Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CCR) multiplicidad ha sido principalmente relacionados con poliposis y no asociado a poliposis síndromes hereditarios. En CCR esporádico, la metilación aberrante promotor del gen se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la carcinogénesis, aunque se sabe poco acerca de su participación en la multiplicidad. Para evaluar el efecto de la metilación en el número de tumores de CCR esporádico, se evaluó la hipermetilación de los genes supresores de tumores clave en pacientes con ambos solitarios y múltiples tumores, como una prueba de concepto de un defecto subyacente epigenética.
Metodología /Principales conclusiones
Se examinaron un total de 47 síncrono /metacrónico CRC primaria a partir de 41 pacientes, y 41 el género, la edad (intervalos de 5 años) y pacientes ubicación apareadas tumorales con tumores solitarios. Los criterios de exclusión fueron síndromes de poliposis, síndrome de Lynch y la enfermedad inflamatoria intestinal. La metilación del ADN en la región promotora del
MGMT
,
CDKN2A
, S
FRP1
,
TMEFF2
,
HS3ST2 (3OST2)
,
RASSF1A
y
GATA4
genes se evaluó mediante PCR específica de metilación cuantitativa, tanto en el tumor y la correspondiente aparecen muestras de mucosa colorrectal normales. En general, los pacientes con múltiples lesiones exhiben un mayor grado de metilación en muestras de tumores que aquellos con tumores solitarios relación con todos los genes evaluados. Después de ajustar por edad y sexo, binomial de regresión logística análisis de metilación identificada de
MGMT2 gratis (OR, 1,48; IC del 95%, 1,10 a la 1,97; p = 0,008) y
RASSF1A gratis (OR, 2,04 ; IC del 95%, 1,01 a 4,13; p = 0,047) como variables asociadas de forma independiente con el número de tumores, siendo el riesgo relacionado con la metilación de cualquiera de estos dos genes de 4,57 (IC del 95%, 1,53 a 13.61; p = 0,006). Por otra parte, en seis pacientes en los que tanto los tumores estaban disponibles, encontramos una correlación en los niveles de metilación de
MGMT2 gratis (r = 0,64, p = 0,17),
SFRP1 gratis (r = 0,83; 0,06),
HPP1 gratis (r = 0,64, p = 0,17),
3OST2 gratis (r = 0,83, p = 0,06) y
GATA4 gratis (r = 0,6, p = 0,24). La metilación en el aspecto normal de la mucosa colorrectal de pacientes con múltiples y solitario CRC mostró ninguna diferencia relevante en cualquier gen evaluado.
Conclusiones
Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que la metilación del promotor del gen se asocia con el número de tumores. Este defecto subyacente epigenética puede tener consecuencias notables en la prevención de los pacientes con CCR esporádico
Visto:. Gonzalo V, Lozano JJ, Muñoz J, F Balaguer, Pellisé M, de Miguel CR, et al. (2010) aberrante promotor del gen metilación asociados con el cáncer colorrectal esporádico múltiple. PLoS ONE 5 (1): e8777. doi: 10.1371 /journal.pone.0008777
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Septiembre, 2009; Aceptado: December 23, 2009; Publicado: 19 Enero 2010
Derechos de Autor © 2010 Gonzalo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Innovación (SAF 07-64873) Ministerio de Ciencia e, Fondo de Investigación Sanitaria (PI061384 y PI080024), Asociación Española Contra el Cáncer (Fundación Científica y Junta de Barcelona), la Fundación Investigación Médica Mutua Madrileña (PI040296) , la Fundación Olga Torres (PI040212), y Acción cáncer en (Instituto de Salud Carlos III). Victoria Gonzalo fue apoyado por una beca del Hospital Clínico, Cristina Rodríguez por una beca de Olympus Medical Systems-Europa, Mireya Jimeno por una subvención del Instituto de Salud Carlos III (PI016017), Francesc Balaguer por una beca de la Fundación Alfonso Martín Escudero y Sergi Castellví-Bel por un contrato del Fondo de Investigación Sanitaria (CP 03 a 0070). Centro de Investigación Biomédica en Red en el Área temática de Enfermedades hepáticas y Digestivas (CIBERehd) está financiado por el Instituto de Salud Carlos III. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Cristina Rodríguez fue una enfermera de la investigación financiada por una beca de Olympus Medical Systems-Europa. El proveedor de fondos, sin embargo, no participó en el diseño del estudio; recolección, análisis e interpretación de datos; la escritura del documento; ni la decisión de presentar para su publicación.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es un problema de salud pública relevante, ya que representa el segundo tumor maligno más común y también la segunda causa de muerte por cáncer en Países occidentales. La herencia constituye la causa subyacente en hasta un tercio de todos los casos de CCR, con trastornos hereditarios muy penetrantes y bien definidos, es decir, la poliposis adenomatosa y hamartomatoso y el síndrome de Lynch, que representa el 3-5% de la carga total de CRC [1]. En tales condiciones, la presencia de una mutación germinal en el gen causal (es decir,
APC
,
MYH
,
LKB1
,
SMAD4
,
BMPR1A
,
PTEN
,
MLH1
,
MSH2
,
MSH6
y
PMS2
) [1], [ ,,,0],2], predispone a estas personas para el desarrollo de múltiples neoplasias colorrectales. De hecho, mientras que la poliposis adenomatosa familiar representa el paradigma de la multiplicidad tumoral, la presencia de cualquiera de sincrónicas y metacrónicas CRC es también uno de los criterios clínicos más comunes para sospechar el síndrome de Lynch [3].
