliferación de las células epiteliales [15], [18]. Recientemente, aumento de los niveles de ATP extracelular se visualizaron en el desarrollo de tumores
in vivo
, y pueden contribuir a la supervivencia de células de cáncer [23].

nucleótidos extracelulares modulan el calcio intracelular mediante la unión a una familia de receptores llamados receptores purinérgicos P2, cada uno de los cuales tiene una afinidad diferente para los nucleótidos específicos. Hay dos subclases de receptores P2: los canales P2X triméricas cerradas de iones y proteínas G receptores P2Y acoplados (GPCRs). La unión a un receptor P2X conduce a un cambio conformacional en el canal que permite la entrada de calcio y otros iones, mientras que P2Y es un receptor acoplado a proteína G que utiliza la energía de GTP-hidrólisis para fosforilar phospolipase C (PLC) tras la unión del ligando . PLC se puede escindir el lípido, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), en inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacil-glicerol (DAG). IP3 se une canales específicos de iones de calcio en el retículo endoplasmático de la liberación de calcio en el citosol. De los 12 receptores P2Y, solamente P2Y
2 se ha demostrado que tanto el ATP se unen y la pareja con la subunidad G
q proteína G para iniciar la liberación de calcio desde los depósitos intracelulares [24].

Aquí se demuestra que el tratamiento previo de las células epiteliales en cultivo en monocapa con STC1 mejora considerablemente la propagación de ondas de calcio siguiente disrupción mecánica de las culturas. La misma mejora se observó cuando las células fueron pretratadas con STC1 y se expusieron a exógeno ATP. Ofrecemos pruebas de que STC1 sensibiliza las células a ATP aguas arriba del PLC, y que el bloqueo de STC1 endógena utilizando un anticuerpo neutralizante inhibe la progresión de la onda de calcio. Este trabajo proporciona la primera evidencia de que STC1 puede modular la señalización de un evento temprano después de una lesión mecánica, e implica STC1 como regulador de la señalización de los receptores purinérgicos.

Resultados

STC1 calcio mejorada propagación de las ondas mecánicas Siguiendo la estimulación de las células A549

para investigar el efecto de la modulación STC1 de calcio inducida por la lesión, monocapas confluentes de células epiteliales del pulmón (A549) fueron estimulados mecánicamente para iniciar una ola de calcio. propagación de la onda se visualizó por pre-incubación de la monocapa con un colorante permeable membrana que fluoresce en la unión del calcio (Fluo-4).

Figura 1A (Película S1 y S2) muestra imágenes representativas de la propagación de una onda de calcio originario del sitio rascado a las células adyacentes más de 30 segundos. La distancia se cuantificó mediante la medición de la distancia entre el sitio de corte y el borde delantero de la onda de calcio en cada punto de tiempo. El tratamiento previo de las monocapas con STC1 resultó en un aumento de 4 veces de propagación de la onda de calcio en 40 segundos post-rascado (Figura 1B) que continuaron para propagar más allá de la 40 s punto de tiempo (Película S2). Para probar si el efecto era tipo específico de célula, repetimos estos estudios en una línea celular de cáncer de próstata (PC3; película S3, S4). STC1 también mejoró propagación de la onda de calcio en las células PC3.

A) monocapas A549 confluentes se marcaron con Fluo-4 y pre-incubaron con o sin 500 ng /mL para STC1 10 min antes de la rotura mecánica. Se muestran las imágenes obtenidas -1, 0, 10, 20 y después de la interrupción 30 s. Las imágenes de cada grupo fueron manipulados por igual el uso de la función de umbral en Adobe Photoshop con el fin de falso color de la ola de claridad (rojo). La flecha señala el borde de ataque de la ola. B) La distancia media recorrida por la onda de calcio con el tiempo en el control y grupos de tratamiento STC1 de barras de error = A. SD. * = P & lt; 0,05. n = 5 películas. C) media máxima distancia alcanzada por la onda de calcio con o sin tratamiento previo con 500 ng /mL STC2. NS = No significativo. n = 3.

A continuación se investigó si STC2, el único otro miembro de la familia stanniocalcin de las proteínas [25], podría afectar a la progresión de la onda de calcio en las mismas condiciones. STC2 no afectó a la ola de calcio (Figura 1C).

