Extracto
butirato, un producto de fermentación de la fibra en el colon, actúa como un inhibidor de la histona desacetilasa (HDACi) e induce la apoptosis en el cáncer de colon (CC) células
in vitro
. Hemos informado que los efectos apoptóticos de butirato dependen de la hiperactivación de la vía Wnt /beta-catenina. Sin embargo, la exposición prolongada de las células de CC a concentraciones crecientes de los resultados de butirato en la adquisición de resistencia a la /beta-catenin- Wnt y los efectos inductores de apoptosis de este agente, así como resistencia cruzada a estructuralmente diferentes HDACIs. Aquí mostramos que un mecanismo mediante el cual surge la resistencia HDACi es a través del aumento de la señalización de Wnt beta-catenina-independiente (no canónico). En comparación con las células HCT-116 CC HDACi-sensibles, las células HCT-R HDACi resistentes exhiben niveles más altos de células AKT /PKB de señalización de supervivencia, que es en parte inducida por WNT5A y su receptor ROR2. La inducción de la señalización de AKT por HDACIs se detecta también en otras líneas celulares CC, aunque en menor medida que en las células HCT-R resistentes a los medicamentos. Las observaciones sugirieron que el efecto apoptótico de butirato y otros HDACIs en células de CC puede ser aumentada por los inhibidores de pAKT. De acuerdo con la hipótesis, la combinación de MK2206, un inhibidor de pAKT, y un HDACi (butirato o LBH589) inducida mayor apoptosis en células de CC en comparación con cada agente solo. La exposición a los dos agentes también re-sensibiliza las células HCT-R a la apoptosis. Finalmente, el concepto de inducir la actividad simultáneamente Wnt canónica y la supresión de la señalización de AKT se tradujo en una combinación de agentes de la dieta derivados. Dieta derivados de inhibidores pAKT (éster phethyl ácido cafeico, el sulforafano, dilallyl trisulfuro) suprime los niveles de butirato inducida de pAKT, y el aumento de la apoptosis efectos de butirato en las células CC tanto sensibles a fármacos y resistentes a los medicamentos.
nuestros hallazgos se pueden traducir en (a) la terapia de CC empleando combinaciones de HDACIs e inhibidores de pAKT sintéticos, así como (b) la prevención de CC en base a las dietas que resultan en cantidades suficientes de los inhibidores de butirato y pAKT.
Visto : Bordonaro M, S Tewari, Cicco CE, Atamna W, Lazarova DL (2011) Un interruptor de Canonical a no canónica de señalización Wnt media la resistencia fármaco en las células del cáncer de colon. PLoS ONE 6 (11): e27308. doi: 10.1371 /journal.pone.0027308
Editor: Cara Gottardi, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptado: October 13, 2011; Publicado: 3 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Bordonaro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Darina Lazarova está apoyado por el NIH /NCI subvención#1R15CA152852-01 y los fondos institucionales de la Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Michael Bordonaro está apoyada por AICR subvención#09A002, NIH /NCI-NIDDK#1R15CA149589-01, y los fondos institucionales de la Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Beta-catenina - dependiente de la señalización de Wnt (canónico) se inicia por la unión de ligandos Wnt a sus receptores de la superficie celular, y esta unión desencadena una cascada de eventos intracelulares que conducen a la acumulación de Ser-37 /Thr- 41 desfosforilado beta-catenina. El beta-catenina desfosforilado es transcripcionalmente activo, y forma complejos con las proteínas LEF /TCF para controlar la expresión de cientos de genes [1] - [3]. La activación constitutiva de la señalización de Wnt debido a mutaciones en sus componentes, APC y /o beta-catenina, promueve la tumorigénesis en el colon [4] - [7], y dichas mutaciones son característicos de la mayoría de los cánceres de colon (CC). Hemos observado que las células de CC con mutaciones en los componentes de la señalización Wnt canónica hiper-inducir esta vía en la presencia de inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs), tales como butirato de (un producto de fermentación de la fibra en el colon), SAHA, MS275, y tricostatina A [8], [9]. Estos HDACIs inducen apoptosis en células de CC, y los niveles de apoptosis dependen de las veces el cambio en la actividad de Wnt canónica: células CC que exhiben baja inducción de la señalización /catenina Wnt en presencia de HDACIs son relativamente resistentes a los efectos apoptóticos de los agentes; sin embargo, las células que se someten a una activación significativa de la señalización de Wnt canónica son muy sensibles a la apoptosis [8]. Hemos establecido que el aumento de la actividad /catenina Wnt en las células CC butirato tratados precede el evento apoptótico ya que (a) la inhibición de la apoptosis por un inhibidor general de caspasa no abrogar el aumento de la actividad de Wnt /catenina (datos no publicados), y (b) el flujo fracciones de células citometría ordenados-alta con la señalización de Wnt canónica consistir tanto en vivo como células apoptóticas; sin embargo, si la apoptosis eran un requisito previo para la inducción de la actividad de Wnt, todas las células con alta actividad Wnt deberían haber sido apoptótica [8]. Se observó que la relación directa entre la veces de inducción de la actividad de Wnt /catenina y el grado de apoptosis en los análisis de diez líneas celulares de cáncer cervical humanas expuestas a butirato, y esta relación es causal desde: (a) células que expresan inducible dominante TCF4 negativo, que suprime señalización /catenina, muestran una disminución de la apoptosis en presencia de butirato [8], y (b) el flujo fracciones de células citometría-clasificadas con alta actividad de Wnt canónica tienen una mayor proporción de apoptosis de las células vivas que fracciones de células con bajos niveles de canónica de Wnt actividad [8]. El hallazgo de que la hiper-activación de Wnt /beta-catenina resultados de señalización en altos niveles de apoptosis [8], [9] es coherente con los informes que se pliegan los cambios en las vías de señalización, en lugar de los niveles absolutos de señalización, de provocar respuesta fisiológica significativa de las células [10] - [12]
a través de análisis de diez líneas celulares de CC humanos, hemos encontrado que HCT-116 células responden a butirato y otros HDACIs con hiper-inducción de /catenina de señalización y los altos niveles de Wnt. de la apoptosis [8]. Sin embargo, por la exposición gradual de las células HCT-116 a concentraciones crecientes de butirato, derivados células HCT-R butirato-resistente. Estas células crecen en presencia de butirato 5 mM, una concentración que induce altos niveles de apoptosis en las células parentales HCT-116 [9]. células HCT-R son también resistencia cruzada a estructuralmente diferentes HDACIs, tales como TSA, MS-275, SAHA, y LBH589 [9]. Puesto que hemos establecido que (1) el resultado de apoptosis en células de CC depende de la inducción de la actividad de Wnt canónica [8], y (2) la hiper-activación de la señalización de Wnt canónica en células CC butirato-tratada es, en parte, iniciado en el nivel de ligando-receptor [9], se postula que las células CC el medicamento sensible y fármaco-resistentes difieren en la expresión de ligandos, receptores, y moduladores de Wnt /o positivos y negativos de la señalización /catenina Wnt en el nivel de ligando-receptor [8], [9]. En el presente informe, hemos investigado estas posibilidades, y se encontró que las células sobreviven CC exposición a butirato u otros HDACIs por la disminución de la señalización de Wnt canónica y el aumento de la beta-catenina -. Señalización Wnt independiente (no canónico)
Resultados
el aumento de expresión de los mediadores de la señalización de Wnt no canónica en HDACi resistente células CC
Hemos informado anteriormente de que el fenotipo HDACi resistentes de las células HCT-R no se debe a la disminución de la acetilación de las proteínas histonas, sino a la incapacidad de las células a la hiper-inducir la señalización de Wnt canónica a la misma medida que las células HCT-116 HDACi sensibles parentales [9]. Nuestros hallazgos sugieren que la supresión de la actividad /catenina Wnt en las células HDACi-resistentes es debido a la expresión modificada de ligandos Wnt, sus receptores, y /o moduladores de la señalización de Wnt en el nivel de ligando-receptor [9]. Para investigar esta posibilidad, se analizaron los perfiles de expresión de maqueta y tratada butirato-HCT-116 (HDACI y minúsculas) y HCT-R (HDACi-resistente) por las células matrices de PCR Wnt-específicos (SA Biosciences). Los análisis revelaron que tras la exposición a butirato 5 mM, las células HCT-116 y HCT-R aumentó significativamente la expresión de
WNT5A
y
wnt11
ARNm (datos no mostrados), y nos han confirmado este cambio en la expresión a nivel de proteínas (Fig. 1A). En comparación con las células HCT-116, las células HCT-R expresaron niveles más altos de ambos ligandos, y la presencia de WNT5A secretada y wnt11 en medios de cultivo de tejido acondicionado por las células CC fue confirmado (Fig. 1A)
(A) western blot Representante análisis de las células del CC y sus medios condicionados después de la exposición al tratamiento simulado (M) o butirato 5 mM (B) durante 19 hrs. (B y C). El silenciamiento de
WNT5A
y
ROR2