Además de las condiciones heredadas anteriormente mencionados , el número de tumores es también una observación frecuente en pacientes con CRC que no están aparentemente predispuestos a estas neoplasias sobre la base de sus antecedentes genéticos. De hecho, se informa adenomas colorrectales sincrónicos y metacrónicos en hasta el 30% y el 48% de los pacientes con CCR esporádico, respectivamente, mientras que las cifras correspondientes para carcinoma son 4% y 9%, respectivamente [4], [5]. En esta configuración, la agregación evidente cáncer familiar o características personales distintivas no son abiertamente distinguida, y aunque un trastorno celular o molecular generalizada en toda la mucosa colorrectal se puede sospechar, el mecanismo patogénico subyacente sigue siendo difícil de alcanzar.
Un efecto de campo carcinogénesis colorrectal subyacente es una situación bien reconocido en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, una condición premaligna con un mayor riesgo acumulativo de desarrollar CCR asociado con la edad temprana de aparición, duración de la enfermedad, y el alcance y la gravedad de la inflamación [6], [7]. El mecanismo exacto por el que la inflamación de la mucosa colónica crónica causa malignidad en este contexto se entiende bien, a pesar de que se supone que está relacionada con un fallo en los mecanismos de regulación durante la división celular. La inflamación crónica conduce a la liberación de radicales libres a partir de los leucocitos y los macrófagos, y estas especies reactivas de oxígeno puede conducir a la carcinogénesis, causando daños en el ADN [8]. Dado que en la mayoría de los casos el daño del ADN conduce a la inactivación de genes supresores de tumor, el concepto de "efecto de campo" podría ser mejor designa como "defecto del campo". supuesta implicación de tales fallos en campo CRC esporádica, sin embargo, no se ha establecido hasta ahora satisfactoriamente.
esporádica CRC surge como consecuencia de la acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas que transforman las células epiteliales del colon en células de adenocarcinoma de colon [9]. La pérdida de la estabilidad genómica y resultantes alteraciones genéticas son pasos patógenos moleculares clave que ocurren temprano en la tumorigénesis: que permiten la adquisición de un número suficiente de alteraciones en genes supresores de tumores y oncogenes que transforman las células y promover la progresión tumoral. Análoga a la inestabilidad genómica, los resultados de la inestabilidad epigenéticos en la metilación aberrante de genes supresores de tumores [9]. De hecho, tumor epigenéticos silenciamiento de genes supresores comúnmente ha estado involucrado en todos los tipos de tumores humanos, incluyendo CRC [10]. Citosina metilación aberrante juega un papel preeminente en la transformación celular cuando afecta a los genes que protegen la inestabilidad del genoma. Este cambio epigenético también se puede detectar en las lesiones precancerosas y tejidos peritumoral aparentemente normales [11], [12], [13], [14], [15], lo que sugiere su posible participación en el proceso de carcinogénesis inicial. Este defecto del campo putativo asociada con el promotor del gen hipermetilación en la mucosa colorrectal apariencia normal se ha sugerido con respecto a la
MGMT
de genes [12], así como
ER
,
MYOD
,
P16 (INK4A)
,
MLH1
,
TIMP3
y
DAPK
[13].