Propagación de Ondas de calcio era independiente de las uniones comunicantes pero dependiente de ATP extracelular

propagación de la onda de calcio entre las células adyacentes ha sido previamente atribuido a pequeña molécula la transferencia de la comunicación intercelular brecha de unión (GJIC) [20], [26]. Para investigar si la GJIC fue responsable de la propagación de la onda de calcio, monocapas de A549 se pretrataron con 10, 25, o 50 mM de ácido glicirretínico (GA), un conocido inhibidor de la conexina mediada GJIC [27]. La propagación de la onda de calcio no se vio afectada, lo que indica que la respuesta de calcio era independiente de la GJIC (Figura S1).

Otros han informado de que la propagación de ondas de calcio dependía de la liberación de ATP de las células dañadas en el medio ambiente extracelular [18], [28]. Para confirmar que las células lesionadas liberados ATP, se rasparon monocapas con una punta de pipeta y el medio condicionado se midió el contenido de ATP. El medio acondicionado contenía 400 veces más ATP de medio condicionado de células que no habían sido lesionados (Figura 2A). Para confirmar que las células A549 fueron capaces de responder a ATP iniciando una respuesta de calcio, Fluo-4 monocapas marcadas se tratan con ATP y se analizaron por microscopía de células vivas fluorescente. tratamiento ATP aumentó rápidamente la intensidad de píxel media de la región de medida de interés (Figura 2B). Para investigar si ATP liberado de las células raspadas era responsable de la respuesta de calcio en células viables, se retiró el medio de las monocapas de A549 y se reemplazó con PBS. La monocapa se deja en reposo para generar 'n de Lesiones de medio condicionado, o herido por raspado para generar un medio condicionado por "daño". entonces Ningún medio de lesiones y Lesiones acondicionado se colocó sobre Fluo-4 células A549 marcadas fresco y la respuesta de calcio se midió por microscopía fluorescente. Lesiones medio acondicionado indujo una respuesta de calcio más robusto que el control de ninguna lesión (Figura 3A; dos primeras filas). Pre-tratamiento de la lesión medio condicionado con una enzima que hidroliza trinucleótidos a mononucleótidos (250 mU /ml de apirasa) abolió completamente la respuesta de calcio. Los mismos datos fueron obtenidos por la medición de la respuesta de calcio en las células individuales. Una vez más, pre-tratamiento de la lesión medio acondicionado con apirasa abolió la respuesta de calcio (Figura 3B). Lesiones medio acondicionado también aumentó la respuesta de calcio máximo relativo al control ninguna lesión en las células medidos individualmente, que fue abolida por pretratamiento con apirasa (Figura 3C)

A) Mean ATP contenido de los medios condicionado de control o mecánicamente. monocapas A549 estimuladas. RLU, unidades relativas de luciferasa. Las barras de error = SD. * = P & lt; 0,05. n = 3. B) ATP (50 mM) solo esta en confluente Fluo-4 células A549 marcados (línea vertical). respuesta de calcio se midió por microscopía fluorescente. n = 4 películas.

A) El medio condicionado de viables (n), Lesión mecánica interrumpido (lesiones) o lisado perturbado mecánicamente tratados con 250 mU /ml de apirasa durante 10 minutos. (Lesiones + apirasa) se colocó en una capa confluente de Fluo-4 células A549 marcadas. Columna de la izquierda: Antes de la adición de medio condicionado. Columna derecha: 10 s después del tratamiento con medio condicionado. Aumento = 4 ×. La inserción de cada uno: perfil de intensidad del pixel por todo el campo de visión. imágenes en los recuadros para cada grupo de tratamiento fueron manipulados por igual el uso de la función de umbral en Adobe Photoshop con el fin de falso color de los picos de la claridad (rojo). n = 3 películas. la respuesta B) El calcio de 10 células individuales después de la adición de daño o daño + apirasa (250 mU /ml durante 10 min) tratada medio condicionado. Negro Flecha: La adición de medio condicionado. Red Arrow: Fondo Intensidad de medida. C) Intensidad máxima promedio para las células individuales después de la adición de inexistencia de daño, lesión o lesiones + apirasa medio condicionado. * = P & lt; 0,05; n = 30.

