Extracto
Diseño del estudio
Para investigar los mecanismos específicos por los cuales Golgi fosfoproteína 3 (GOLPH3) afecta a la progresión del cáncer gástrico y explorar su significado clínico.
métodos
se realizó un análisis inmunohistoquímico para evaluar las correlaciones entre GOLPH3, mTOR fosforilada (p-mTOR), Akt fosforilada (p-Akt), p70S6 fosforilada (p-p70S6), fosforilada 4E-BP1 (p-4E -BP1) y las características clinicopatológicas de cáncer gástrico. Los niveles de expresión de ARNm de GOLPH3, mTOR, Akt, p70S6 y 4E-BP1 en el cáncer gástrico, el carcinoma adyacente y el tejido normal emparejado se analizaron mediante RT-PCR. Se utilizó el Western Blot para determinar la expresión de la proteína de GOLPH3, p-mTOR, p-Akt, p-p70S6 y p-4E-BP1 en los tejidos.
Resultados
Los niveles de proteína de alta expresión GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p70S6, p-4E-BP1 se asoció positivamente con el grado histológico (
p Hotel & lt; 0,05), la profundidad de la invasión (
p Hotel & lt; 0,05 ), metástasis a distancia (
p Hotel & lt; 0,05) y el compromiso de los ganglios linfáticos (
p Hotel & lt; 0,05). En comparación con el carcinoma adyacentes y los tejidos normales emparejados, los niveles de expresión de ARNm de GOLPH3, AKT, mTOR, p70S6 y 4EBP1 en tejidos de cáncer gástrico fueron significativamente más altas. Los niveles de expresión de proteínas de GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p-p70S6 y p-4E-BP1 en los tejidos de cáncer gástrico fueron también significativamente más alta que en el carcinoma adyacentes y los tejidos normales emparejados. Se observó una fuerte correlación positiva entre GOLPH3, p-mTOR, p-p70S6 y la expresión de p-4EBP1 (
r = 0,410
, 0,303 y 0,276, respectivamente,
p Hotel & lt; 0,05), pero no se observó correlación significativa entre la expresión de GOLPH3 y p-Akt.
Conclusiones
el nivel de expresión GOPLH3 está altamente correlacionado con la señalización Akt /mTOR en muestras de cáncer gástrico humano. GOLPH3 combinada con la activación de la señalización Akt /mTOR puede desempeñar un papel importante en el desarrollo, la diferenciación, invasión y metástasis de cáncer gástrico
Visto:. Peng J, Fang Y, Y Tao, Li K, Su T, Nong Y, et al. (2014) Mecanismos de GOLPH3 asociados con la progresión del cáncer gástrico: un estudio preliminar. PLoS ONE 9 (10): e107362. doi: 10.1371 /journal.pone.0107362
Editor: Yuan-Soon Ho, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 13 Junio, 2014; Aceptado: August 7, 2014; Publicado: 6 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. están disponibles a partir del manuscrito y las cifras de todos los datos
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación de Tecnología Apropiada Guangxi Salud y Proyecto de Desarrollo (Grant número: S201415-01). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de que las estadísticas mundiales muestran que el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común en hombres y el quinto cáncer más común en las mujeres, la mortalidad por cáncer gástrico ocupa el segundo lugar sólo después del cáncer de pulmón [1]. La incidencia global de cáncer gástrico ha ido disminuyendo desde la Segunda Guerra Mundial [2]. Sin embargo, en los países en desarrollo, entre ellos China, la morbilidad y la mortalidad del cáncer gástrico han mantenido altos. el tratamiento del cáncer gástrico ha mejorado en los últimos años, pero la mayoría de los pacientes aún son diagnosticadas con cáncer gástrico avanzado, con frecuencia incluyendo la invasión y metástasis a distancia, lo que lleva a un tipo de efecto del tratamiento insatisfactorio. Dado que el cáncer gástrico presenta una amenaza significativa para la salud humana y de la vida, es crucial para entender la patogénesis del cáncer gástrico en el proceso de tumorigénesis, la invasión y la metástasis para orientar el diagnóstico y tratamiento precoz
.
