Extracto
La metástasis es responsable de 90% de las muertes por cáncer. Durante la metástasis, las células tumorales se separan del tumor primario, pasan a la sangre y los vasos linfáticos, y los utilizan como carreteras para viajar a sitios distantes en el cuerpo para formar tumores secundarios. la migración de células del cáncer a través del endotelio y en la membrana basal representa un paso crítico en la cascada metastásica, sin embargo, no se entiende bien. Este proceso está bien caracterizado para las células inmunes que transmigrar rutinariamente a través del endotelio a los sitios de infección, inflamación o lesión. Estudios anteriores con leucocitos han demostrado que este paso depende en gran medida del estado de activación del endotelio y la rigidez sustrato subendotelial. En este caso, se utilizó un
in vitro
modelo previamente establecido del endotelio y imágenes de células vivas, con el fin de observar la transmigración de células cancerosas y comparar este proceso a los leucocitos. Curiosamente, la transmigración de células de cáncer incluye un paso adicional, el cual término «incorporación», en la monocapa de células endoteliales (CE). Durante esta fase, las células cancerosas desplazan físicamente EC, lo que conduce a la dislocación de la CE VE-cadherina lejos de los cruces de la CE que bordean las células cancerosas, y se extienden en la monocapa. En algunos casos, ECs separar completamente de la matriz. Además, la incorporación de células de cáncer se produce independientemente del estado de activación y la rigidez sustrato subendotelial para el cáncer de mama y células de melanoma, una diferencia notable desde el proceso por el cual los leucocitos transmigrar. Mientras tanto, la incorporación de células de cáncer de páncreas fue dependiente de el estado de activación del endotelio y cambió en sustratos subendoteliales muy rígidos. En conjunto, nuestros resultados proporcionan conocimientos sobre mecánica en la extravasación de células tumorales y demuestran que la incorporación es uno de los primeros pasos
Visto:. Hamilla SM, Stroka KM, Aranda-Espinoza H (2014) VE-cadherina-Independiente Cancer Cell la incorporación en el endotelio vascular precede a la transmigración. PLoS ONE 9 (10): e109748. doi: 10.1371 /journal.pone.0109748
Editor: Claudia Daniela Andl, Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2014; Aceptado 10 de septiembre de 2014; Publicado: 2 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Hamilla et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Nacional de Servicio de Investigación Premio F31NS068028 (KMS) y un Premio Proyecto Frontera Ciencia Humana RGP0058 /2011 ( AEH). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares o de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metástasis de cáncer ocurre cuando las células tumorales fragmento de la localización del tumor primario, entrar en los vasos sanguíneos y linfáticos, y se extendió a órganos distantes del cuerpo. Este proceso es uno de los principales factores que contribuyen a la letalidad del cáncer [1], [2]. Una vez que las células cancerosas metastásicas han entrado en la corriente de la sangre, deben cruzar la barrera de células endoteliales (CE) antes de invadir el tejido por debajo en una etapa conocida como la extravasación. La mayoría de las células tumorales detención por restricción de tamaño de la unión no específica de factores de coagulación y por en lechos capilares [3]. En algunos casos, los ligandos específicos en las células tumorales se han correlacionado con un aumento del potencial metastásico [4] - [6]. Hasta el momento, la investigación significativa se ha dedicado a analizar las capacidades bioquímicas y moleculares de las células del cáncer [7] - [9], pero todavía no se conoce el mecanismo subyacente de la extravasación de las células cancerosas a través del endotelio. se han observado células cancerosas para migrar a través del cuerpo de la célula CE [10], y por medio de uniones célula-célula endoteliales sin destruir la capa de CE [11]. Sin embargo, la investigación en conflicto también ha demostrado que las células cancerosas no salen del endotelio intacto tras la extravasación [10], [12] - [14]. Es importante señalar que estos estudios utilizaron diferentes líneas celulares tumorales, así de diferentes líneas de la CE y
in vitro
métodos, por lo que es posible que diferentes combinaciones de varios tipos de células tumorales y EC pueden conducir a divergente mecanismos de extravasación. Hay tres métodos propuestos de la migración de células de cáncer a través del endotelio: (a) las células cancerosas pueden migrar a través del cuerpo CE [10], (b) las células cancerosas pueden inducir CE apoptosis [10], [13] y (c) células de cáncer pueden migrar a través de uniones célula-célula endotelial sin destruir permanentemente la capa CE [11]. En los últimos años, la investigación también ha demostrado que las células cancerosas también ejercen fuerzas sobre ECs que los empujan más profundamente en la matriz extracelular durante la transmigración [15], [16], y que el endotelio mejora la migración de las células del cáncer [17]. Estos hallazgos sugieren que la migración del cáncer mediante el endotelio es un proceso complejo que requiere una mayor investigación para elucidar su curso mecanicista.