STC1 una mejor respuesta de calcio inducida por ATP

Para investigar si STC1 afectó a la respuesta de calcio inducida por ATP, Fluo-4 monocapas A549 marcadas fueron pretratados con 500 ng /ml STC1 durante 10 minutos y luego se estimularon con 50 mM ATP. A continuación, la respuesta de calcio se midió por microscopia de fluorescencia. STC1 aumentó la fluorescencia media de una región de interés definida por más de 2 veces (Figura 4A). Para corroborar los resultados de microscopía, se cuantificó la respuesta de calcio utilizando espectroscopia fluorescente, lo que nos permitió probar una amplia gama de concentraciones de ATP y STC1. células A549 se pre-incubaron con 0, 50, 250, o 500 ng STC1 durante 10 minutos. Después de un 4-segunda lectura de referencia, se inyectó ATP automáticamente en pocillos a una concentración final de 0,5, 2, 10, y 50 mM. STC1 aumentó la respuesta de calcio de una manera dependiente de la dosis; Sin embargo, a dosis más elevadas de ATP, STC1 se requiere en concentraciones más altas para tener un efecto de mejora. Los datos se muestran como media respuesta de calcio de punto final (Figura 4B), así como un ensayo continuo que abarca 30 s (Figura 4C).

Una respuesta) Media de calcio de monocapas confluentes Fluo-4 marcados de células A549 se analizaron por microscopia de células vivas después de la adición de 50 mM ATP para controlar (ATP) o monocapas previamente con 500 ng /mL STC1 de 10 min (ATP + STC1). Las barras de error = SD. * = P & lt; 0,05. n = 3 películas. B) La media de respuesta de calcio de Fluo-4 monocapas A549 marcadas analizadas por espectroscopia de fluorescencia después de la adición de diversas concentraciones de ATP y STC1. Los datos se muestran como media de intensidad de la señal en 25 s después de la adición de ATP. Las barras de error = SD. * = P & lt; 0,05. n = 4 para cada condición. C) ensayos continuos de B). n = 3 para B, C, D) Medición de las células individuales de A reveló oscilaciones de calcio prolongados en STC1 trataron previamente las muestras.

Nos dimos cuenta de que el ATP induce oscilaciones de calcio en una pequeña fracción (~ 20%) de las células en cada condición. Cuando las células se trataron con STC1, estas oscilaciones continuaron pasado tres minutos, mientras que las células control no oscilan más allá de 1,5 minutos. No hubo diferencia observable en la frecuencia de las oscilaciones (Figura 4D).

STC1 calcio mejor respuesta de Upstream de PLC Activación

nucleótidos de señalización que conduce a la liberación de calcio intracelular puede ser inducida por la unión de ATP ya sea a la familia P2X de los canales iónicos, o los receptores acoplados a la proteína G P2Y [24]. Para investigar cual de estas vías fueron los responsables de la inducción de calcio en nuestro modelo, Fluo-4 monocapas A549 marcadas se tratan con un antagonista de P2X (NF023), o antagonistas de la vía de P2Y (fosfatidilinositol-específicos (PI) inhibidor de PLC, D609, y el inhibidor de PLC , U73122). D609 y U73122 reducen la distancia y la intensidad de la onda de calcio después de la estimulación mecánica a los 20 s de post rascado (Figura 5A, B); Sin embargo, la medición de la distancia máxima recorrida por la onda reveló que sólo U73122 inhibió completamente la onda de calcio (Figura 5C). D609 y U73122 también inhibió la activación de calcio después de la adición de ATP exógeno, mientras que la adición de NF023 no tuvo ningún efecto (datos no mostrados). Aunque D609 reduce la distancia y la intensidad de la onda de calcio, pre-incubación de las células con STC1 restaura la distancia de la onda. STC1 fue incapaz de mejorar la onda de calcio después de la incubación con U73122 lo que indica que STC1 era dependiente de la activación de PLC canónica (Figura 5D).

