Extracto
La ubiquitina-como con PHD y el anillo de dominios de dedo 1 (UHRF1), como un regulador epigenético, juega un papel importante en la progresión del cáncer y la tumorigénesis. funciones Kiss1 como un supresor de la metástasis en varios tipos de cáncer, y el silenciamiento epigenético de Kiss1 aumenta el potencial metastásico de las células cancerosas. Por lo tanto, se investigó si UHRF1 promueve la invasión de células de cáncer de vejiga mediante la inhibición de Kiss1. Los niveles de expresión de UHRF1 y Kiss1 fueron examinados por cuantitativa en tiempo real el ensayo de PCR
in vitro
y
in vivo
. El papel de UHRF1 en la regulación de la metástasis del cáncer de vejiga se evaluó en células de cáncer de vejiga. Se encontró que los niveles de UHRF1 son upregulated en la mayoría de las muestras clínicas de cáncer de vejiga en comparación con los tejidos normales emparejados, y UHRF1 niveles de expresión se incrementaron significativamente en los tumores primarios que posteriormente metástasis en comparación con los tumores no metastáticos. La expresión forzada de UHRF1 promueve la invasión de células de cáncer de vejiga, mientras que UHRF1 caída disminuye la invasión celular. La sobreexpresión de UHRF1 aumenta la metilación de nucleótidos CpG y reduce la expresión de Kiss1. UHRF1 y Kiss1 nivel de expresión se correlaciona negativamente
in vivo
y
in vitro
. Desmontables de Kiss1 promueve la invasión de células de cáncer de vejiga. Es importante destacar que la expresión forzada de Kiss1 anula en parte la invasión celular inducida por UHRF1. Estos datos demostraron que UHRF1 regulada por incremento aumenta la invasión de células de cáncer de vejiga en un silenciamiento epigenético de Kiss1
Visto:. Zhang Y, Z Huang, Zhu Z, X Zheng, Liu J, Han Z, et al. (2014) Upregulated UHRF1 promueve la invasión celular del cáncer de vejiga por el silenciamiento de la epigenética Kiss1. PLoS ONE 9 (10): e104252. doi: 10.1371 /journal.pone.0104252
Editor: Hari K. Koul, centro de Louisiana State University Health Sciences, Estados Unidos de América
Recibido: April 2, 2014; Aceptado: 7 Julio 2014; Publicado: 1 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
cáncer de vejiga humano ocupa el segundo lugar en frecuencia de cáncer genitourinario [1], y aproximadamente el 50% de los pacientes con diagnóstico de cáncer vesical infiltrante (MIBC) desarrollar metástasis a distancia en los pulmones y hígado, lo que resulta en tasas de supervivencia a 5 años pobres [2]. En la actualidad, los avances en la terapia adecuada para mejorar la tasa de supervivencia son limitadas debido a los mecanismos subyacentes que causan metástasis del cáncer no se conocen bien. Por lo tanto, es muy importante para revelar el mecanismo molecular de la metástasis del cáncer de vejiga para el desarrollo de una terapia eficaz.
UHRF1, también llamado ICBP90 en los seres humanos y Np95 en ratones, es una proteína multidominio, que se requiere para la regulación epigenética de expresión y la cromatina gen modificación [3], [4]. UHRF1 aumenta la transición G1 /S como el objetivo de factor de transcripción E2F [5], y los cambios en el nivel de expresión UHRF1 regula la progresión del ciclo celular, la proliferación celular y la migración celular [6], [7]. UHRF1 está regulada positivamente en múltiples tipos de cáncer, y la sobreexpresión de UHRF1 está implicado en la tumorigénesis y la progresión del cáncer [8], [9]. Varios informes mostraron que UHRF1 puede ser un marcador biológico importante para el diagnóstico y pronóstico de cánceres [5]. Unoki
et al
demostró que UHRF1 sobreexpresión se asocia con el grado y estadio del cáncer de vejiga [10]. La sobreexpresión de UHRF1 en el cáncer de vejiga también se correlaciona con un mayor riesgo de progresión del cáncer después de la resección transuretral [10]. Wang
et al
mostró que UHRF1 se sobreexpresa en el cáncer colorrectal (CCR) líneas celulares y muestras clínicas [5]. los niveles de expresión UHRF1 se correlacionan con la metástasis del cáncer y la mala puesta en escena de Dukes. UHRF1 knockdown induce la apoptosis celular y la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 y suprime la proliferación celular y la migración.