Los leucocitos transmigrar rutinariamente a través del endotelio y las capas subyacentes de la vasculatura para llegar a los sitios de tejido de inflamación, infección, o lesión. Este es un proceso bien caracterizado que se basa en señales bioquímicas localizadas. En el tráfico de leucocitos, el endotelio actúa como una barrera selectiva que reduce en gran medida la tasa de invasión [18]. Durante una respuesta inmune, el tumor de quimioquinas factor de necrosis alfa (TNF-α) se produce por las células del estroma, y la exposición localizada de ECs a TNF-α upregulates moléculas de adhesión, tales como molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) en la superficie del endotelio. Por otra parte, además de los cambios moleculares, TNF-α también altera significativamente las propiedades estructurales del endotelio, que induce ablandamiento, la realineación de actina, y un aumento de la permeabilidad general [19], [20]. Un factor adicional que mejora la transmigración de leucocitos es la rigidez sustrato subendotelial y propiedades mecánicas del endotelio. Estos varían durante la homeostasis vascular y en condiciones patológicas [19]. Los neutrófilos son capaces de mechanosense su microambiente [19], [21] - [24], y los neutrófilos transmigración de rigidez aumenta a medida que aumenta sustrato subendotelial debido a la CE de la cadena ligera de la miosina quinasa (MLCK) mediada por las fuerzas contráctiles [19]. Todos estos cambios en la monocapa CE facilitar la transmigración de leucocitos durante una respuesta inmune.
Desde leucocitos transmigran rutinariamente a través de la capa de EC, se presume que las células cancerosas metastásicas pueden compartir muchos de los mismos mecanismos. Sin embargo, estos mecanismos aún no se han investigado en mayor detalle. Por ejemplo, la implicación de quimioquinas en las interacciones con el tumor endotelial y sus efectos sobre la migración de células de cáncer no se entienden bien [25]. Aún más, los cambios moleculares y estructurales importantes que tienen lugar en el endotelio después del tratamiento con TNF-α pueden mejorar la transmigración de células de cáncer metastásico. También queda por ver cómo la extravasación de células de cáncer varía con la rigidez del sustrato subendotelial. Según se observó con los leucocitos [19], es posible que la transmigración de células de cáncer puede aumentar con el aumento de la rigidez del sustrato. También se han observado células cancerosas para empujar ECs en la matriz extracelular durante la extravasación, lo que indica que las propiedades mecánicas de la ECM pueden desempeñar un papel importante. Tomados en conjunto, estos resultados indican que tanto el estado de activación del endotelio y la rigidez del sustrato subendotelial pueden influir en la extravasación de las células cancerosas.
En este trabajo, un
in vitro
modelo del endotelio vascular [19 ], [26] - [28] fue utilizado para explorar la transmigración de las células cancerosas y cómo este proceso se compara con la extravasación de leucocitos. Nuestros resultados muestran que uno de los primeros pasos en la extravasación de células de cáncer de mama metastásico es la incorporación en la monocapa CE, que interrumpe de manera significativa la barrera CE y desplaza físicamente ECs, a veces conduce a completar la eliminación de ECs de la monocapa. A diferencia de la transmigración de leucocitos, la incorporación de células de cáncer no depende de el estado de activación del endotelio o rigidez sustrato subendotelial para células de melanoma y células de cáncer de mama. Curiosamente, la incorporación de células de páncreas depende del estado de activación del endotelio y la rigidez subendotelial. En conjunto, nuestros resultados indican que la extravasación de células de cáncer de mama metastásico implica una etapa adicional de incorporación en el endotelio, lo que no ocurre durante la extravasación de leucocitos.