A) Fluo-4 células A549 marcadas se estimularon mecánicamente en ausencia (control) o presencia de un inhibidor de P2X (50 mM NF023), PI-PLC inhibidor de la vía (D609 50 M), o un inhibidor de PLC (12,5 M U73122) t = 20 s después de la lesión. n = 5. B) Cuantificación de la distancia recorrida por la onda de calcio de la A a T = 20 s. Las barras de error = SD. * = P & lt; 0,05. n = 5. C) Fluo-4 células A549 marcadas pre-tratados durante 30 min con NF023, D609, o U73122 fueron incubadas con 500 ng /mL para STC1 10 min antes de raspar. Se muestra la distancia máxima de la onda de calcio. Las barras de error = SD. * = P & lt; 0,05. n = 3.

STC1 se requería para la Propagación de Ingeniería Mecánica y de calcio inducida por ATP Wave

La observación de que STC1 estaba actuando aguas arriba del PLC nos llevó a investigar el efecto de STC1 endógena en la propagación de ondas de calcio después de la estimulación mecánica. células A549 se pre-incubaron con /ml de anticuerpo anti-STC1 policlonal 1 g que habíamos demostrado previamente para ser eficaz en el bloqueo STC1 [10]. Las células se estimularon después mecánicamente y se midió la distancia de la onda de calcio. Pre-tratamiento de las células con anticuerpo anti-STC1 reduce la distancia recorrida por la onda de calcio en comparación con células pre-tratadas con un anticuerpo de control de isotipo. Del mismo modo, el tratamiento previo de las células con apirasa reduce la distancia recorrida por la onda de calcio (Figura 6A, B). Además, el grupo tratado con anti-STC1 muestra una rápida recesión de la onda de calcio (Figura 6B), así como disminución de la respuesta de calcio adyacente al sitio de rascado, como se mide por microscopía de fluorescencia (Figura 6C; Película S5).

a) Fluo-4 monocapas A549 marcadas se estimularon mecánicamente en presencia de anticuerpo de isotipo (control), un anticuerpo STC1 de bloqueo (anti-STC1; 1 mg /ml) o apirasa (250 mU /ml) y se ensayaron por células vivas microscopía. B) Distancia de propagación de la onda de calcio a partir de barras de error = A. SD. * = P & lt; 0,05. C) La cuantificación de la intensidad de la señal adyacente al sitio de raspar después de la estimulación mecánica. Las barras de error = SD. * = P & lt;. 0,05

STC1 Enhanced la liberación de ATP a partir de células
in vitro
y
in vivo

A continuación se probó si STC1 afectó a la liberación de ATP de las células epiteliales sin estimular. El medio procedente de las células A549 se reemplazó con medio libre de suero con o sin 500 ng /ml STC1 durante 10 minutos y se realizó un ensayo de ATP. El medio procedente de las células tratadas STC1 contenía 2 veces más ATP (Figura 7A). No se observaron diferencias significativas en los lisados ​​de estas células. los niveles de ATP se normalizaron al contenido de ADN en cada pocillo. Resultados similares se obtuvieron a partir de fibroblastos de embriones de ratón de tipo salvaje y STC1 ratones transgénicos (Figura 7B). Las células A549

A) se estimularon con 500 ng /ml STC1 durante 10 minutos. El medio acondicionado se recogió y se ensayó para ATP. Las células adherentes se lisaron y se midieron para ATP y contenido de ADN. valores de ATP se normalizaron a la fluorescencia de ADN. * = P & lt; 0,05; n = 3. B) células A549 fueron estimuladas con 10 ATP mu M durante 2, 5 y 10 minutos. Ensayo de medio condicionado de células y lisados ​​de tipo salvaje y STC1 sobre-expresión de los MEF. * = P & lt; 0,05; n = 3. C) El suero se aisló de tipo salvaje y ratones transgénicos STC1 y se ensayó para el contenido de ATP. * = P & lt; 0,05; n & gt;. 17

Los resultados sugieren la posibilidad de que el nivel sistémico de ATP puede estar elevado en ratones transgénicos STC1. Para investigar esta hipótesis, el plasma de tipo salvaje y ratones transgénicos que sobreexpresan STC1 se recogieron y se llevó a cabo un ensayo de ATP. Los ratones que expresan el transgén STC1 humana mostraron mayores niveles de ATP en sangre en comparación con los controles de tipo salvaje (Figura 7C).