aumenta la expresión de Wnt /catenina actividad transcripcional de las células HCT-R (C) HCT-116 (B) y. Las células (50.000 /pocillo) fueron co-transfectadas con los reporteros para /catenina actividad transcripcional de Wnt (TopFlash o FOPFLASH, 50 ng /pocillo), PRL-TK como control de transfección eficiencia y control,
ROR2
, o
Wnt5A
siRNAs (10 pmol /pocillo). Los ácidos nucleicos se introducen en las células a través de un protocolo de transfección inversa con Lipofectamine 2000 en placas de 96 pocillos. En 31 hrs después de la transfección, las células fueron expuestas durante 20 horas a burlarse (m) o tratamiento con butirato 5 mM (b). Wnt actividad transcripcional se calculó como la relación de la actividad de TopFlash (con los sitios de tipo salvaje Lef /Tcf de unión) y FOPFLASH (con sitios de unión de mutantes Lef /Tcf). Cada transfección se llevó a cabo en pocillos duplicados; los datos representan la media de los resultados de tres experimentos. (RE). La sobreexpresión de WNT5A suprime la actividad transcripcional canónica Wnt de las células HCT-116. La co-transfección de células HCT-116 (50.000 /pocillo) con el reporteros actividad Wnt TopFlash o FOPFLASH (50 ng por pocillo), y pcDNANeo3.1 o WNT5A-expresión de construir (150 ng por pocillo) se llevaron a cabo a través de una inversa la transfección con Lipofectamine (0,7 l /pocillo) en placas de 96 pocillos. Después de la transfección, las células se expusieron a tratamiento simulado (m) o butirato mM 5 (b) durante 20 hrs. Cada transfección se llevó a cabo en pocillos duplicados; los datos representan la media de los resultados de al menos tres experimentos. (E) Supresión de
ROR página 2 expresión aumenta la sensibilidad de las células resistentes HDACi-HCT-R para el crecimiento de efecto supresor de butirato. Las células HCT-R (10
6) se nucleofected con 175 pmol de
ROR2 gratis (Invitrogen) o el control de siRNA, y 500.000 células se sembraron por pocillo en una placa de 6 pocillos. A las 24 horas, las células se expusieron a tratamiento simulado (m) o butirato 5 mM (b) durante 17 horas. A las 48 horas después de la nucleofection, las células se sembraron a 100 o 200 por pocillo por triplicado. crecimiento clonal porcentual se calcula como el número de colonias que surgen de una única suspensión celular de 100 células. El experimento se repitió tres veces y los resultados son la media de los datos de los tres experimentos. diferencias estadísticamente significativas se observaron por las estrellas
Dependiendo del contexto receptor, WNT5A y wnt11 inducen sea canónico o no canónico de señalización Wnt [13] -. [17]. Desde WNT5A induce la actividad de Wnt no canónica en presencia del receptor ROR2, analizamos la expresión de ROR2 en las dos líneas celulares de cáncer cervical. Los análisis de transferencia de Western reveló que ambos tipos de células expresan ROR2; sin embargo, las células HCT-R exhiben niveles más altos de ROR2 que las células sensibles a HDACi HCT-116 (Fig. 1A). Por lo tanto, es posible que las funciones Wnt5a como un ligando en las células no canónica de butirato tratados, y que las células HCT-R exhiben niveles más altos de la señalización de Wnt no canónica que las células HCT-116.
Para determinar los efectos de WNT5A y ROR2 sobre la actividad de Wnt, que las células HCT-116 y HCT-R co-transfectadas con los reporteros de la transcripción para la señalización de Wnt /beta-catenina (TopFlash o FOPFLASH) y siRNAs a
WNT5A
o
ROR2
. La disminución de expresión de WNT5A y ROR2 en las células HCT-116 aumentó Wnt /beta-catenina actividad transcripcional de una manera estadísticamente significativa (Fig. 1B). 116 HCT-butirato células tratadas con suprimido
ROR2
y
WNT5A
expresión aumentaron sus niveles de actividad de Wnt /catenina canónica a 233,0 ± 19,8 y 161,0 ± 32,0 en comparación con las células control transfectadas ( 94,8 ± 10,8), P & lt; 0,05, en las células HCT-R tratados de forma simulada, la supresión de
ROR2
y
WNT5A
expresión no alteró significativamente los niveles de transcripción de Wnt en comparación con los de las células transfectadas con siRNA control (17,4 ± 4,6 y 12,8 ± 1,8, en comparación con 15.3 ± 3.7 en células de control, P & gt; 0,05) (Fig 1C.). Sin embargo, en las células HCT-R butirato tratados, la supresión de
ROR2
y
WNT5A
expresión dio lugar a niveles significativamente más altos de actividad transcripcional canónica de Wnt, en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (60,2 ± 12,5 y 53,1 ± 8,4 en comparación con 31,2 ± 7,9 en células de control, P & lt;. 0,05) (Fig 1C). Por lo tanto, WNT5A y su receptor ROR2 contrarrestar la inducción de la actividad /beta-catenina en las células HCT-116 y HCT-R-butirato tratados.