UHRF1 es un regulador muy importante de la metilación del ADN, y la metilación del ADN aberrante es un evento epigenética frecuente en el cáncer de vejiga [6], [11]. UHRF1 reconoce DNA hemimethylated generado durante la replicación del ADN y recluta DNMT1 (methyltransferase1 ADN) para asegurar el mantenimiento fiel de los patrones de metilación del ADN en las células hijas [6]. Kiss1 se identifica como la supresión de metástasis en varios tipos de cáncer, como el cáncer de vejiga, células de cáncer de mama y melanoma [12]. Kiss1 codifica una proteína de 145 amino-ácido que se procesa en KiSSpeptins (KP), incluyendo KP10, KP13, KP14 y KP54 [12], [13], [14]. Estudios recientes demostraron que Kiss1 se epigenetically silenciados por hipermetilación en el cáncer de vejiga [15]. Cebrian
et al
demostró que Kiss1 hipermetilación se observa con frecuencia y se correlaciona con la expresión de genes de baja, siendo restaurada por desmetilación de azacitidina en células de cáncer de vejiga [12]. Hipermetilación de Kiss1 también se correlaciona con tumor de alto grado y estadio. A pesar de estos hallazgos intrigantes, poco se sabe acerca de si UHRF1 aumenta la vejiga invasión de células cancerosas mediante el silenciamiento epigenético de Kiss1.
En el estudio, hemos probado si UHRF1 /Kiss1 representa una vía novedosa para la regulación de la invasión de células de cáncer de vejiga. Nuestros resultados revelaron que la expresión UHRF1 está regulada positivamente en tumores primarios que posteriormente metástasis, y la sobreexpresión de UHRF1 promueve la invasión de células de cáncer de vejiga en un silenciamiento epigenético de Kiss1.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas y líneas celulares
tejidos de la vejiga humanas se obtuvieron con consentimiento informado por escrito del hospital de la Amistad de Beijing afiliado a la Universidad médica de capital. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Capital. 47 muestras (Tabla 1) de las muestras de biopsia con diagnóstico patológico y, normalmente, (≥ 3 cm de distancia de tejidos de cáncer de vejiga) se recogieron de pacientes con cáncer de vejiga, incluyendo 22 con no músculo-invasivo [NMI, etapa PTA pT1] y 25 con músculo invasivo [MI, etapa ≥T2] se obtuvieron células de cáncer de vejiga .Human de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvieron en RPMI 1640 con 10% de FBS (Gibco, Carlsbad, CA).
-PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN total a partir de líneas celulares de cáncer de vejiga y las muestras fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). La RT reacción (transcripción inversa) se realizó utilizando un kit de M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). PCR en tiempo real cuantitativa se llevó a cabo utilizando un protocolo estándar SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) en los (Applied Biosystems) StepOne sistema de PCR en tiempo real de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo. ß-actina se utilizó como control interno para el ARNm. Los valores Ct respectivos (tanto UHRF1 y Kiss1) se obtuvieron mediante la normalización de ß-actina. expresión relativa se calculó con respecto al control. Los resultados se expresaron como 2
-ΔΔCt. *
p
. & Lt; 0,05
La sobreexpresión y pequeños ARN de interferencia
Para sobreexpresan UHRF1, el plásmido pcDNA-UHRF1 se construyó mediante la introducción de un
HindIII-EcoRI
fragmento que contiene el cDNA UHRF1 en los mismos sitios en pcDNA3.1. El gen UHRF1 se amplificó por PCR utilizando los cebadores directo e inverso: cccaagcttgggATGTGGATCCAGGTTCGGACCATGGACGGG y ggaattccTCACCGGCCATTGCCGTAGCCGGGGAAG. pcDNA-UHRF1 se transfectó en las líneas celulares de cáncer de vejiga mediante el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Para inhibir UHRF1 endógeno y expresión Kiss1, las células de cáncer de vejiga fueron transfectadas con 30 nM indicado indica siRNA o control negativo usando Lipofectamine 2000. UHRF1-siRNAs (secuencia de referencia, sc-76805) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). El Kiss1-siRNAs (secuencia de referencia, sc-37443) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology.