Discusión

Las observaciones anteriores sugieren que la proteína es STC1 respuesta al estrés. La proteína STC1 es 80% idéntico entre los peces y humano, y 98% idénticas entre los ratones, ratas, seres humanos y otros mamíferos [29]. STC1 ratones knockout no mostraron ningún fenotipo abierta [30]; Sin embargo, el aumento de los niveles de STC1 pueden alterar la función muscular y el desarrollo del hueso y disminución reproducción [31], [32]. Los niveles de ARNm se upregulated STC1 rápidamente durante la hipoxia y después de la exposición a diversas citoquinas incluyendo el factor de necrosis tumoral alfa, factor de crecimiento transformante beta, y el factor-2 de crecimiento de fibroblastos (G. Block, datos no publicados). En conjunto, estas observaciones apoyan aún más la conclusión de que STC1 modula la señalización durante los primeros acontecimientos de la respuesta celular al estrés.

Con el fin de investigar el papel de STC1 en el estrés, se empleó un modelo de lesión en la que epitelial las monocapas se rompieron con un estímulo mecánico para recapitular los primeros eventos de la reparación de la herida [15], [28], [33]. Se encontró que STC1 mejora la velocidad y la distancia máxima de la propagación de una onda de calcio dependiente de ATP. STC2 no afectó a la progresión de la onda de calcio ya que el pretratamiento de las células con STC2 no alteró la distancia máxima recorrida por la onda. También dedujo que STC1 era dependiente de la activación de PLC en una vía de receptor acoplado a proteína G P2Y ya que el inhibidor de PLC, U73122, fue capaz de bloquear la propagación de ondas de calcio en presencia o ausencia de STC1. Además, el bloqueo funcional de STC1 endógeno utilizando un anticuerpo inhibe la propagación de la onda de calcio.

La ubicuidad de la señalización de nucleótidos se refleja en la amplia distribución de los receptores P2 en diversos tipos de células [24]. Nuestra observación de que STC1 puede mediar la activación de calcio aguas abajo de ATP en las células epiteliales del pulmón puede ser también aplicable a otros tipos de células y tejidos. Por ejemplo, las observaciones de que STC1 actuaron como un inhibidor de la L-canal selectivo [34] paralelo las primeras observaciones que extracelular ATP puede ralentizar el ritmo cardíaco después de choque traumático [35], [36]. Además, la participación de ATP extracelular en la regulación de la quimiotaxis de macrófagos [16], [18], [37], [38], [39] ha sido definida de manera similar para STC1 [7]. Además, nuestros resultados sugieren que STC1 modulación de la señalización purinérgica puede contribuir a los fenotipos manifiestos exhibidas por ratones transgénicos que expresan constitutivamente STC1.

Aunque STC1 mejora la respuesta de calcio de aguas abajo de los nucleótidos extracelulares en las células epiteliales, la misma no puede ser cierto en otros tipos de células. Por ejemplo, STC1 se ha demostrado que activan la señalización del calcio en las células endoteliales [9], pero inhibir la señalización de calcio en respuesta MCP-1 en los macrófagos [7]. En nuestro ensayo, STC1 no tuvo efecto sobre la dinámica del calcio cuando se añade solo a las células A549 (Película S6). Además, el ATP no puede inducir la liberación de calcio en todos los tipos de células, dado que el ATP es un potente supresor de la activación de calcio en las neuronas del hipocampo [40], [41]. Los efectos variables de ATP también se reflejan en la sensibilidad de las células a ATP, como diferentes tipos de células requieren diferentes concentraciones de ATP extracelular para provocar un efecto. Mientras que las células A549 responden a tan poco como 0,5 mM ATP, macrófagos necesitan generalmente & gt; 100 mM con el fin de responder [42]. STC1 puede jugar un papel en la sensibilización de las células o a varias concentraciones de ATP desensibilizante.