Teniendo en cuenta que la hipermetilación de regiones promotoras de los genes supresores de tumores podrían ser observados en apariencia normal mucosa colorrectal, la hipótesis de que este fenómeno sería especialmente relevante en los pacientes que desarrollaron múltiples CRC. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar los patrones de metilación de genes implicados en la carcinogénesis colorrectal a través de este mecanismo, tanto en el tejido tumoral y normal que aparecen muestras de mucosa de colon de pacientes con múltiples y solitario CRC, como una prueba de concepto de un subyacente putativa epigenética defecto asociado con el número de tumores.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Se examinó un total de 47 síncrono /metacrónico CRC primaria a partir de 41 pacientes (36 síncrono, 4 y metacrónico pacientes un tanto) y el 41 por sexo, edad (intervalos de 5 años) y la localización del tumor-emparejado con tumores solitarios. Control de los pacientes con tumores solitarios fueron reclutados en el proyecto EPICOLON, un estudio prospectivo, multicéntrico, de cohorte basado en la población en todo el país (n = 1,222) [16] y aleatoriamente seleccionados entre aquellos que no tienen CRC anterior y con un seguimiento mínimo de 5 años después del diagnóstico de cáncer en el que la vigilancia regular de la colonoscopia no identificó ninguna lesión adicional. En cuanto a los pacientes con múltiples CRC, 31 también fueron reclutados en el proyecto EPICOLON y 10 pacientes adicionales en la Unidad de Endoscopia del Hospital Clínic de Barcelona entre junio de 2007 y mayo de 2008. No hubo diferencias con respecto a las características clínico-patológicas de los dos grupos de pacientes con múltiples lesiones (datos no mostrados). Los criterios de exclusión para este estudio eran síndromes de poliposis de colon, síndrome de Lynch y antecedentes personales de enfermedad inflamatoria intestinal. Las características demográficas, clínicas y relacionadas con el tumor de los pacientes incluidos en el estudio se resumen en la Tabla 1. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de cada hospital participante, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes. Los miembros del proyecto EPICOLON se enumeran en la Nota S1.
congeladas de tumores y la correspondiente de apariencia normal, peritumoral tejidos de la mucosa colorrectal se obtuvieron ya sea en la cirugía o endoscopia de todos los pacientes, y se almacena a -80 ° inmediatamente C hasta su uso. En pacientes con múltiples lesiones, muestra de tejido se obtuvo a partir de al menos un tumor (el más avanzado uno o el más grande cuando múltiples tumores tenían el mismo estadio del tumor).
aislamiento del ADN y tratamiento con bisulfito
las muestras congeladas se descongelaron y se aisló el ADN genómico utilizando el QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. tratamiento con bisulfito se llevó a cabo en el ADN genómico utilizando el EZ metilación del ADN-Gold Kit® (Zymo Research, Orange, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante con pequeñas modificaciones que se detallan a continuación [17]. Este procedimiento integrado la desnaturalización del ADN y la conversión de bisulfito en una sola etapa, utilizando desnaturalización temperatura para reemplazar la desnaturalización química con hidróxido de sodio, y se basa en un proceso de reacción de tres etapas entre la citosina y bisulfito sódico que convierte citosinas no metiladas en uracilos. Se utilizó una cantidad de 250 ng de ADN genómico aislado de cada muestra de tumor o tejido normal por reacción, y se empleó un volumen de 15 l para cada ADN bisulfited a eluirse. El ADN resultante se utilizó para la amplificación por PCR o se almacenaron a -80 ° C.