Transwell ensayo de invasión
invasión celular se examinó mediante ensayo de invasión Transwell con inserciones de tamaño de poro de 8 micras (Corning Costar) como se describe anteriormente [16]. Brevemente, se suspendieron las células de cáncer de vejiga (RT4 o T24) en medio libre de suero, y luego se siembran sobre filtros Transwell recubiertas con Matrigel en las cámaras de invasión Biocoat Matrigel. El medio que contiene suero se utilizó como un quimioatrayente en la cámara inferior. Las células de cáncer de vejiga fueron tratados con reactivos indicados durante 72 h, y luego las células que no invaden a través de los poros fueron eliminados mediante el uso de un hisopo de algodón. Las células en la superficie inferior de la membrana se tiñeron con cristal violeta. El número de células se determinó mediante el recuento de las células que penetran bajo un microscopio a 200 × magnificación de campos al azar en cada pocillo.
El análisis de metilación de
Kiss1
Una búsqueda de enriquecimiento de CpG en kiss1 se realizó y cebadores de secuenciación de bisulfito fueron diseñados utilizando la herramienta en línea CpG Island Buscador (MethPrimer, http://www.urogene.org/methprimer/). Los cebadores directos son GATGGAAGGGGAATAGTTTTATTAGA, y los cebadores inversos son TACAACTAAAACTCCTTCCACCTAC [12].
Se preparó ADN genómico a partir de células de cáncer de vejiga utilizando el Mini Kit de ADN de sangre QIAmp, y luego el ADN genómico se bisulfito de modificar por medio de la metilación del ADN EZ Kit -Gold de la investigación Zymo [17]. Los productos de PCR se clonaron en PMD-18T (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 9 clones positivos se secuenciaron. Los datos fueron analizados utilizando el software del analizador Biq [17].
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± DE (desviación estándar) de al menos tres experimentos separados. Se analizaron las diferencias entre los grupos utilizando
t de Student
. La diferencia se consideró estadísticamente significativa a
p
. & Lt; 0,05
Resultados
nivel UHRF1 está regulada positivamente en metástasis de carcinoma urotelial de vejiga
resultados anormales en UHRF1 metilación del ADN y la metástasis del cáncer, y la expresión UHRF1 se correlaciona con un mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Para evaluar si UHRF1 regula la metástasis del cáncer de vejiga, se examinaron primero UHRF1 expresión en líneas celulares de cáncer de vejiga y cáncer de los tejidos. Figura 1A demostró que los niveles de expresión de UHRF1 son upregulated significativamente en la mayoría de tejidos de cáncer de vejiga en comparación con los controles normales adyacentes. UHRF1 se aumenta notablemente la expresión en 77% (36/47) de tejidos de cáncer de vejiga (Figura 1A). Cuando los tejidos tumorales 47 fueron estratificados sobre la base de la progresión clínica, la expresión UHRF1 es significativamente mayor en los tumores primarios que posteriormente metástasis en comparación con los tumores no metastáticos (Figura 1B). Luego que analizaron los niveles de expresión de UHRF1 en ambas líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo y líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo. Entre las tres líneas de células invasoras (253J, T24 y KU7) los niveles UHRF1 son relativamente más altos que los de los no invasivos (Figura 1C). Estos datos sugieren que UHRF1 overexpressoin puede estar relacionada con la metástasis del cáncer de vejiga.