Las consecuencias aguas abajo de la activación mediada por STC1 de una respuesta de calcio inducida por ATP podría tener ramificaciones importantes para las señales microambientales que conducen al estrés-respuestas normales a los insultos mecánicos y potencialmente, tóxicos. Por ejemplo, el papel de STC1 en la reparación de una herida epitelial se puede basar en su capacidad para promover o prevenir la apoptosis de las células de ATP [43] estimulada. El papel de la señalización STC1 purinérgicos de las membranas de la célula u orgánulo podría tener implicaciones importantes para el movimiento de calcio aguas abajo dentro y entre las células dañadas. Esto ha sido un reto en parte debido a la falta de ensayos biológicos disponibles para STC1. El trabajo que hemos presentado aquí establece un bioensayo para la actividad STC1 para facilitar una comprensión más profunda de su estructura y función en una variedad de tipos de células y situaciones fisiológicas.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

los animales fueron alojados y utiliza de acuerdo con los protocolos aprobados por el Consejo Universitario de Cuidado de Animales de la Universidad de Ontario occidental.

Cultivo celular y reactivos

A549 epiteliales humanas de cáncer de pulmón las células y las células de cáncer de próstata PC3 se obtuvieron de la American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA; www.atcc.org). Fibroblastos embrionarios de ratón y el plasma se obtuvieron de tipo salvaje y STC1 humana ratones transgénicos como se describe anteriormente [44]. Todas las células se mantuvieron en medio de Dulbecco mínimo esencial (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com) que contiene 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biológicos; Norcross, GA; www.atlantabio.com) y 100 U de penicilina /100 g de estreptomicina (Invitrogen). Los reactivos fueron las compras de las siguientes fuentes: ATP a partir de Teknova (Hollister, CA; www.teknova.com); apirasa de New England Biolabs (Ipswich, MA; www.neb.com); ácido glicirretínico de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com); STC1 humana recombinante y STC2 como una proteína de fusión marcada con FLAG preparado a partir de células humanas de BioVendor (Modrice República Checa; www.biovendor.com); Los anticuerpos policlonales de cabra y anticuerpo monoclonal de ratón (clon 380715) anti-anticuerpo STC1 de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN; www.rndsystms.com) y los inhibidores de NF023 y D609 de Sigma Aldrich

El calcio tinte de etiquetado

para medir los cambios en los niveles de calcio intracelular, las células se marcaron con Fluo-4 sin lavado de tinte (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, colorante liofilizado se reconstituyó con 10 ml de tampón de ensayo (1X calcio y magnesio HBSS libre con tampón HEPES 20 mM), y se suplementó con 100 l de ácido probenecid para evitar que el colorante se escape de las células, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células cultivadas en placas de cultivo de 48 pocillos se incubaron en 200 l Fluo-4 durante 30 minutos antes de la visualización por microscopía de células vivas o ensayo continuo mediante espectroscopía de fluorescencia.

inhibidor y el anticuerpo ensayos de bloqueo de

NF023 se añadió directamente (50 mM), D609 (50 mM), U73122 (12,5 M), y anti-STC1 (1 mg /ml) a la 200 l de tampón de ensayo de Fluo-4 que contiene Fluo-4, y se incubaron junto con el Fluo -4 para 30 min antes de la recogida de datos como las células tomaron el colorante. Todas concentraciones de inhibidor fueron optimizadas en experimentos preliminares utilizando dos veces diluciones en serie a partir de 100 M a 50 nM. La concentración eficaz se determinó como la concentración más baja para ejercer un efecto, aunque en el caso de NF023, ningún efecto fue siempre observado. Los experimentos iniciales utilizando ácido glicirretínico (5 mM a 100 mM) se realizaron por la pre-incubación de las células durante 30 minutos al mismo tiempo, ya que estaban siendo incubadas con Fluo-4 colorante.

Imágenes de células vivas y rotura mecánica

Las celdas eran imágenes en vivo usando una Nikon Eclipse Ti invertido microscopio de fluorescencia (Nikon Instruments Inc .; Melville, NY; www.nikoninstruments.com). Las células y el microscopio se encerraron en una cámara ambiental 37 ° C (En Vivo Científico; St Louis, MO; www.invivoscientific.com). Las imágenes fueron tomadas a los 2 cuadros /seg durante al menos 1 minuto usando software NIS Elementos. Un objetivo 4X se utilizó (CFI Plan Fluor 4X /.13 17,1 mm; Nikon Instruments). Fluo-4 estaba excitado mediante un filtro de excitación de 488 nm, y se detectó a 520 nm de emisión