Está comúnmente aceptado que la formación de tumores implica la regulación deficiente de numerosos oncogenes, genes supresores de tumores y genes relacionados con la metástasis-Golgi fosfoproteína 3 (GOLPH3), que también se conoce como GPP34, GMx33, o MIDAS, es una proteína de membrana de 34 kD que fue identificado inicialmente en el ratón aparato de Golgi mediante análisis proteómicos [3]. GOLPH3 pertenece a la familia de proteínas de la matriz de Golgi, que está altamente conservada de la levadura a los seres humanos [4]. Después de GOLPH3 se ha modificado en traslación, se conecta dinámicamente a la matriz de Golgi negativo, transportado rápidamente a través de la red trans-Golgi (TGN) al citoplasma, y se distribuye en vesículas de membrana de plasma y células endocrinas [4]. Varios estudios han demostrado que GOLPH3 está involucrado en anterógrada y retrógrada tráfico de Golgi, los receptores de reciclaje, y la glicosilación del aparato de Golgi a la membrana plasmática; GOLPH3 también juega un papel en las interacciones del citoesqueleto y el mantenimiento de la estructura de Golgi [4] - [7]. Scott et al. primero identificado el papel oncogénico de GOLPH3 al revelar su importante papel en la diferenciación celular y la proliferación del tumor y su presencia en muchos cánceres sólidos [8]. Curiosamente, algunos estudios han sugerido que GOLPH3 regula las células cancerosas mediante la mejora de mamíferos objetivo de rapamicina actividad (mTOR). mTOR es una proteína quinasa de serina /treonina y un integrador clave de las vías de fosfatidil-inositol-3 quinasa (RTK-PI3K) conocido para regular el crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia en las células cancerosas humanas [9] - [10]. Muchos estudios están investigando la relación entre el GOLPH3 y varios cánceres sólidos Sin embargo, no hay pruebas suficientes para apoyar la hipótesis de que la expresión GOLPH3 se asocia con la progresión humana cáncer gástrico y el pronóstico, y la base mecánica mediante la cual GOLPH3 afecta el proceso tumoral, invasión y metástasis de cáncer gástrico sigue siendo poco clara. En este estudio, se investigó significados clínicos de GOLPH3 y AKT /mTOR señalización en el cáncer gástrico. Mientras tanto, descubrimos la relación de GOPLPH3 y señalización Akt /mTOR en el cáncer gástrico para revelar el papel potencial de GOLPH3 en la regulación de mTOR mediada por cáncer gástrico tumorigénesis, la invasión y la metástasis.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
Todos los procedimientos del estudio fueron revisados y aprobados por el Consejo de Ética Institucional de Revisión del primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Guangxi y llevaron a cabo de acuerdo con los principios expresados en la declaración de Helsinki. El consentimiento informado fue eximido por la junta debido a las muestras frescas se manejaron de forma anónima de acuerdo con las normas éticas y legales.
Las muestras de tejido y los datos clínicos selección
Las muestras de tejido fresco se obtuvieron de ochenta pacientes con cáncer gástrico que se sometieron a tratamiento quirúrgico en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Guangxi durante el período comprendido entre enero de 2012 hasta enero de 2013. tejidos cancerosos y carcinoma adyacentes (3 cm de distancia del cáncer) y los tejidos normales emparejados fueron obtenidos de cada paciente , y el paciente fue diagnosticado de forma independiente por dos patólogos experimentados de acuerdo con el American Joint Committee on Cancer criterios [11]. estaban disponibles para los pacientes con diagnóstico de cáncer gástrico datos clínicos originales completos. El grupo incluyó a 36 mujeres y 44 varones, con una edad media de 55,4 ± 13,1 años (rango 27-75 años). Características adicionales de los pacientes se muestran en la Tabla 1, la cirugía de la Tabla 2 y la Tabla 3. Los pacientes que reciben quimioterapia o radioterapia antes o que tenían un historial de otros tumores fueron excluidos. En los siguientes estudios, una porción de la muestra tomada durante la cirugía fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y posteriormente almacenados a -80 ° C, y una parte se fijó en formalina al 10% durante 24 horas y embebidos en parafina.