Materiales y Métodos
Preparación de sustratos de gel de poliacrilamida
geles de poliacrilamida delgadas se prepararon en cubreobjetos de vidrio de acuerdo con el método primero descrito por Wang y Pelham [29] y descrito en detalle en nuestras publicaciones anteriores [19], [23], [30] - [33]. Brevemente, 280 kPa (15% de acrilamida + 1,2% de acrilamida bis) y 0,87 kPa (3% de acrilamida + 0,1% de acrilamida bis) geles se crean y se recubrieron con 0,1 mg /fibronectina ml (Sigma-Aldrich) como se describe anteriormente [19]. Caracterización de módulo de los geles de Young se llevó a cabo por microscopía de fuerza atómica y el análisis mecánico dinámico, mientras que el análisis de la fibronectina unida a la superficie se realizó por inmunofluorescencia [23], [32]. Para los experimentos sobre el vidrio, 22 × 22 mm cubreobjetos (Fisher Scientific) se recubrieron con 0,1 mg /ml de fibronectina durante 2 horas a temperatura ambiente.
Cultivo celular
células endoteliales de vena umbilical humana (Lifeline Cell Technology) se cultivaron como se ha descrito anteriormente [34]. MDA-MB-231 células metastásicas de cáncer de mama (ATCC) y células de melanoma A375 (ATCC) se cultivaron en DMEM, 10% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina. células de cáncer pancreático SW1990 (ATCC) se cultivaron en DMEM, 10% FBS, y 50 mg /ml de gentamicina. HUVEC (2-5 pasajes, 4 × 10
5 en total) se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos de fibronectina o geles de poliacrilamida y se desarrollaron durante aproximadamente 48 horas, momento en el cual una monocapa formada. Las células se trataron con medio de control o 25 ng /ml de factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) para las últimas 24 horas antes de los experimentos. En algunos experimentos, las células HUVEC fueron transfectadas con VE-cadherina-GFP (VEcadGFP) utilizando un adenovirus (ADV), que fue recibido como un generoso regalo del Dr. William Luscinskas (Harvard Medical School). el laboratorio del Dr. Luscinskas ha descrito previamente el procedimiento para la construcción del plásmido VEcadGFP y transferencia a un vector de expresión de adenovirus [35]. Las HUVEC se sembraron en geles de poliacrilamida recubiertas de fibronectina o cubreobjetos de vidrio y se le dio de 1-2 horas a extenderse, y se añadieron 3 l de AdV-VEcadGFP a las células con 2 ml de medio por sustrato. HUVECs se cultivaron a continuación a la formación de monocapa como se ha descrito anteriormente. Las monocapas se lavaron con PBS antes de la adición de HUVECs adicionales o células tumorales (1 × 10
5 células totales) a la superficie apical de la monocapa mm 22 × 22. Para distinguir entre las células HUVEC dentro de la monocapa y las células adicionales añadidos a la monocapa, añadieron células HUVEC o MDA-MB-231 se tiñeron con la lipófilo DIIC
16 colorante (1 M) en suspensión durante 5 minutos a temperatura ambiente , seguido de centrifugación y un lavado PBS.
imágenes de células vivas y análisis
microscopia de células vivas se completó en una etapa incubadora microscopio cerrado a 37 ° C, 5% de CO
2 y 55% de humedad usando un microscopio invertido (Olympus IX71). Las imágenes fueron capturadas, ya sea con un QImaging Retiga-SRV de carga acoplada dispositivo (CCD) cámara digital (QImaging Corporation) utilizando el software IPLab (Becton, Dickinson and Company), o con aa cámara digital QImaging Rolera-MGI CCD (QImaging Corporation) usando Slidebook software (versión 4.2.0.9; Innovaciones inteligentes Imaging). El contraste de fases, contraste de interferencia diferencial (DIC), y /o imágenes de fluorescencia timelapse fueron capturados utilizando un 20 × /0,45 NA Ph1 objetivo o un objetivo de aceite de 60 × /1,42 NA. La fracción de células incorporadas (HUVECs o MDA-MB-231) se calculó dividiendo el número de células que se incorporó en cualquier momento durante la secuencia de timelapse por el número total de células en fase-blanco por encima de la monocapa en el marco inicial de la secuencia. El tiempo para completar la incorporación se calculó usando la diferencia entre el tiempo cuando la célula empezó a extenderse en la monocapa y el tiempo cuando la célula alcanzó la máxima área de extensión dentro de la monocapa primero.