Esta conclusión fue apoyada por los resultados de la sobreexpresión de WNT5A en HCT -116 células. células HCT-116, que expresan niveles más bajos de WNT5A que las células HCT-R (Fig. 1A), se co-transfectaron con los reporteros de Wnt /beta-catenina y un vector vacío, o un vector de expresión WNT5A. Las células co-transfectadas con un vector vacío aumentaron su actividad /beta-catenina Wnt (TopFlash /FOPFLASH) de 5,2 ± 1,1 a 62,2 ± 9,3; mientras que, las células que sobreexpresan WNT5A aumentaron su actividad /beta-catenina vía de 3.7 ± 0.1 13.2 ± 0.3 a la (Fig. 1D). La diferencia en la actividad transcripcional de Wnt /beta-catenina entre las células y Control- Wnt5a transfectadas en presencia de butirato fue estadísticamente significativa (P & lt; 0,05).
Desde el silenciamiento de
ROR
2 la expresión en células HCT-R dio como resultado niveles más altos de la señalización de Wnt /beta-catenina, y hemos observado anteriormente que la mayor inducción de Wnt /beta-catenina en las células CC corresponde a una mayor sensibilidad de las células a los efectos de butirato [8 ], se analizó el crecimiento clonal de las células HCT-R nucleofected con el control de siRNA o
ROR página 2 siRNA. En ausencia de butirato, el control siRNA- y
ROR página 2 células siRNA transfectadas mostraron un ligero, pero estadísticamente significativa, diferencia en el crecimiento clonal (75,3 ± 1,4% frente al 67,6 ± 3,4%, P & lt; 0,05) . En presencia de butirato, la diferencia en la capacidad de crecimiento clonal fue más pronunciada; Las células HCT-R-nucleofected de control mostraron un crecimiento clonal de 71,3 ± 3,8% y
ROR página 2 células siRNA-nucleofected exhibieron 51,4 ± 5,5% de crecimiento clonal (Fig. 1E).
Inducción de la AKT /PKB vía por la supervivencia y WNT5A ROR2 en las células CC
el aumento de la expresión WNT5A en las células tratadas con butirato HCT-116 y HCT-R dio lugar a una búsqueda de los efectores del ligando. Varias vías Wnt5a inducida no canónicos han sido identificados, y al menos dos de estos son ROR2 dependientes: la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3-K) /AKT señalización desencadenada por la fosforilación de AKT quinasa [18] - [20], y la vía de señalización de JNK [21] - [23]. De acuerdo con estos informes, se observó que AKT Serine473-fosforilada (pAKT) se expresa en niveles más altos en las células HCT-R HDACi-resistentes en comparación con las células HCT-116, y en ambas líneas celulares, la exposición a butirato incrementó los niveles de pAKT ( Fig. 2A).