la inmunohistoquímica
muestras incluidas en parafina se seccionaron en secciones de 3 micras de espesor de los tejidos normales, muestras de carcinoma adyacente, y emparejado cancerosas y montados sobre vidrio diapositivas. Las secciones se cocieron inicialmente a 65 ° C durante 2 h. A continuación, las secciones se desparafinaron en 100% de xileno y se rehidrataron en una serie de etanol descendente (100%, 90%, 80% y 70% de etanol) y agua destilada de acuerdo con protocolos estándar. A continuación, las secciones se sumergieron en el tampón de recuperación antigénica citrato, se calienta en un autoclave, y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después las secciones se lavaron en PBS tres veces durante cinco minutos, se añadió 3% de peróxido de hidrógeno para bloquear la actividad peroxidasa endógena y el antígeno no específico de unión a temperatura ambiente durante 20 min. Después de lavar de nuevo con PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo específico en una cámara húmeda durante la noche a 4 ° C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo GOLPH3 en 1:100, anticuerpo p-mTOR en 1:200, anticuerpo p-Akt en 1:200, anticuerpo p-p70S6 en 1:100, y el anticuerpo-BP1 p-4E en 1 :200. Para el control negativo, el anticuerpo primario se sustituyó por PBS, y se llevaron a cabo los pasos restantes como se describe anteriormente. A continuación, las muestras se lavaron con PBS, y se añadió un agente polímero de refuerzo a las secciones a temperatura ambiente durante 20 min. Después del lavado, las secciones de tejido se trataron con cabra marcado con HRP IgG anti-conejo, biotinilado anti-inmunoglobulina de conejo, y el reactivo complejo de peroxidasa de estreptavidina durante 30 min. Las secciones fueron visualizados en solución fresca 3-3 'diaminobencidina, contratinción con hematoxilina, y ácido clorhídrico 0,1% (para ayudar a la separación de colores). Por último, los portaobjetos se montaron en la goma neutra y se analizaron con un microscopio de campo brillante.
El grado de inmunotinción de cada sección de tejido fue evaluada de forma independiente por dos patólogos experimentados que eran ciegos a los datos clínicos de los pacientes. Los niveles de expresión de proteínas se evaluaron utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo basado en el porcentaje total de las células tumorales teñidas positivamente y la intensidad de la tinción. El porcentaje de células teñidas positivamente se puntuó de acuerdo a los siguientes criterios: 0 (células ≤5% positivas tumorales teñidas), 1 (células tumorales positivas 6-25% teñido), 2 (células tumorales positivas 26-50% teñido), 3 (células tumorales positivas ≥51% teñido). La intensidad de la tinción se puntuó en una escala de 0 a 3 como sigue: 0 (sin tinción), 1 (débil tinción = amarillo claro), 2 (tinción moderada = amarillo-marrón), 3 (fuerte tinción = marrón). Para el análisis, las puntuaciones agregadas & lt; 4 fueron definidos como una baja expresión, y las puntuaciones ≥ 4 fueron definidos como de alta expresión
Transcripción reversa reacción de polimerasa en cadena
ARN total fue extraído a partir de tejidos frescos utilizando. reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores de RT-PCR utilizados en el estudio fueron diseñados y sintetizados por Ingeniería Shanghai Sangon tecnología biológica & amp; Servicios Co. Ltd. β-actina se utilizó como referencia interna. La información relativa a las secuencias de los cebadores utilizados en el estudio se muestra en la Tabla 4. La RT-PCR se realizó usando un método de dos pasos. Un microgramo de ARN total fue inverso-transcrito en cDNA a 37 ° C durante 60 min y 85 ° C durante 5 s. PCR se realizó de acuerdo con las condiciones siguientes: calentamiento a 95 ° C durante 5 min; 40 ciclos de desnaturalización durante 30 s a 95ºC, hibridación a 60 ° C durante 30 s, y la extensión durante 30 s a 72 ° C; y extensión final a 72 ° C durante 7 min antes de la reacción se almacenó a 4 ° C. Siete microgramos de producto final de PCR se cargaron en un gel de agarosa al 2% para electroforesis y el análisis de imagen bajo luz ultravioleta. Se utilizó el programa de software Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) para medir las bandas y el valor de gris β-actina de los productos de PCR.