Interferencia reflexión microscopía
microscopía de interferencia de reflexión (IRM) se utilizó para detectar la superficie-a-superficie de interferencia entre los rayos de luz reflejada desde el sustrato /interfaz de medio y los de la interfaz de medio /célula, como se describe en nuestro trabajo previo [36] - [38] . En esta técnica, la intensidad de la luz es una medida de la proximidad de la célula a la superficie del vidrio, de manera que las áreas de la membrana más cercana a la superficie aparecen oscuros y los más alejados parecen más brillantes. Por lo tanto, IRM es un método óptimo en la evaluación de la unión celular, la adhesión, y la difusión de comportamiento [36] - [38]. Para los experimentos de difusión, 1 × 10
5 MDA-MB-231 células se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos de fibronectina 22 × 22 mm en los medios de HUVEC, dando como resultado la observación de células individuales. Para estos experimentos, un microscopio invertido (Olympus IX71) con una lente de objetivo de aceite 60 × /1,42 NA y una lámpara de mercurio de 100 W (Olympus, que se utiliza en la longitud de onda 561) se utilizó en combinación con una cámara CCD (cámara Retiga SRV, QImaging) para la captura de imágenes. Los experimentos se realizaron en una cámara de microscopio cerrado que mantiene las condiciones de cultivo a 37 ° C, 50% de humedad, y 5% de CO
2. Durante la propagación de células, una trama se registró cada 5 segundos durante un período de 1 μhour para N = 5 experimentos independientes. Para evaluaciones estadísticas de las áreas de extensión, las imágenes fueron analizados utilizando ImageJ (National Institutes of Health) de software. Los celulares fronteras fueron trazadas por la mano y el área se calculó utilizando rutinas ImageJ. Áreas de células MDA-MB-231 se extienden en una monocapa HUVEC también se trazaron a mano y comparación con las células individuales se extienden en el cubreobjetos sin endotelio.
Imagen confocal
Un total de 1 × 10
5 MDA-MB-231 células fueron transfectadas con 10μL de CellLight actina-GFP (Life Technologies) según el protocolo del fabricante y se dejó incubar durante 24 horas. Después de 24 horas, infectadas se introdujeron MDA-MB-231 células a una confluentes HUVEC monocapa y se dejaron incorporar durante 15 horas. Después de la incorporación, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se tiñeron utilizando de Texas-Red faloidina (Invitrogen). imágenes Z-stack se recogieron usando un microscopio confocal Zeiss LSM 710 con un objetivo de 63 × petróleo.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se completó mediante el uso de una prueba t de Student entre pares de datos, o mediante el uso de ANOVA para grupos de datos, donde P & lt; 0,05 indican significación estadística. Después de ANOVA, múltiples comparaciones se realizaron utilizando el criterio de diferencia honestamente significativa de Turquía. se reportan aquí todas las mediciones en el formato de media ± error estándar.