(A) El análisis cuantitativo del nivel de expresión UHRF1 se llevó a cabo en tejidos de cáncer de vejiga (n = 47) y los tejidos normales adyacentes. El ARN total se extrajo y se sometió a PCR en tiempo real para analizar la expresión de UHRF1 en cada muestra. β-actina se utilizó como control interno. El nivel UHRF1 relativa se calculó 2
-ΔΔCt donde Ct = Ct (UHRF1) - Ct (β-actina) y ΔΔCt = Ct (tejido tumoral) - Ct (tejido normal adyacente). especímenes de cáncer (B) La vejiga se dividieron en dos grupos en función de la progresión clínica. Los niveles UHRF1 en el grupo de metástasis (n = 25) fueron más altos que los del grupo de no-metástasis (n = 22). *
p Hotel & lt; 0,05. (C) UHRF1 nivel de expresión se ensayó mediante PCR en tiempo real en tres invasiva y tres líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo. Se utilizaron células uroteliales normales como control. *
p
. & Lt; 0,05
Upregulated UHRF1 aumenta la invasión de células de cáncer de vejiga
in vitro
Para investigar el papel de UHRF1 en la regulación la invasión de células, se analizaron las líneas celulares de cáncer de vejiga tratados con UHRF1-siRNA o pcDNA-UHRF1. En primer lugar, demostramos si RT4 y células T24 se pueden utilizar como
in vitro
modelo para investigar UHRF1 ensayando su expresión en RT4 o las células T24 después de la sobreexpresión o desmontables de UHRF1. Figura 2A y C mostraron que el tratamiento pcDNA-UHRF1 aumenta significativamente los niveles de UHRF1 en las células RT4 no invasivos, mientras que el tratamiento UHRF1-siRNA disminuye la expresión UHRF1 en células T24 invasivos. Además, la regulación positiva de UHRF1 promueve la invasión de células RT4 (Figura 2B), mientras que mediada por siRNA silenciamiento UHRF1 inhibe la invasión de células T24 (Figura 2D). Estos resultados demostraron que UHRF1 regula positivamente la invasión de células de cáncer de vejiga.
células RT4 (A) se trataron con pcDNA-UHRF1, y el nivel relativo de UHRF1 se ensayó mediante PCR en tiempo real. *
p Hotel & lt; 0,05. (B) UHRF1 se sobreexpresa en las células RT4, y el ensayo de invasión se realizó tal como se describe en Materiales y Métodos. se dan cifras representativas de cada experimento. Estos resultados muestran los datos de cinco experimentos independientes, expresados como la media ± desviación estándar. *
p Hotel & lt; 0,05. células T24 (C) se trataron con UHRF1-siRNA, y el nivel relativo de UHRF1 se ensayó mediante PCR en tiempo real. *
p Hotel & lt; 0,05. (D) ensayo de invasión se realizó después de UHRF1 caída. se dan cifras representativas de cada experimento. Estos resultados muestran los datos de cinco experimentos independientes, expresados como la media ± desviación estándar. *
p
. & Lt; 0,05
UHRF1 aumenta la metilación de CpG nucleótidos y reduce la expresión de Kiss1