Western Blot
Las muestras de tejido normal, carcinoma-adyacente y emparejado cancerosas se pesaron y se planta en trozos pequeños en nitrógeno líquido. Pre-PBS enfriado se utiliza para lavar las muestras, que luego se centrifugaron a 5000 rpm a 4 ° C durante 5 min. Después de lavar tres veces con PBS, se añadieron previamente enfriado tampón de lisis de fosfato y PMSF. La muestra se sometió a ultrasonidos a 180 W a 4 ° C durante 5 min y se centrifugó a 1000 rpm a 4 ° C durante 5 min; a continuación, el sobrenadante se retiró inmediatamente, y la concentración de proteína se cuantificó por el ensayo de Bradford utilizando un kit comercial comprado de Bio-Rad Laboratories. Los sobrenadantes se mezclaron con tampón de carga y se hierve a 100 ° C durante 5 min para desnaturalizar las proteínas. Las cantidades iguales de cada muestra se cargaron en los pocillos de un gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida 4-12%, electroforesis, y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno. La membrana se bloqueó con tampón de BSA 5% durante 1 h con agitación y después se incubó a 4 ° C durante la noche con los anticuerpos primarios individuales diluidos en TBST. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: policlonal de conejo anti-humano GOLPH3 (1:1000, Abcam plc, Cambridge, Reino Unido), policlonal de conejo anti-humano p-p70S6 (Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EE.UU.), de conejo policlonal anti-humano de p-Akt (Ser473) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EE.UU.), conejo monoclonal anti-humano p-mTOR (Ser2448) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EE.UU.) y el conejo monoclonal anti-humano de p-Akt (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EE.UU.). La membrana se lavó con TBST cinco veces durante cinco minutos cada uno, y de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo IgG anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology, SC-2004) se añadió antes de la incubación a temperatura ambiente durante 1,5 h con agitación. β-actina se utilizó como control interno. Después de lavar con TBST tres veces durante cinco minutos, se detectó la banda de interés usando el primer kit ECL Western Blot (Shanghai Pufei Biotecnología, Shanghai, China), y el software de análisis Quantity One (Bio-Rad, CA, EE.UU.) se utilizó para evaluar los datos de densitometría.
los análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico para las Ciencias Sociales, versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Los resultados de transferencia de RT-PCR y occidentales se presentan como la media ± SE. Un ANOVA de una vía seguido de pruebas de rango múltiple de LSD se utilizó para analizar las diferencias entre los grupos. Las relaciones entre GOLPH3 y p-mTOR, p-Akt, p-4E-BP, y los niveles de expresión de p-p70S6 se estimaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Las asociaciones entre la expresión de la proteína y las variables clinicopatológicas se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. P & lt; 0,05 (dos colas) se utilizó como nivel de significación estadística
Resultados
Las relaciones entre las variables clínico y los niveles de expresión de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica
La detección inmunohistoquímica. mostraron que GOLPH3, p-Akt, y p-4E-BP1 fueron más comunes en el citoplasma, y fosforilados m-TOR (p-mTOR) también estaba presente en el núcleo en un nivel bajo. Sin embargo, se observó p-p70S6 tinción sólo en el citoplasma. GOLPH3 y proteínas de la vía /mTOR Akt fosforilada fueron más altamente expresado en el grupo de cáncer gástrico que en el tejido para-carcinoma y los grupos de mucosa normal emparejados (Figura 1, Tabla 5). Por otra parte, las relaciones entre la expresión variables clínico y proteínas fueron examinados y se resumen en la Tabla 1, Tabla 2 y la Tabla 3. El análisis estadístico reveló que la tasa de expresión positiva de GOLPH3 en el grupo de cáncer gástrico fuertemente correlacionada con el grado histológico (
p = 0,011
), la profundidad de la invasión (
p = 0,007
), metástasis a distancia (
p
= 0,002), y el compromiso de los ganglios linfáticos (
p
& lt; 0,004), mientras que no se correlacionó significativamente con la edad o el sexo (
p = 0,801
y 0,833, respectivamente). Curiosamente, se observó que los altos niveles de expresión de p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 para ser consistente con la expresión de alto GOLPH3
A:. El grupo de cáncer gástrico B: El carcinoma -Junto grupo tejido C: El grupo de tejido normal emparejado. secciones de tejido representante del grupo de cáncer gástrico (n = 80), el grupo de carcinoma de tejido adyacente (n = 80) y el grupo emparejado tejido normal (n = 80). resultados de inmunohistoquímica demostraron que la GOLPH3, p-Akt, p-mTOR y p-4E-BP1 se expresó más en el núcleo, el p-p70S6 fue más expresa en el citoplasma. El GOLPH3, vía Akt fosforilada-mTOR Signaling, p-4E-BP1 y p-p70S6 fueron altamente expresado en los grupos de cáncer gástrico.