Quantitative PCR específica de metilación
Después de la conversión de bisulfito, los duplicados de 0,5 l de cada ADN bisulfited fueron amplificados por la técnica de MethyLight , una basada en fluorescencia anteriormente descrito cuantitativa en tiempo real PCR, altamente específico, sensible y reproducible de ensayo [18]. Locus cebadores específicos de PCR y sondas para los genes supresores tumorales siete -
MGMT1 gratis (promotor mínimo),
MGMT2 gratis (potenciador de la región),
CDKN2A
,
SFRP1
,
TMEFF2
,
HS3ST2 (3OST2)
,
RASSF1A
y
GATA4 CD - fueron diseñados específicamente para las secuencias de ADN convertido bisulfited y situados en cada gen de la región promotora. Estos genes fueron elegidos por su participación en la carcinogénesis colorrectal a través de silenciamiento y la evidencia de algún grado de hipermetilación metilación impulsada en contrapartida mucosa de apariencia normal, peritumoral colorrectal (Tabla 2). En ese sentido, es importante destacar que se evitaron los genes propuestos como marcadores del fenotipo isla CpG methylator que, por definición, son casi exclusivamente metilado en el tejido canceroso. Imprimación y sondas utilizadas para las secuencias de ADN bisulfited se enumeran en la Tabla S1. Totalmente no metilado y totalmente
DNA metilado-l Sss
fueron empleados inicialmente como 0 y 100% referencias metilados para probar los resultados de amplificación, y el ADN metilado se utilizó además como calibrador para todas las muestras analizadas.
ALUC4
gen se utilizó como referencia endógeno para normalizar la cantidad de ADN de entrada [19]. Las reacciones MethyLight se realizaron en un Sistema 7300 PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA) con un volumen final de 12,5 l que contenía 900 nM de cada cebador y 250 nM de la sonda correspondiente. Las condiciones de PCR fueron: 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 92 ° C durante 15 segundos y 58 ° C durante 1 minuto, como se describió anteriormente [18]
Cada. medición en una muestra dada se realizó por duplicado para ambos genes probados y endógenos, y el ciclo umbral (C
t), el número fraccionario en el que la cantidad de diana amplificada alcanzó un fijo de umbrales se determinó. La desviación estándar en los duplicados de la muestra fue siempre por debajo de 0,2. Las cantidades relativas de los dos genes también se normalizaron a ADN metilado comercial 100% (Zymo Research, Orange, CA) que actúa como calibrador para permitir la comparación a través de todas las muestras analizadas. La comparativa C
T método [20], también conocido como el método 2
-ΔΔCt, se calculó fromwhere
? C
t, la muestra se probó genes C
valor t para cualquier muestra normalizado a
ALUC4
, y
? C
t, fue el calibrador genes C
valor t pruebas para determinar si el calibrador también se normalizaron a
ALUC4
. El resultado derivado de la
ΔΔC
t × 100 corresponde al porcentaje de referencia metilado (PMR), que indica el porcentaje de moléculas completamente metilados en un locus específico [21].
Los investigadores llevar a cabo la experimentos en tiempo real PCR específicas de metilación fueron cegados a las características clínicas de los pacientes (es decir, el número de tumores).
Evaluación del tumor no coincidente deficiencia
deficiencia de reparación desajuste del tumor fue evaluada tanto por inmunotinción y de microsatélites pruebas de inestabilidad. El análisis inmunohistoquímico incluyó la evaluación de MSH2 (anti-MSH2, Research Products Oncogene, Boston, MA), MLH1 (anti-MLH1, PharMingen, San Diego, CA) y MSH6 (anti-MSH6, BD Transducción Laboratories, San José, CA), como se describe en otra parte [16]. Las células tumorales se consideraron negativos para la expresión de proteínas sólo si carecían de tinción en una muestra en la que se tiñeron colonocitos normales y las células del estroma. Si no inmunotinción de tejido normal se pudo demostrar, los resultados se consideran fiables. La inestabilidad de microsatélites se evaluó mediante el panel 5-marcador propuesto por el Instituto Nacional del Cáncer y /o la Pentaplex de repeticiones de mononucleótidos, tal como se describe en otro lugar [22].
Análisis estadístico
La comparación del grado de metilación entre los múltiples y solitarias pacientes con CCR, donde se llevó a cabo cualitativamente positividad metilación se estableció como PMR ≥4, como validado previamente [23]. Dado que la información relativa a la metilación en la mucosa colorrectal normal se limita a aparecer, el análisis en este ajuste se realizó de acuerdo a la vez un ≥4 PMR de corte y un adicional, elegido arbitrariamente ≥1 PMR corte de con el fin de determinar cualquier posible efecto menor. El análisis se realizó mediante la prueba exacta de Fisher. Correlación entre los niveles de metilación de pares de tumor se analizó mediante análisis de correlación de Spearman.