Resultados
La incorporación en el endotelio es el primer paso en la célula de cáncer metastásico transmigración
MDA-MB-231 se introdujeron células de cáncer de mama metastásico en la superficie apical de una monocapa de EC y controlados en su interacción con el endotelio (Película S1). Inicialmente, MDA-MB-231 células eran de color blanco brillante y esférica en contraste con el endotelio subyacente oscurecida fase y aplanada (Fig. 1A). Dentro de varias horas, las células MDA-MB-231 comenzaron a incorporar en el endotelio, en un proceso que varió en promedio de 40 a 60 minutos (Fig. 1B) y era visualmente distinta de la transmigración de neutrófilos a través del endotelio (Fig. 1C) . Específicamente, parecía que el ECs adyacente al sitio de incorporación se desplaza físicamente, la creación de huecos para la célula MDA-MB-231 a extenderse sobre la matriz subyacente (Fig. 1A), mientras que los neutrófilos exprimido a través del endotelio sin perturbar la monocapa ( Fig. 1C). Algunos ECs separado de la matriz subyacente, redondeado y se convirtió esférica después de la incorporación de las células MDA-MB-231 en la monocapa (Fig. 2). Aproximadamente el 25% de la ECs individual después de la incorporación de células de cáncer (Fig 2). Sin embargo, la incorporación de células MDA-MB-231 en el endotelio producido más lentamente, con una pendiente menor del "área de extensión en función del tiempo", y tenía una zona final de las celdas inferiores en comparación con MDA-MB-231 células se extienden sobre un endotelio libre sustrato recubiertos de fibronectina (Fig. 3D), lo que indica que el endotelio no estaba a favor de la incorporación de la célula cancerosa, pero bastante limitado en general área de extensión. Además, la incorporación de células MDA-MB-231 en el endotelio se produjo más lentamente, con una pendiente menor de "incorporación acumulativa en función del tiempo", en comparación con ECs incorporar en una monocapa de ECs (Fig. 3A). Por lo tanto, es probable que la incorporación de las células MDA-MB-231 en el endotelio se produce por un mecanismo diferente que ECs nativas de propagación en el mismo endotelio. También se introdujeron células de melanoma A375 y células pancreáticas SW1990 a la superficie apical del endotelio. De manera similar a las células MDA-MB-231, las células de melanoma y células pancreáticas comenzaron a incorporar en el endotelio en un proceso que duró aproximadamente 15 minutos y 50 minutos respectivamente. células cancerosas A375 incorporados en la monocapa a un ritmo mucho más rápido en comparación con las células de cáncer de mama metastásico y su dinámica de incorporación de cerca parecía a la de ECs nativo difusión en la monocapa CE. las células de melanoma A375 tenía una fracción final de la incorporación que se asemejaba a la difusión de los CE en los CE, mientras que las células cancerosas SW1990 tenían una fracción mucho menor de incorporación en comparación con todos los grupos (Figura 3C). Además, las imágenes confocal (Fig 4A) revelaron que después de 15 horas de incorporación, MDA-MB-231 (verde) las células desplazadas ECs (rojo) mediante la difusión entre ECs adyacentes. proyecciones ortogonales muestran que MDA-MB-231 células son, de hecho, la difusión entre ECs y no migrar debajo de ellas durante la incorporación (Fig 4B).
(A) Imagen de contraste de fase de células MDA-MB-231 (blanco brillante ) encima de una monocapa endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). La barra de escala es de 20 micras. (B) de células MDA-MB-231 (flechas negras) comienza a incorporar en el endotelio, como lo indica su cambio en la microscopía de contraste de fase de color blanco brillante a oscuro. La barra de escala es de 20 micras y se aplica a todas las imágenes en el panel B. Período de tiempo después de la siembra de células MDA-MB-231 se indica en el endotelio en la esquina superior derecha de cada imagen en formato hora: segundo: minuto. El porcentaje final de incorporación para este experimento fue 95%. secuencia de imágenes (C) de contraste de fase de un transmigración de neutrófilos a través de un endotelio TNF-α-activado. La barra de escala es de 20 micras y se aplica a todas las imágenes en el panel C. Período de tiempo después de la siembra neutrófilos sobre el endotelio se indica en la esquina superior derecha de cada imagen en horas: minutos:. formato segunda
contraste de fase (izquierda) y DIIC
16 fluorescencia (derecha) imágenes de las células MDA-MB-231 en placas sobre una monocapa de HUVEC no tratadas, en puntos de tiempo inmediatamente después de la siembra (arriba) y después de 16 horas de interacción con el endotelio (abajo ). Las flechas rojas apuntan a eliminar las células blancas que no emiten fluorescencia; éstas son las células endoteliales que han sido forzados a salir de la monocapa y por lo tanto se han desprendido y se redondean. La barra de escala es de 25 micras y se aplica a todas las imágenes.