expresión del ARNm de GOLPH3 y mTOR señalización relacionadas con los genes de la vía, por RT-PCR
Se extrajeron los ARN de cáncer gástrico, el tejido para-carcinoma, y muestras de tejidos normales emparejados de ochenta pacientes con cáncer gástrico. Los niveles de expresión de GOLPH3 y mTOR señalización relacionadas con los genes de la vía, incluyendo Akt, mTOR, traducción eucariótica factor de iniciación 4E proteína de unión 1 (4E-BP1), y la proteína p70 ribosomal S6 quinasa (p70S6), se evaluaron en los tres grupos de RT -PCR. Los niveles de expresión de estos genes en el carcinoma gástrico fueron mayores que en tejidos de carcinoma-adyacente y significativamente mayor que en los tejidos gástricos normales emparejados. La densidad media y la distribución de la expresión de GOPLH3, mTOR, Akt, 4E-BP1 y p70S6 se muestran en la figura 2. Un análisis estadístico reveló que los niveles de expresión de GOLPH3 y mTOR de señalización relacionadas con los genes de la vía-fueron significativamente diferentes en los diferentes tejidos gástricos (
p Hotel & lt; 0,05)
cáncer:. El grupo de cáncer gástrico (n = 80); paracancerous: El grupo de tejido paracancerous (n = 80); normal: El grupo apareado normal de la mucosa gástrica (n = 80). A, B, C, D y E: Los niveles de mRNA de GOPLH3, Akt, mTOR, 4E-BP1, p70S6 en la diferente medida por RT-PCR, respectivamente. F, G, H, I y J: cuantificación densitométrica de expresión GOLPH3, Akt, mTOR, 4E-BP1 y mRNA p70S6 en diferentes tejidos, respectivamente. La expresión de mRNA fue significativamente diferente entre sí y alcanzó el cáncer. Los datos se presentan como la media ± SE. *
p Hotel & lt; 0,05 frente a cáncer,
#
p
. & Lt; 0,05 frente a paracancerous
Expresión de proteínas de señalización mTOR GOLPH3 y proteínas relacionadas con la vía por el Western Blot
Western Blot análisis mostró que GOLPH3, p-mTOR, p-Akt1, p-4EB-P1 y P-p70S6 también se expresaron en el cáncer gástrico, el carcinoma adyacente, y emparejados mucosa gástrica normal grupos. Curiosamente, se observó un aumento progresivo en los valores medios de los mencionados niveles de expresión de proteínas del grupo de mucosa gástrica normal emparejado Para el grupo de cáncer gástrico (Figura 3), y no hubo una diferencia significativa entre los grupos (
p
& lt; 0,05)
A:. los niveles de proteína de GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 en los diferentes medidos por el Western Blot. B, C, D, E y F: El GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 niveles de proteína en los diferentes tejidos, respectivamente. Cáncer: El grupo de cáncer gástrico (n = 80); paracancerous: El grupo de tejido paracancerous (n = 80); normal: El grupo apareado normal de la mucosa gástrica (n = 80). Los datos se presentan como la media ± SE. *
p Hotel & lt; 0,05 frente a cáncer,
#
p
. & Lt; 0,05 frente a paracancerous
Las correlaciones entre la expresión de GOLPH3 y la señalización de señalización proteínas relacionadas con la vía-
análisis de correlación
de Pearson reveló una fuerte correlación entre la expresión GOLPH3 y el de la vía de señalización (Tabla 6). Un análisis estadístico mostró que los producto momento de Pearson coeficientes de correlación fueron todos positivos en el grupo de cáncer gástrico. Curiosamente, la expresión GOLPH3 está fuertemente asociada con p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 (
r = 0,410
, 0,203 y 0,128, respectivamente,
p Hotel & lt; 0,05) la expresión y una correlación positiva entre GOLPH3 y p-Akt fue casi significativa (
p = 0,054
). Mientras tanto, se observaron fuertes correlaciones entre la expresión de p-4E-BP1 y las proteínas mencionadas anteriormente con la excepción de p-mTOR. expresión mTOR fosforilada también se correlacionó positivamente con la expresión de p-Akt (
r = 0,521
,
p = 0,027
). expresión fosforilada p70S6 también se correlaciona con la expresión de p-Akt (
r = 0,274
,
p Hotel & lt; 0,001) y p-mTOR (
r = 0,451
,
p
= 0,007).