() HDACi-resistentes a las células HCT-A R expresan niveles más altos de pAKT que las células sensibles HDACi-HCT-116. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 450.000 células por pocillo, y a las 24 horas se expusieron a burlarse de butirato 5 mM tratamiento (M) o (B) durante 17 horas. Total de lisados de proteínas se analizaron por análisis de Western blot, y los niveles de AKT fosforilada-Ser473 (pAKT), AKT total (AKT), y la actina se detectaron como se describe en Materiales y Métodos. las células (B) HCT-R son más resistentes a 5-fluorouracilo (5-FU) apoptosis inducida de las células HCT-116 HDACi sensibles parentales. Las células se expusieron a 1.5 mM 5-FU durante 24 horas, y se realizaron ensayos de apoptosis como se describe en Materiales y Métodos. Porcentaje de células vivas se calcula dividiendo el número de células vivas por el número total de células analizadas. (C) El silenciamiento de la expresión ROR2 en las células HCT-R disminuye los niveles de Akt Ser473 fosforilada. Un millón de células fueron nucleofected con el control o
ROR página 2 siRNAs (175 pmol, Invitrogen), y se sembraron a 500.000 por pocillo en placas de 6 pocillos. A las 24 horas post-transfección, las células se expusieron a burlarse (M) o butirato 5 mM (B) durante 19 hrs. Lisados celulares totales se analizaron por Western blot; Se muestra un Western blot representativo. El gráfico de barras debajo de la imagen de transferencia de Western representa la cuantificación de los niveles de pAKT en tres experimentos independientes por densitometría, la diferencia entre las células de butirato tratadas son estadísticamente significativas (P & lt; 0,05), (D) .Overexpression de WNT5A recombinante en células HCT-116 ocasionan el aumento de los niveles de pAKT. células HCT-116 se transfectaron con un vector vacío o un vector de expresión WNT5A, y seleccionada para la expresión estable de estos constructos. Las muestras duplicadas fueron analizadas para determinar los niveles de expresión de WNT5A y pAKT como se describe anteriormente; Se muestra un Western blot representativo. El gráfico de barras en virtud de la transferencia de western representa la cuantificación de pAKT en tres experimentos independientes por densitometría, P & lt; 0,05. (E) un representante de Western blot de células CC humana SW620 y células que crecen a SW620R butirato de 3 mm. Las dos líneas celulares se expusieron a burlarse (m) o butirato 5 mM (b) de tratamiento durante 17 horas y se analizaron como en la figura 2A. (F). células SW620 que expresan inducción exógeno exposición WNT5A suprimida de Wnt de transcripción /beta-catenina por butirato, P & lt; 0,05. Transfección y análisis se realizaron como se describe en la Fig. 1D.
Desde AKT /PKB es una vía de supervivencia celular, se razonó que los niveles altos pAKT en células HCT-R pueden proteger a las células no sólo contra la apoptosis inducida por HDACIs, sino también contra otros estímulos apoptóticos . Para evaluar esta posibilidad, se comparó la respuesta de las células HCT-R y sus homólogos HDACi-sensibles, células HCT-116, a 5-fluorouracilo (5-FU), un agente quimioterapéutico usado comúnmente para CC. La concentración de 5-FU requerido para 50% de inhibición del crecimiento se ha informado de las células HCT-116, y líneas de células resistentes a los medicamentos derivados de células HCT-116, y está en el intervalo de 0,09 mM a 2,4 mM [24]; por lo tanto, se analizó la respuesta de las células HCT-116 y HCT-R a 1,5 mM 5-FU (Fig. 2B). El tratamiento de células HCT-116 con 5-FU resultó en una disminución significativa en el número de células vivas de 86,7 ± 8,3 a 48,1 ± 8,0 (P & lt; 0,05); mientras que, la misma exposición de las células HCT-R no cambió significativamente el número de células vivas. Por lo tanto, modelo de las células tratadas mostraron 95,8 células vivas ± 2,1%, y 5-FU - células tratadas mostraron 91,6 ± células vivas 4,2%; p & gt;. 0.05 (Fig. 2B)
La posibilidad de una relación causal entre el aumento de los niveles de pAKT y la expresión de WNT5A y ROR2 fue probado a través de silenciamiento de genes y los experimentos de sobreexpresión de genes. El silenciamiento de
ROR2
expresión en células HCT-R de siRNA resultó en una disminución moderada de los niveles pAKT, y la diferencia en los niveles de pAKT fue estadísticamente significativa sólo entre las células tratadas con butirato (Fig. 2C), la sobreexpresión de WNT5A en las células HCT-116 dio lugar a mayores niveles de pAKT, y la diferencia también fue estadísticamente significativa (Fig. 2D).
estudios adicionales con las células de cáncer de colon humano SW620, y la derivados de ellos células SW620R, que crecen a butirato de 3 mM, indicó que estas células no expresan niveles detectables de ROR2 (datos no mostrados); sin embargo, expresan WNT5A, y la exposición a butirato aumenta los niveles de pAKT (Fig. 2E). Curiosamente, la expresión exógena de WNT5A en las células SW620 suprime la transcripción dependiente de Wnt /beta-catenina, incluso en ausencia de expresión ROR2 detectable: en presencia de butirato de los niveles de actividad de Wnt en las células SW620 Wnt5a expresan fueron 271 ± 32, y el estos en control de las células transfectadas fueron 389 ± 35 (Fig. 2F). Por lo tanto, además de ROR2, otros receptores pueden mediar la señal WNT5A, y la activación aguas abajo de AKT quinasa.