Estudios anteriores mostraron que Kiss1 es frecuentemente hypermethylated en la vejiga cáncer y se correlaciona con la progresión del cáncer [12]. Aquí se investigó si UHRF1 regula la invasión de células de cáncer de vejiga en un silenciamiento epigenético de Kiss1. En primer lugar, ensayamos si UHRF1 regula la expresión Kiss1. Como se muestra en la Figura 3A y B, la expresión forzada de UHRF1 inhibe la expresión Kiss1, mientras que desmontables de UHRF1 aumenta la expresión Kiss1. a continuación, que analizaron el nivel de expresión de UHRF1 y Kiss1 en ambas líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo y líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo. Figura 3C mostró que los niveles UHRF1 son relativamente más altos, con bajos niveles concurrentes de Kiss1 en líneas de células invasivas. Una correlación negativa significativa se observa también entre los niveles de mRNA UHRF1 y los niveles de ARNm Kiss1
in vivo gratis (
r
2 = 0.0648,
p = 0,0063
, Figura 3D). Además, investigó si UHRF1 inhibe la expresión Kiss1 mediante el aumento de la metilación de CpG de nucleótidos
Kiss1
. Se analizó el estado de metilación de las islas CpG en Kiss1 mediante secuenciación de bisulfito, como se informó anteriormente [12], [15]. Los resultados del ensayo de metilación para el
Kiss1
gen en 14 tejidos de cáncer de vejiga y los controles normales adyacentes se resumen en la Figura 4A. análisis de secuenciación reveló que bisulfito
Kiss1
frecuencia de metilación se aumenta notablemente en tejidos de cáncer de vejiga en comparación con los controles adyacentes (Figura 4A). El análisis de correlación mostró que el
Kiss1
nivel de metilación se correlaciona positivamente con la expresión UHRF1 tanto en el cáncer de vejiga y tejidos normales de la vejiga (Figura 4B, p = 0,0036, R
2 = 0,2091). análisis de secuenciación de bisulfito mostró además que UHRF1 sobreexpresión aumenta la metilación de CpG de nucleótidos
Kiss1 gratis (Figura 4 C, D). Estos resultados sugieren que UHRF1 suprime la expresión Kiss1 por silenciamiento epigenético de Kiss1.
(A y B) Kiss1 nivel de expresión fue ensayada en células RT4 sobreexpresados con UHRF1 o células T24 tratadas con UHRF1-siRNA. *
p Hotel & lt; 0,05. niveles (C) y UHRF1 Kiss1 se analizaron mediante PCR en tiempo real en tres invasiva y tres líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo. Se utilizaron células uroteliales normales como control. *
p Hotel & lt; 0,05. (D) correlación negativa entre los niveles de mRNA UHRF1 y los niveles Kiss1 en 24 muestras de cáncer de vejiga (
r
2 = 0.0648,
p = 0,0063
).
(a) el análisis de metilación del
kiss1
de genes en tejidos de cáncer de vejiga 14 y muestras normales adyacentes. El análisis reveló que BSQ
Kiss1
frecuencia de metilación se incrementa notablemente con muestras de cáncer de vejiga. ** P & lt; 0,01. Se observa (B) una correlación positiva entre la
Kiss1
metilación y de expresión UHRF1 (R
2 = 0,2091, p = 0,0036). (C y D) Estado de isla CpG de metilación de Kiss1 se analizó por secuenciación de bisulfito en las células RT4. Nueve clones individuales se muestran en cada línea celular. dinucleótidos CpG fueron representados como cuadrados oscuros para citosinas metiladas y plazas abiertas por citosinas no metiladas.