Discusión
a pesar de que la incidencia de cáncer gástrico ha disminuido en los últimos años [2], sigue siendo una grave amenaza para la salud humana . La mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se diagnostican en estadios avanzados y tienden a presentar con la invasión tumoral y la metástasis. Durante la última década, no se han logrado grandes mejoras con respecto al diagnóstico precoz y el tratamiento del cáncer gástrico. La comprensión de la cáncer gástrico subyacente biología molecular todavía es deficiente. Desde 2009, GOLPH3 ha recibido considerable atención como un oncogén. Esta proteína se localiza en la cara citoplásmica de la trans-Golgi y ha sido estrechamente asociado con la tumorigenicidad [3], [8]. Grandes estudios han encontrado que la sobreexpresión GOLPH3 se produce en varios cánceres humanos, incluyendo el carcinoma epitelial de ovario, carcinoma de células renales, el glioblastoma multiforme, el carcinoma de células escamosas de esófago y cáncer de lengua oral, [12] - [16]. La evidencia sugiere que GOLPH3 está implicado en la tumorigénesis y se correlaciona con mal pronóstico. Por otra parte, un estudio informó que la sobreexpresión GOLPH3 se asocia con un mal resultado clínico en cáncer gástrico [17]. Sin embargo, los mecanismos precisos que subyacen a esta relación no están claros, y el mecanismo molecular exacto por el cual GOLPH3 está implicado en la tumorigénesis del cáncer gástrico, la invasión y la metástasis es poco conocido. Para investigar el mecanismo molecular por el cual potencial GOLPH3 está implicado en el cáncer gástrico, se utilizó primero inmunohistoquímica para localizar la expresión GOLPH3 en diferentes tejidos gástricos. Se encontró que GOLPH3 fue principalmente localizado en el citoplasma, y se expresó en el cáncer gástrico, para-carcinoma y los tejidos gástricos normales emparejados. Curiosamente, las tasas de expresión de alto GOLPH3 fueron 75.00% (60 de 80) en los tejidos de cáncer gástrico, 43.75% (35 de 80) en los tejidos de carcinoma-adyacente y el 12,50% (10 de 80) en los tejidos normales, respectivamente ( Tabla 5). Por otra parte, se observó GOLPH3 sobre-expresión en tejido de cáncer gástrico y fue altamente relacionada con la invasión del cáncer gástrico y metástasis. Nuestros resultados sugieren que la expresión de alto GOLPH3 se relacionó significativamente con el grado histológico (
p = 0,015
), la profundidad de la invasión (
p Hotel & lt; 0,001), metástasis de ganglios linfáticos (
p
& lt; 0,001), y metástasis a distancia (
p
= 0,006) en los tejidos de cáncer gástrico (Tabla 1). Además, se llevaron a cabo la transferencia Western y RT-PCR para evaluar la expresión GOLPH3 en la proteína y los niveles de ARNm. Curiosamente, los resultados fueron similares a los observados en el análisis de inmunohistoquímica. Los resultados anteriores indican que el aumento de expresión GOLPH3 está estrechamente asociado con la incidencia de cáncer gástrico, y GOLPH3 pueden estar implicados en la invasión del cáncer gástrico y metástasis.
Recientemente, un número creciente de las vías de transducción de señal se han notificado a participar en la invasión tumoral y la metástasis. mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR), que es una serina /treonina quinasa aguas abajo de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /vía de señalización Akt e incluye mTORC1 (mTOR /RAPTOR) y mTORC2 (mTOR /Rictor), regula la síntesis de proteínas, células proliferación, el metabolismo celular y la diferenciación [18], [19]. Activado secuencialmente mTORC1 activa directamente abajo objetivos, incluyendo p70S6 quinasa (S6K) y el factor de iniciación eucariótico 4E-proteína de unión 1 (4E-BP1), y mTORC2 se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en la fosforilación de Akt en Ser473, lo que resulta en la activación completa de Akt [20], [21]. Aunque Akt activa directamente mTOR /RAPTOR, puede también directa o indirectamente activar la p70S6 quinasa /4EBP1 vía esta ruta mediante la fosforilación del TSC2 supresor de tumor [22]. La vía /mTOR Akt se ha demostrado ser activado frecuentemente en diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama, carcinoma urotelial, cáncer de ovario, tumores neuroendocrinos pancreáticos, meduloblastoma humano, melanoma, cáncer de endometrio y carcinoma hepatocelular; Por lo tanto, esta vía representa una posible diana terapéutica en muchos tipos de cáncer [23] - [30]. En nuestro estudio, RT-PCR y Western Blot reveló que los niveles de mRNA y expresión de proteínas de p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 en el grupo de cáncer gástrico fueron significativamente mayores que en el para-carcinoma tejidos y los grupos de tejidos gástricos normales emparejados (Figura 2, Figura 3). Para determinar si los niveles de expresión de p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 se asociaron con características clinicopatológicas críticos, se realizó análisis adicionales. En este estudio, el 81,25% de los 80 pacientes con cáncer gástrico tenía una expresión de alto p-mTOR, 77,50% tenía una expresión de alto p-4E-BP, 76.25% tienen alta p-p70S6 expresión, y sólo 75,00% tienen una alta expresión de p-Akt (Tabla 5). Sorprendentemente, un análisis inmunohistoquímico reveló que los niveles de expresión de estas expresiones de proteínas se asociaron significativamente con la profundidad de la invasión, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia, y el grado histológico, pero no se asociaron con el género o la edad (Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3) . Estos resultados sugieren que la vía /mTOR Akt se activa en el cáncer gástrico y puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis del cáncer gástrico, la invasión y la metástasis.