supresión de los niveles pAKT aumenta la respuesta apoptótica de las células CC a HDACIs
Desde AKT de señalización es una importante vía de supervivencia celular, razonó que su supresión en las células expuestas a CC HDACIs sería aumentar los efectos apoptóticos de estos agentes. Hemos utilizado MK2206, que es un inhibidor alostérico de la AKT [25], y determinamos que a los 5 M el agente suprime los niveles de pAKT tanto en las células HCT-R (Fig. 3A) HCT-116 y. Para determinar cómo de señalización /beta-catenina Wnt se ve afectada por el inhibidor de AKT quinasa MK2206 solo o en combinación con un HDACi (butirato o LBH589), se analizaron los niveles de transcripcionalmente activo (desfosforilado) beta-catenina en las células HCT-116 tratadas por 8 o 17 horas (Fig. 3B). células HCT-116 a las 8 horas, HDACi sensible, que no presentan signos de apoptosis, como comprobada por análisis de citometría de flujo con anexina V (datos no mostrados); sin embargo, a las 17 horas ya se detecta la apoptosis y la beta-catenina se escinde en su N- y C-terminal por caspasas (ver flecha en segundo panel de la Fig. 3B). Por lo tanto, los análisis de los niveles de beta-catenina transcripcionalmente activos se llevaron a cabo a las 8 horas en las células HCT-R (Figs. 3B y 3C) HCT-116 y. En ambas líneas celulares, MK2206 no dio lugar a cambios significativos en los niveles de activo beta-catenina en comparación con las muestras tratadas con un HDACi solo; Sin embargo, los niveles de pAKT fueron suprimidos por MK2206 en todos los tratamientos (Fig. 3D).
(A) Supresión de los niveles de pAKT en células CC por el MK2206 inhibidor alostérico. El análisis de transferencia Western de las células Representante CC expuestas durante 17 horas a burlarse (M), butirato 5 mM (B), butirato y 1 M MK2206 (MK1b), o butirato y 5 M MK2206 (MK5B). (B) Los niveles de estado estacionario de transcripcionalmente activo beta-catenina no se redujo en las células HCT-116 por el tratamiento combinado con un HDACi y MK2206. Las células se expusieron durante 8 o 17 horas a tratamiento simulado (M), butirato de 5 mM (B), butirato y 5 M MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), o 100 LBH589 nm y 5 M MK2206 (LMK). Total de lisados celulares se analizaron los niveles de estado estacionario de total y Ser37 /Thr41 desfosforilado beta-catenina. se muestra el análisis de transferencia de Western representativo. (C) los niveles activos de beta-catenina en las células HCT-R expuestos durante 8 horas para burlarse (M), butirato 5 mM (B), butirato y 5 M MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), o LBH589 100 nm y 5 mM MK2206 (LMK). (D) Representante de Western blot de AKT Ser473 fosforilada (pAKT) y el total de AKT (AKT) niveles en células CC expuestas durante 17 horas para burlarse (M), butirato 5 mM (B), butirato y 5 M MK2206 (BMK) , 100 LBH589 nm (L), o 100 nm y LBH589 5 MK2206 mu M (LMK). (E) La inducción de la actividad transcripcional /catenina dependiente de Wnt (TopFlash /FOPFLASH) en células CC por un HDACi (butirato o LBH589) no se suprime por un inhibidor de pAKT. Las células se nucleofected en un millón, con 1 g de plásmido (TopFlash o FOPFLASH) y PRL-TK, se diluyeron, y se sembraron a 30.500 células por pocillo en placas de 96 pocillos. A las 24 horas post-nucleofection, las células fueron tratadas durante 8 horas con mock (M), butirato de 5 mM (B), butirato y 5 micras MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), o 100 LBH589 nm y 5 MK2206 mu M (LMK). Los datos representan la media de los resultados de al menos tres experimentos. Diferencias estadísticamente significativas se observaron por una estrella. niveles (F) apoptótica en células HCT-R HCT-116 y se exponen a HDACIs y un inhibidor de pAKT. Las células se expusieron durante 28 horas a: tratamiento simulado (M), butirato de 5 mM (B), butirato y 5 M MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), o 100 LBH589 nm y 5 M MK2206 (LMK). apoptosis por ciento y necrosis se calculó dividiendo el número de células apoptóticas y necróticas por el número total de células analizadas. Cada experimento tenía tres muestras por tratamiento; los datos representan la media de tres experimentos. Diferencias estadísticamente significativas se observaron por una estrella. células CC humana (G, H) SW48 con KRAS tipo salvaje son tan sensibles como HCT-116 células con KRAS mutantes para el tratamiento combinado con un HDACi y un inhibidor de pAKT. células SW48 se trataron y analizaron como se describe en Figs.3D y 3F. Western blots representativos y los datos de apoptosis, que representan la media de tres experimentos, se muestran. diferencias estadísticamente significativas se observaron por una estrella.