(A) fracción acumulada de EC o de células MDA-MB-231 (231), SW1990 (1990), y las células A375 incorporado en el endotelio como una función del tiempo después de la siembra. Los puntos de datos representan la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes (N & gt; 20 células para cada experimento). (B) fracción final de MDA-MB-231 células incorporadas en el endotelio tratados con TNF-α no tratada o después de 15 horas. Las barras representan la media, mientras que las barras de error representan SEM de al menos 3 experimentos independientes. P & gt; 0,05 entre estos valores indica que no hay diferencia estadística (n.s.). (C) fracción final de MDA-MB-231 células de cáncer de mama, ECs, células A375 de melanoma y células SW1990 pancreáticas incorporados en el endotelio después de 15 horas. Las barras representan la media, mientras que las barras de error representan SEM de al menos 3 experimentos independientes. (*) Indica la significación (P & lt; 0,05) en comparación con los EC. (D) Parcela de área de extensión en función del tiempo revela diferencias en la difusión de la dinámica de 231-MDA-MB células se extienden sobre un cubreobjetos recubiertos de fibronectina ( "células individuales") o en un endotelio sin tratar ( "en monocapa").
(a) un representante de la MDA-MB-231 (verde; actina-GFP) de células infectadas con GFP-actina se muestra en la difusión de una monocapa de HUVEC (rojo; faloidina). se muestran las proyecciones ortogonales. (B) Esquema que muestra que una célula cancerosa (verde) desplaza EC (rojo) mediante la difusión entre los EC adyacentes durante la incorporación.
La activación del endotelio por el TNF-α no afecta a la dinámica de incorporación de cáncer de mama y células de melanoma
la activación del endotelio es un paso clave en la cascada de adhesión de leucocitos, y nuestro trabajo previo ha demostrado que la transmigración de leucocitos depende en gran medida del estado de activación del endotelio [19], [28], [ ,,,0],30]. La activación del endotelio por el TNF-alfa no sólo regula positivamente las moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y la adhesión celular vascular molécula-1 (VCAM-1), pero también aumenta la contractilidad CE [31] y reduce la función de barrera CE [20]. Por lo tanto, nuestra siguiente objetivo fue determinar si la incorporación de células de cáncer de mama metastásico en el endotelio requiere la ECs para ser activado. Curiosamente, se encontró que la fracción acumulada de incorporación en función del tiempo de las células MDA-MB-231 era similar, independientemente de si el ECs fueron tratados con TNF-α (Fig. 3A). Además, la fracción final de las células que incorporaron en un endotelio activado-TNF-α después de 15 horas no fue diferente de la fracción incorporada en un endotelio sin tratar (Fig. 3B). Por último, el tiempo requerido para completar la incorporación (de una esfera redondeada a una célula aplanada dentro del endotelio) no depende de si el endotelio se trató con TNF-α (Fig. 5C). Similares a las células de cáncer de mama, la fracción de incorporación de células A375 de melanoma en ECs fue comparable, sin importar si el ECs fueron tratados con TNF-α (Fig S1). Estos resultados sugieren que algunas células cancerosas metastásicas son capaces de completar las primeras etapas de la extravasación, incluso en ausencia de un estímulo inflamatorio. Sin embargo, la fracción de incorporación después de 15 horas para las células pancreáticas SW1990 fue estadísticamente diferente entre sin tratar ECs y los tratados con TNF-α (Fig S2). células SW1990 incorporados a un ritmo mucho más rápido y mayor fracción de TNF-α tratados con EC en comparación con los no tratados ECs.