Recientemente, Scott et al. reveló que GOLPH3 puede promover la transformación celular y el crecimiento del tumor mediante la activación constitutiva de la vía de señalización mTOR en células de melanoma y que GOLPH3 estimula la vía de señalización mTOR vía mTORC1 y complejos mTORC2, promoviendo así el crecimiento de células tumorales y la proliferación [8]. Sin embargo, no está claro si este fenómeno también se produce en los tejidos de cáncer gástrico. Para nuestro conocimiento, nuestro estudio es el primero en explorar la patogénesis de la tumorigénesis GOLPH3 promovido, invasión y metástasis de cáncer gástrico. Nuestros datos muestran una relación positiva significativa entre la expresión de GOLPH3 y p-mTOR, p-4E-BP1, y p-p70S6 (
r = 0,410
, 0,203 y 0,128, respectivamente,
p
& lt; 0,05). Sin embargo, la correlación entre la expresión de GOLPH3 y p-Akt no fue significativa (
r = 0,258
,
p Hotel & gt; 0,05) (Tabla 6). En particular, significativamente más alta expresión GOLPH3 fue acompañada por una alta expresión de p-mTOR, p-4E-BP1, y p-p70S6 en tejidos de cáncer gástrico, y esta relación se asoció significativamente con la profundidad de la invasión, el grado histológico, y los ganglios linfáticos y metástasis a distancia. Nuestros resultados revelaron varias relaciones entre GOLPH3 y señalización /mTOR proteínas Akt, y la asociación positiva entre GOLPH3 y p-Akt fue casi significativa. Las causas específicas de esta relación entre GOLPH3 y p-Akt no son claros y deben investigarse más a fondo. Los autores especulan que el tamaño de la muestra puede haber sido demasiado pequeño. Además, GOLPH3 puede activar principalmente la señalización /mTOR vía de Akt a través de la mTORC1 complejo activado en lugar de la compleja mTORC2, resultando en p70S6 y 4E-BP1 fosforilación, lo que afecta el cáncer gástrico. Estos resultados indican que GOLPH3 puede estar implicada en la tumorigénesis del cáncer gástrico, la invasión y la metástasis a través de la activación anormal de la ruta de señalización de Akt /mTOR.
En conclusión, este estudio detecta los altos niveles de expresión de GOLPH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 y p-p70S6 en el grupo de cáncer gástrico fuertemente correlacionados con la que el grado histológico, profundidad de la invasión, metástasis a distancia, y el compromiso de los ganglios linfáticos mediante análisis de las variables clínico-patológica e inmunohistoquímica. Además, la expresión de GOPLH3 está altamente correlacionada con la activación de la vía de señalización de Akt /mTOR en muestras de cáncer gástrico humano. Basándose en estos resultados, se especula que GOLPH3 podría verse afectada la progresión y la metástasis de cáncer gástrico a través de la activación de la vía de señalización de Akt /mTOR. Por otra parte, se propone que la inhibición de la expresión de genes en la vía de señalización GOLPH3 y mTOR puede representar una nueva diana para la terapia del cáncer gástrico. Por último, los mecanismos de invasión y migración de GOLPH3 en el cáncer gástrico todavía necesitan más investigaciones.