Para medir directamente la transcripción de Wnt /beta-catenina en las células expuestas a un inhibidor de pAKT y /o HDACIs, las células transfectadas con el reportero de Wnt /beta actividad catenina (TopFlash) o con un reportero de control (FOPFLASH) (Fig. 3E). El /catenina actividad transcripcional de Wnt (TopFlash /FOPFLASH) en HCT-116 células expuestas a burlarse o tratamiento MK2206 fue de 3,9 ± 0,4 y 2,8 ± 0,8, respectivamente (P & gt; 0,05). En las células HCT-116 expuestas a butirato, o butirato y MK2206, la actividad aumentó a 8,73 ± 2,9 y 12,8 ± 1,3 (para ambos tratamientos, P & gt; 0,05). Finalmente, cuando las células HCT-116 se expusieron a LBH589 o LBH589 y MK2206, la actividad /beta-catenina Wnt aumentó a 7,1 ± 0,6 y 11,3 ± 2,1, respectivamente, (P & lt; 0,05). En las células HCT-R, la exposición a burlarse, MK2206, butirato, butirato y MK2206, LBH589, o LBH589 y MK2206 resultó en la actividad /beta-catenina vía de 6,1 ± 0,9, 4,6 ± 1,2, 11,7 ± 2,8, 16,0 ± 2,9, 15,2 ± 0,5, y 17,2 ± 1,2, respectivamente, (P & gt; 0,05 para tratamientos combinatorios en comparación con los tratamientos con un HDACi solo). Por lo tanto, MK2206 no suprime la regulación al alza de la actividad transcripcional de Wnt por HDACIs.
El efecto combinado de HDACIs y MK2206 sobre la apoptosis se midió por medio de análisis de citometría de flujo. Aunque no hubo diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de apoptosis en células simuladas y tratados con MK2206, la adición de butirato a MK2206 o LBH589 resultó en un incremento estadísticamente significativo en la apoptosis en comparación con el tratamiento con cada HDACi solo (Fig. 3F). Por lo tanto, HCT-116 células expuestas a burlarse o MK2206 exhibieron niveles de apoptosis de 12,8 ± 2,2% y 14,3 ± 3,5%, respectivamente, (P & lt; 0,05). El tratamiento de células HCT-116 con butirato, o butirato y MK2206 resultó en 44,2 ± 1,5% y 64,2 ± 4,4% de apoptosis, respectivamente (P & lt; 0,05). En presencia de LBH589 o LBH589 y MK2206, HCT-116 células exhibieron 55,7 ± 6,9% y 73,5 ± 4,7% de apoptosis, respectivamente (P & lt; 0,05). En, las células HCT-R, la exposición a simulada o tratamiento MK2206 resultó en 11,4 ± 3,6% y 11,0 ± 4,0% de apoptosis, respectivamente (P & gt; 0,05); exposición a butirato, o butirato y MK2206 resultó en 14,4 ± 3,6% y 25,2 ± 4,1% de apoptosis (P & lt; 0,05), y la exposición a LBH589, o la combinación de LBH589 y MK2206 llevaron a 31,6 ± 5,3 y 45,7 ± 4,4% de apoptosis ( P & lt;. 0,05)
en la actualidad, el inhibidor pAKT MK2206 es en un ensayo clínico de los cánceres de colon con KRAS no mutado; sin embargo, la combinación de un HDACi y un inhibidor de quinasa pAKT fue muy eficaz en la inducción de apoptosis en la línea celular HCT-116, que es
KRAS
-mutant, y en el restablecimiento de la sensibilización de las células HCT-R a la apoptosis efectos de HDACIs. Para comparar la eficacia de la combinación de fármacos en las células CC con KRAS no mutado, se analizó la respuesta de apoptosis de las células de cáncer de colon humano células SW48. células SW48 respondieron a la combinación de un HDACi y MK2206 con aumento estadísticamente significativo en la apoptosis (Fig. 3G): simulada y tratamientos MK2206 resultó en 16,6 ± 0,7% y 16,9 ± 0,7% de apoptosis, respectivamente (P & gt; 0,05). El tratamiento de células SW48 con butirato, o butirato y MK2206 resultó en 49,7 ± 4,4 y 75,6 ± 1,2% de apoptosis, respectivamente (P & lt; 0,05), y la exposición a LBH589, o LBH589 y MK2206 resultó en 56,1 ± 6,3% y 78,3 ± 3,7% apoptosis, respectivamente (P & lt; 0,05). Los análisis de Western blot confirmó que MK2206 suprimió de forma fiable los niveles inducidos por HDACi de pAKT en células SW48 CC (Fig. 3H).