(A) fracción acumulativa de células MDA-MB-231 incorporados en las células endoteliales en un 0,87 recubiertos de fibronectina 280 kPa o gel de poliacrilamida kPa, o de vidrio (50 GPa). Los puntos de datos representan la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes (N & gt; 20 células para cada experimento). (B) fracción final de MDA-MB-231 células incorporadas en el endotelio (sin tratar) como una función de la rigidez del sustrato subendotelial. Las barras representan la media, mientras que las barras de error representan SEM de al menos 3 experimentos independientes. P & gt; 0,05 entre estos valores indica que no hay diferencia estadística (n.s.). (C) Tiempo de MDA-MB-231 células para completar la incorporación es independiente de las propiedades mecánicas del sustrato por debajo de las células endoteliales. Las células endoteliales sobre cubreobjetos recubiertos de fibronectina de vidrio (50 GPa) o geles de poliacrilamida (0,87 kPa o 280 kPa) se dejaron sin tratar (sin TNF) o tratadas con TNF-α (TNF). No hubo diferencia estadística en el tiempo de incorporación se midió como una función de la rigidez subendotelial sustrato o el tratamiento de células endoteliales (P & gt; 0,05).
La incorporación es independiente de la rigidez del sustrato subendotelial de las células del cáncer de mama y melanoma
Nuestro trabajo previo ha demostrado también que la transmigración de leucocitos depende de las propiedades mecánicas del sustrato por debajo de las células endoteliales [19], [30]. Más rígidos matrices subendoteliales promueven la miosina de cadena ligera quinasa dependiente de la contractilidad CE, dando lugar a fisuras intercelulares y mejorada de leucocitos transmigración [19], [30]. Por lo tanto, nuestro siguiente objetivo era establecer si la incorporación de células de cáncer de mama metastásico en el endotelio fue dependiente de la rigidez del sustrato subendotelial. A diferencia de la transmigración de neutrófilos, que aumenta con la rigidez sustrato subendotelial, la dinámica de la incorporación de células MDA-MB-231 en el endotelio fueron similares para suave (0,87 kPa), el intermedio (280 kPa), y muy rígido (vidrio; 50 GPa) sustratos subendoteliales (Fig. 5A). Además, la fracción final incorporado de MDA-MB-231 en el endotelio fue independiente de subendotelial rigidez sustrato (Fig. 3B). y el tiempo total necesario para completar la transmigración era independiente de la rigidez del sustrato subendotelial (Fig. 5C). células A375 de melanoma incorporados en matrices subendoteliales suaves, intermedios, y muy rígidos con la dinámica de incorporación y similares fracción final de la incorporación a las células de cáncer de mama (Fig S3). células pancreáticas SW1990 muestran un comportamiento diferente de las células de melanoma y células de cáncer de mama (Fig S4). Cuando las células SW1990 se sembraron en sustratos blandos e intermedios, que muestran un nivel similar de la dinámica de incorporación y fracción final de la incorporación al cabo de 15 horas (figura S4). Sin embargo, cuando se les permite incorporar en matrices muy rígidos (vidrio; 50 GPa), que muestran una fracción mucho menor de incorporación y tasa de incorporación más lenta. Mientras que los pasos posteriores de la cascada metastásica pueden depender de la rigidez del sustrato, nuestros resultados indican que las primeras etapas de la extravasación de células de cáncer de mama y la extravasación de melanoma se producen independientemente de las propiedades mecánicas de la matriz por debajo del endotelio, mientras que la incorporación de células pancreáticas cambia sobre sustratos muy rígidos.
las células endoteliales no expresan cadherina VE a lo largo de las fronteras con células de cáncer de mama incorporados
Vascular cadherina endotelial (VE-cadherina) es una de las moléculas de adhesión homofílicas clave expresadas por ECS en el célula-célula fronteras en una monocapa confluente. La integridad del endotelio vascular como una barrera depende en gran medida del buen funcionamiento de VE-cadherina moléculas de adhesión [39], [40]. Como ECs incorpora en un endotelio confluente saludable, GFP-VE-cadherina se expresó por todo ECs vecinos de la DIIC incorporado
16 marcado con CE (Fig. 6A, la película S2), lo que indica que la adición de nuevas EC sobre la monocapa no lo hizo interrumpir la integridad de las uniones de la CE. A continuación trató de identificar los posibles cambios en la VE-cadherina morfología después de la incorporación de las células MDA-MB-231 en el endotelio. Sorprendentemente, los CE de vecinos DIIC
16-etiquetados células MDA-MB-231 no expresaban GFP-VE-cadherina en límites con las células MDA-MB-231, a pesar de que continuaron expresando GFP-VE-cadherina en los cruces con otros CE (Fig. 6B). Estos resultados indican que la etapa temprana de la extravasación de células de cáncer no sólo afecta a la adhesión célula-célula-cadherina VE-dependiente, pero también pueden proporcionar una ruta de fácil acceso de la extravasación de otras células tumorales circulantes
.