Comparación entre los pacientes con múltiples tumores solitarios y en cuanto al grado de metilación tanto en el tumor y normales que aparecen muestras de mucosa colorrectal También se realizó mediante regresión logística binomial, ambos ajustados y ajustados por edad y sexo. Por otra parte, hemos probado el efecto independiente de la metilación de genes en el número de tumores mediante la inclusión de todos los genes evaluados en el modelo de regresión logística binomial, junto con la edad y el género. Estas variables fueron "podados" por medio de un procedimiento paso a paso automatizado para optimizar la información de Akaike criterio [24]. interacciones multiplicativas fueron probados para cada par de genes asociados de forma independiente con el número de tumores mediante la inclusión de los dos efectos principales y un término de interacción (un producto de dos efectos principales) en el modelo de regresión logística. Por último, hemos probado los efectos acumulativos de los genes metilados en el número de tumores mediante el recuento del número de genes seleccionados independientemente asociados con este fenómeno en cada materia. El odds ratio para el número de tumores de pacientes portadores de cualquier combinación de los genes metilados seleccionados se estimó por comparación con los pacientes que llevan ninguno de estos genes con el uso de análisis de regresión logística. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando (R Development Core Team, http://www.R-project.org) "R".
Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar. Todos los valores de p fueron de dos caras. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado para indicar una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
Cuarenta y un pacientes con síncrono o metacrónico CRC, y 41 géneros, emparejado en la localización del tumor y la edad pacientes con tumores solitarios constituyen la base de este estudio. Como se muestra en la Tabla 1, los dos grupos de pacientes fueron similares con respecto a cualesquiera características demográficas, clínicas y relacionadas con el tumor, excepto por la presencia de adenomas colorrectales sincrónicos.
Gene promotor de la metilación en muestras de tumores
Comparación de promotor del gen de metilación en muestras de tumores de pacientes con múltiples y solitario CRC se representa en la Tabla 3. en general, los pacientes con múltiples lesiones exhiben un mayor grado de metilación en muestras de tumores que aquellos con tumores solitarios relación con todos los genes evaluados. La proporción de tumores que exhiben gen promotor hipermetilación fue significativamente mayor en los pacientes con lesiones múltiples que en aquellos con CRC de aislamiento con respecto a los
MGMT2 gratis (40,4%
vs
14,6%, respectivamente;. P = . 0.009) y
RASSF1A gratis (17,0%
vs
0%, respectivamente; p = 0,006) (tabla 3) guía empresas
Estimación del riesgo de tumor. multiplicidad asociada con el promotor de la metilación de genes en muestras de tumores se muestra en la Tabla 4. Después de ajustar por edad y sexo, análisis de regresión logística binomial indica que la metilación de las regiones promotoras de la
MGMT1
locus (odds ratio (OR), 1,57 ; 95% intervalo de confianza (IC), 1,01 a la 2.43; p = 0,04),
MGMT2
locus (OR, 1,50; IC del 95%, 1,14 a la 1,96; p = 0,003), y
RASSF1A
gen (OR, 2,02; IC del 95%, 1,03 a la 3,93; p = 0,03) se asociaron con un mayor riesgo de desarrollar múltiples CRC (Tabla 4)
El análisis de regresión logística multivariante ajustado. metilación identificados de la
MGMT2
locus (OR, 1,48; 95% CI, 1,10 a la 1,97; p = 0,008) y
RASSF1A
gen (OR, 2,04; IC del 95%, 1.1 a 4.13; p = 0,047) como variables asociadas de forma independiente con el número de tumores. Además, cuando el producto de estas dos variables se añadió al modelo de regresión, no se ha seleccionado esta interacción plazo (OR, 0,88; IC del 95%, 0,67 a 1.16; p = 0,37). Por último, cuando se evaluó los efectos acumulativos de los genes metilados, el riesgo de que el número de tumores asociado con la metilación de cualquiera de estos dos genes seleccionados fue de 4,57 (IC del 95%, 1,53 a la 13.61; p = 0,006), sin un aumento significativo cuando ambos genes fueron metilados de forma simultánea (OR, 2,31; IC del 95%, 0,00 a indeterminada; p = 0,99).