agentes derivados de la dieta que imitan los efectos de HDACIs sintéticos y pAKT inhibidores
Mientras que la combinación de HDACIs e inhibidores pAKT sintética podría aplicarse en la terapéutica CC o en la prevención para los pacientes con mayor riesgo de CC (por ejemplo, los pacientes con CC resecado y /o EII crónica), regímenes dietéticos que proporcionan metabolitos con HDAC- y pAKT inhibidora de funciones podrían convertirse en un enfoque de prevención de CC para la población general. Dado que el butirato es la dieta HDACi derivados más potentes producidos en el colon [26], una dieta CC-preventiva debe contener un nivel suficiente de fibra fermentable. Para encontrar un inhibidor pAKT que se pueda obtener de la dieta, se realizó una búsqueda en la literatura y encontramos publicaciones sobre el sulforafano, sphingadienes naturales, ajo derivados de dialil trisulfuro (DATS), fenetil éster del ácido cafeico (CAPE, de propóleo de abejas), la curcumina, y resveratrol, todos los cuales inhiben los niveles de pAKT en diferentes tipos de células [27] - [33]. Hemos probado algunos de estos compuestos para su capacidad para suprimir los niveles de pAKT butirato inducida en células de CC, y encontramos que CAPE, DATS, y el sulforafano suprimió el aumento de los niveles de quinasa pAKT en células butirato tratados con HCT-116, y sólo CAPE y DATS fueron activos en las células HCT-R (Fig. 4A). De los tres compuestos ensayados, CAPE era más potente en la supresión de los niveles de butirato inducida de pAKT en ambos tipos de células; sin embargo, no indujo apoptosis en ninguna de estas células por sí misma (Fig. 4B). Por lo tanto, en las células HCT-116, la exposición simulada y el tratamiento con 4 mg por ml CABO dado lugar a 12,2 ± 3,1% y el 11,9 ± 0,8% de apoptosis, respectivamente; exposición a butirato o la combinación de butirato y CAPE resultó en 44,8 ± 1,8% y 78,4 ± 6,5% de apoptosis, respectivamente (P & lt; 0,05). En las células HCT-R, la exposición simulada, el tratamiento con butirato, y el tratamiento con CABO solo resultó en 8,9 ± 1,2%, 12,6 ± 1,7%, y el 10,9 ± 3,0% de apoptosis, respectivamente (P & gt; 0,05). Sin embargo, cuando las células HCT-R fueron expuestos a la combinación de CAPE y butirato, los niveles de apoptosis aumentó en casi tres veces, de 30,6 ± 3,6% (P & lt; 0,05) (Fig 4B.). Análisis posteriores revelaron que en las células HCT-R butirato tratados, CAPE suprime los niveles fosforilados de la subunidad p55 de fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K), un importante activador corriente arriba de AKT quinasa (Fig. 4C). Sin embargo, el paso exacto en el que esta supresión se lleva a cabo no se conoce, y es un foco de la investigación futura. No se detectó la supresión constante de los niveles de fosfo-p55 PI3K en células HCT-116 expuestas a CAPE y butirato (datos no mostrados).
compuestos derivados de la dieta (A) suprimen los niveles de butirato inducida pAKT en CC Células. western blot Representante de las células expuestas durante 14 horas a tratamiento simulado (M), butirato de 5 mM (B), butirato de 5 mM y 4 g /cabo ml (BC), butirato 5 mM y 20 mM sulforafano (BS), butirato de 5 mM y 40 mu M DATS (BD). La detección de pAKT, AKT total (AKT), y la actina se realizó con células totales lisados.