DiIC16 marcado con HUVECs (A) o MDA-MB-231 (B) se sembraron en las células endoteliales que expresan cadherina VE-GFP (VE-cad-GFP). Las imágenes fueron capturadas después de la incorporación de cada tipo de célula. La barra de escala es de 10 micras y se aplica a todas las imágenes en esta figura.
incorporación de células de cáncer de mama inicia dislocando VE-cadherina en los cruces de células endoteliales
Antes de la aparición de la MDA- MB-231 incorporación en el endotelio, se observó intacta GFP-VE-cadherina en la unión CE directamente debajo de la célula MDA-MB-231 (Fig 7A;. flechas rojas, Película S2). Esto estaba en contraste directo con las células MDA-MB-231 que se incorporaron en el endotelio en los puntos de tiempo anteriores, donde GFP-VE-cadherina se expresa no por la vecina ECS (figura 7A;. Flechas amarillas). La primera etapa de incorporación creado una interrupción en GFP-VE-cadherina en la unión CE directamente debajo de la célula MDA-MB-231, lo que lleva a la formación de un pequeño (~ 2 m
2) agujero en la unión CE (Fig . 7B; flecha roja). Un segundo agujero pequeño a veces formado (figura 5B;. Dos flechas rojas) antes de que el vacío se convirtió en significativamente mayor (~ 33 m
2 a T = 6:35) y se aclaró la zona de una parte del cuerpo de la CE. Por último, lo que comenzó como un pequeño hueco en el GFP-VE-cadherina propagada en un enorme agujero en el endotelio, que llegó a ser ocupada por el celular MDA-MB-231 (Fig. 7B). También se observó el desplazamiento y la reestructuración de la significativa GFP-VE-cadherina en los cruces CE-CE cercanos (Figura 7B;. flechas amarillas).
DIIC
se sembraron células MDA-MB-231 16-etiquetados en las células endoteliales que expresan cadherina VE-GFP (VE-cad-GFP). (A) Se muestran contraste de interferencia (DIC), DIIC
16 de fluorescencia diferencial (rojo), y fluorescencia (verde) GFP-cadherina VE-y superposición de imágenes. En este punto de tiempo, uno MDA-MB-231 ya ha incorporado en el endotelio (flechas amarillas), y la VE-cadherina-GFP está todavía intacto en la ubicación directamente debajo de otra célula MDA-MB-231 que aún no ha comenzado a incorporar (flechas rojas). secuencia timelapse (B) de la fluorescencia de un DIIC
células MDA-MB-231 16 marcado con (rojo) incorporar en un endotelio que expresa cadherina VE-GFP (verde). Período de tiempo después de la siembra de células MDA-MB-231 en el endotelio se indica en la esquina superior derecha de cada imagen en formato hora: minutos. La barra de escala panel A (imagen DIC) en es de 10 micras y se aplica a todas las imágenes en esta figura.
Discusión
la metástasis del cáncer sigue siendo una causa principal de muerte en los pacientes con cáncer [1], [2], y uno de los pasos críticos que regulan la metástasis es la extravasación de la vasculatura. Si bien los mecanismos que regulan este proceso no están claros, el endotelio se sabe que juega un papel importante, en calidad de ya sea una barrera para algunas células de cáncer, o un promotor de la capacidad invasiva en otras células de cáncer incluyendo MDA-MB-231 [15], [ ,,,0],41]. CE apoptosis y el aclaramiento de la membrana basal previamente han sido reportados como efectos secundarios durante la extravasación de células de cáncer [10], [13]. De manera similar, los esferoides de células tumorales de ovario desplazan células mesoteliales durante la intercalación en el espacio submesotelial [16].