La estimulación mecánica de las células A549 se realizó de forma manual mediante la creación de un rasguño lineal con una punta de pipeta P200 doblada (epTIP;. Eppendorf, Hamburgo Alemania, www.eppendorf.com). Con el fin de visualizar las ondas de calcio en cada figura con mayor claridad, todas las imágenes de cada condición se ajustan simultáneamente utilizando la función de umbral Adobe Photoshop de tal manera que los píxeles por encima de un umbral fijado arbitrariamente se puso rojo.

espectroscopia de fluorescencia

Fluo-4 células marcadas cultivadas en 48 o placas de 96 pocillos se incubaron a 37 ° C en un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con dos inyectores de reactivos (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg Alemania; www.bmglabtech.com). El primer inyector fue programado para suministrar dosis crecientes de ATP después de la lectura de referencia 4 seg. El segundo inyector fue programado para suministrar tampón de reactivo antes de la ATP por lo que el volumen de cada lectura se mantuvo constante. Los pocillos se sometieron a ensayo en emisión 480 de excitación /520. Los datos de cada estado básico restan. mediciones de intensidad de fluorescencia fueron tomadas cada 0,5 segundos a 480 actividad y analizados utilizando el software de análisis de datos BMG Omega Software y Microsoft Excel.


In Vitro Ensayos
ATP

ATP fue ensayada el uso de un protocolo basado en la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (CellTitre-Glo, Promega; www.promega.com). Con el fin de cuantificar indirectamente el número de células, 20 ml de reactivo de luciferasa fue suplementado con 50 l de un colorante de intercalación de ADN (CyQuant; Invitrogen). Se añadió un volumen de reactivo a un volumen igual de medio acondicionado. entonces la mitad de la muestra se ensayó para determinar la luciferasa y el resto para fluorescencia (480/520 de excitación /Convertidor catalítico) usando un lector de placas capaz de detectar tanto la fluorescencia y luminiscencia (Fluostar Omega, BMG Labtech).

Ensayo de ATP en ratón plasma

se extrajo sangre de los ratones transgénicos STC1 humana masculina (línea 2) [32] y los machos de tipo salvaje (2-4 meses de edad) de los mismos antecedentes genéticos (C57BL /6 x CBA) utilizando heparina para evitar la coagulación. Típicamente, 300-400 l se recogió por ratón y se mezcló inmediatamente con solución de parada a temperatura ambiente para minimizar la liberación de ATP a partir de las plaquetas y la degradación de ATP por la ATPasa [45]. La solución de parada fue 3 EDTA mM, NaCl 118 mM, KCl 5 mM, tampón de tricina 40 mM, 5 nM tioinosina nitrobencilo, 10 mM de forskolina, 100 M isobutilmetilxantina. La sangre se centrifugó inmediatamente a 13.000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente y 50 l de plasma se utilizó en duplicado para realizar mediciones de ATP indirectos usando el Glo CellTiter-ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante. La señal luminiscente se midió utilizando un luminómetro Berthold Lumat LB9507 y unidades relativas de luz se convirtieron en concentraciones de ATP utilizando una curva estándar.

Imagen y Análisis de la película

Análisis de imágenes se realizó utilizando el software de Nikon NIS Elementos (Nikon) o ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij). Con el fin de cuantificar la distancia de la onda de calcio, las imágenes fueron adquiridas 10, 20, 30 y 40 s después del rascado. Para cada imagen, 5 líneas se elaboraron perpendicular al borde de la raspadura de la punta de la onda de calcio. Las distancias de las líneas se registraron y se promediaron durante más de 5 películas por condición.

Análisis estadísticos

Cuando se están comparando dos medios, se realizó una prueba t de dos colas utilizando Microsoft Excel. En circunstancias en los que se están comparando más de dos medios, hipótesis nula se rechazó usando un análisis de varianza. Los recuentos se analizan usando una tabla de contingencia y la prueba de chi-cuadrado de múltiples variables utilizando el software estadístico INSTAT.

Apoyo a la Información
Figura S1.
propagación de las ondas de calcio era independiente de Gap Junction intercelular Comunicación. monocapas A549 fueron estimuladas mecánicamente después de la preincubación con con 10, 25, o 50 mM de ácido glicirretínico y se analizó por microscopía de células vivas. . Aumento = 40 ×
doi: 10.1371 /journal.pone.0010237.s001 gratis (0.30 MB TIF)
película S1.