UHRF1 aumenta la invasión de células de cáncer de vejiga mediante la inhibición de Kiss1
UHRF1 disminuye la expresión Kiss1 mediante el aumento de la metilación de nucleótidos CpG de
Kiss
y regulación a la baja de kiss1 promueve la invasión de células de cáncer de vejiga. Por lo tanto se especuló que el papel de UHRF1 en la regulación de la invasión de células está mediada en parte por Kiss1. En primer lugar, ensayamos si la inhibición Kiss1 aumenta la invasión de células de cáncer de vejiga. Como se muestra en la Figura 5A y B, desmontables de Kiss1 promueve la invasión de células RT4. Más importante, la sobreexpresión Kiss1 inhibe parcialmente la invasión de células RT4 UHRF1 inductor (Figura 5C y D). Estos resultados confirman que UHRF1 promueve la invasión de células de cáncer de vejiga, al menos en parte, por el silenciamiento epigenético de Kiss1. Células RT4
(A y B) fueron tratados con Kiss1-siRNA y ensayo de invasión se llevó a cabo después de Kiss1 caída. se dan cifras representativas de cada experimento. Estos resultados muestran los datos de cinco experimentos independientes, expresados como la media ± desviación estándar. *
p Hotel & lt; 0,05. células RT4 (C y D) se sobreexpresa con el UHRF1 o UHRF1 más Kiss1, y se realizó ensayo de invasión. *
p
. & Lt; 0,05
Discusión
En los mamíferos, la metilación del ADN se produce en la posición C5 de la citosina en el contexto de los dinucleótidos CpG, lo que resulta en 5 -methylcytosine (5mC) [18]. La modificación del ADN genómico por metilación es una señal epigenética importante, y los cambios en el patrón de metilación del ADN han sido un hallazgo consistente en diversos tipos de tumores [19]. Recientes estudios han demostrado que la herencia epigenética de la metilación del ADN requiere UHRF1, que recluta DNMT1 a las horquillas de replicación del ADN a través de una actividad única hemimethylated CpG vinculante [20]. Liu
et al
informó que UHRF1 recluta DNMT1 para la metilación de mantenimiento ADN a través de la unión ya sea CpG-hemi metilado o H3K9me2 /3, y que la presencia de ambas actividades de unión asegura una alta fidelidad de mantenimiento metilación del ADN [20].
sobreexpresión UHRF1 se asocia con las etapas del tumor y predice un mal pronóstico en varios tipos de cáncer [21]. UHRF1 coordina PPARG (proliferador de peroxisoma activados γ receptor) silenciamiento epigenético y media la progresión del cáncer de colon [22]. Desmontables de UHRF1 provoca PPARg reactivación, acompañado por las marcas de histona positivos y desmetilación del ADN, corroborando su papel en PPARg silenciamiento. Babbio
et al
mostró que UHRF1 contribuye a silenciamiento génico epigenética en la progresión del cáncer de próstata [23]. En el presente estudio, se encontró que los niveles de expresión de UHRF1 se incrementan significativamente en la mayoría de los tejidos de cáncer de vejiga en comparación con los controles normales adyacentes. Además, la expresión UHRF1 es significativamente mayor en los tumores primarios que posteriormente metástasis en comparación con los tumores no metastáticos. También se encontró que los niveles UHRF1 son relativamente más altos en líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo que las de los no invasivos. Además, regula positivamente UHRF1 promueve la invasión de células RT4 no invasiva, mientras que desmontables de UHRF1 inhibe la invasión de células T24 invasivo. Estos datos demostraron que la regulación positiva de UHRF1 contribuye a la invasión de células de cáncer de vejiga.
Kiss1 es un gen supresor de la metástasis del tumor en varios cánceres. expresión Kiss1 se reduce notablemente en los tumores de vejiga invasivo en comparación con sus respectivos urotelio normal [24]. Bajo nivel de Kiss1 se correlaciona con la supervivencia global en los tumores de vejiga [24]. Kiss1 está metilado significativamente. La inactivación de Kiss1 por el promotor de la metilación es un evento infrecuente en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) [25]. Kiss1 también se modifica epigenetically en el cáncer colorrectal, y Kiss1 metilación se asocia con el grado del tumor, la recurrencia predicho y la supervivencia general [15]. Aquí encontramos que UHRF1 regula negativamente la expresión Kiss1. UHRF1 niveles son relativamente más altos con bajos niveles concurrentes de Kiss1 en líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo. Una correlación negativa significativa se observa también entre los niveles de mRNA UHRF1 y los niveles de ARNm Kiss1
in vivo
. análisis de secuenciación de bisulfito demostró que inhibe la expresión UHRF1 Kiss1 por el aumento de la metilación de CpG de nucleótidos
Kiss1
. Más importante, Kiss1 sobreexpresión inhibe parcialmente la invasión de células RT4 en las células que sobreexpresan UHRF1.
Conclusión
Nuestros datos muestran que UHRF1 upregulated contribuye a la invasión de células de cáncer de vejiga en un silenciamiento epigenético de Kiss1.