Finalmente, se analizó la correlación de los niveles de metilación en el subconjunto de seis pacientes con tumores múltiples en los que se encontraban los dos tumores disponibles para el análisis (Figura 1). Este análisis mostró una correlación no significativa en los niveles de metilación de
MGMT2 gratis (r = 64, p = 0,17),
SFRP1 gratis (r = 0,83, 0,06),
HPP1
(r = 0,64, p = 0,17),
3OST2
(r = 0,83, p = 0,06), y
GATA4
(r = 0,6, p = 0,24).
MGMT1
y
CDKN2A
no mostró evidencia de concordancia entre los tumores en el mismo paciente (r = -0,05; p = 0,91; r = -0,09, p = 0,91, respectivamente), y
RASSF1A
rara vez se metilado en estos tumores, lo que impidió un análisis de correlación adecuada.
Los resultados se expresan como porcentaje de la metilación sobre la base de PMR.
la metilación promotor del gen La metilación de aspecto normal en muestras de colon a mucosas,
en la mucosa colorrectal apariencia normal de pacientes con múltiples y solitario CRC mostró ninguna diferencia relevante en cualquier gen evaluados (Tabla 5). Con el fin de determinar cualquier potencial efecto menor, el análisis se repitió utilizando una línea de corte ≥1 PMR (Tabla 5). En este segundo análisis, se observó ningún patrón de metilación consistente, con algunos genes que muestran hipermetilación (es decir,
MGMT1
,
MGMT2
y
RASSF1A
) y otros hipometilación (es decir,
SFRP1
,
TMEFF2
y
GATA4
) en pacientes con múltiples lesiones. Ninguna de estas diferencias fue estadísticamente significativa (Tabla 5).
Discusión
Los resultados de este estudio demuestran que los tumores de pacientes con sincrónica y metacrónico exhibición CRC un mayor grado de metilación que las de los pacientes con lesiones solitarias. Tumor hipermetilación del
MGMT
gen de la región potenciador y el
RASSF1A
región promotora del gen se identificaron como variables asociadas de forma independiente con un máximo de cinco veces más riesgo de desarrollar lesiones múltiples. Por otra parte, hemos encontrado patrones de metilación similares en pares de tumor del mismo paciente. En general, estas observaciones proporcionan una prueba de concepto de un defecto epigenética mediada por el gen promotor de la hipermetilación que favorecen número de tumores de CCR esporádico.
Los puntos fuertes de este estudio se basan en el hecho de que se llevó a cabo en un general población a través de un estudio multicéntrico prospectivo en todo el país, en el que se incluyeron pacientes no seleccionados y consecutivos con CCR, independientemente de sus características personales y familiares; Caracterización genética previa realizada en el marco del proyecto EPICOLON permitió una adecuada identificación y posterior exclusión de los pacientes con trastornos hereditarios (es decir, la poliposis colorrectal, el síndrome de Lynch y CRC MYH-asociado) [16], [22], [25], [26 ], [27], [28], en el que un mecanismo molecular bien definido específica y justifica el número de tumores; que representa la mayor serie de pacientes con múltiples lesiones evaluadas hasta el momento para la metilación del tumor, así como el primer estudio en el que un grupo control de pacientes con una lesión solitaria se incluyó con la estratificación adecuada para el género, la edad y la localización del tumor; y, por último, la metilación específica de PCR cuantitativa se llevó a cabo tanto en la muestra tumoral y emparejado de aspecto normal de la mucosa colorrectal, y se analizaron los datos de una manera ciega.
Somos conscientes, sin embargo, algunas de las limitaciones de este estudio. En primer lugar, las muestras de ARN no estaban disponibles para realizar los análisis de expresión paralela y verificar la importancia biológica de la metilación del promotor del gen. Sin embargo, hay una gran cantidad de pruebas que MethyLight ensayos proporcionan una excelente correlación entre la metilación del promotor y el silenciamiento de genes en entornos de tumores similares [11], [29]. Existe más incertidumbre, sin embargo, con respecto al valor de estos resultados en los tejidos no neoplásicos. Aunque se ha sugerido que la firma epigenética del cáncer puede tener principio de su carrera, homólogos de los tejidos normales potencialmente implicados en la iniciación del proceso de carcinogénesis [14], todavía no está claro si el mismo corte de metilación usado para muestras de tumores ( es decir, PMR ≥4) se puede emplear en los tejidos no neoplásicos. Con el fin de superar esta limitación, los resultados obtenidos en la mucosa colorrectal apariencia normal se analizaron usando dos diferentes niveles de corte. En segundo lugar, este estudio representa un candidato-gen, investigación hipótesis-impulsado en el que se elige un número reducido de genes sobre la base de la información anterior que demuestra su participación en la carcinogénesis colorrectal a través de silenciamiento de genes metilación mediada, y la evidencia de un grado decreciente de hipermetilación entre tumor, peritumoral apariencia normal mucosa colorrectal y mucosa colorrectal normal a partir de individuos no tumorales. El propósito principal de este enfoque era proporcionar una prueba de concepto de la posible participación de la hipermetilación del promotor del gen en el número de tumores en lugar de identificar la firma epigenética que subyace en este proceso. Para alcanzar este último objetivo, se requieren técnicas de alto rendimiento con gran capacidad de genoma, un enfoque actualmente en curso en nuestro laboratorio. En tercer lugar, la evaluación de mucosa colorrectal de apariencia normal se limita a la zona peritumoral en la gran mayoría de los casos, ya que la mayoría de las muestras se obtuvieron a partir de muestras quirúrgicas. Este aspecto se opone a la generalización de los resultados obtenidos en mucosa aparentemente normal a todo el colon. De hecho, golpeando dos puntos específicos del segmento diferencias en la prevalencia de la metilación de algunos genes (es decir,
MLH1
y
MGMT
) se han observado [14]. ¿Cómo este patrón de dispersión afectaría el uso potencial de análisis de metilación en la evaluación del riesgo de CCR y, en consecuencia, las estrategias de cribado y vigilancia de metilación impulsada putativos, se está evaluando actualmente.
Un defecto del campo mediada por
MGMT
promotor del gen de metilación se ha sugerido anteriormente [12]. En ese estudio seminal, la hipermetilación del se encontró
MGMT
gen se observó en el 46% de los tumores, así como en el 50% de lo normal que aparecen muestras de mucosa colorrectal de pacientes en los que
MGMT
metilación del promotor en el tumor correspondiente. En otro estudio, la participación de la metilación del ADN en cinco promotores de genes CIMP-específicos, incluyendo
MGMT
, también se evaluó en seis pares de carcinoma síncronos [30]. En este estudio, se observó que mientras que algunos pares tumorales mostraron patrones de metilación discordantes, otros mostraron similares, pero no exactamente idéntica, perfiles de metilación del promotor, lo que sugiere que las alteraciones epigenéticas en CRC síncrono probablemente tienen ambos componentes aleatorios y no aleatorios [30]. . Recientemente, Konishi
y col Hola, ha encontrado diferencias significativas en la metilación entre múltiples tumores en comparación con las lesiones solitarias para
MGMT gratis (. 26,5%
vs
17,3%; p & lt; 0,05) y
p14 gratis (16,1%
vs
9,3%;. p & lt; 0,05) [31]. Curiosamente, estos autores encontraron una correlación significativa para la metilación de genes diferentes, incluyendo
MGMT
, entre pares tumorales del mismo sitio (proximal
vs.
Distal). Desafortunadamente, este tema interesante sólo podía ser dirigida parcialmente en nuestra investigación, ya que, debido al diseño del proyecto EPICOLON, sólo una muestra de tumor se recogió de la mayoría de los pacientes con CRC síncrona, lo que limita esta comparación por pares a 6 pacientes. Aunque las correlaciones positivas para
MGMT2
no alcanzó significación estadística (probablemente debido al bajo número de tumores emparejados disponible), nuestros resultados son consistentes con los datos obtenidos por Konishi
et al.
[31 ], apoya la hipótesis de que los pacientes con múltiples tumores muestran metilación concordantes en sus tejidos tumorales. Muy recientemente, en una publicación seminal, LINE-1 los niveles de metilación se correlacionaron significativamente en 10 pares de CRC sincrónicos, lo que refuerza la hipótesis de un efecto de campo [32].
La metilación asociada a la inactivación de
RASSF1A
se ha observado con frecuencia en varios tumores malignos humanos incluyendo CCR esporádico [33], [34], [35], [36], [37]. De hecho, la hipermetilación promotor de tumores de
RASSF1A
se produce en aproximadamente el 20% de CRC, y parece existir una relación mutuamente exclusiva con la presencia de
KRAS
mutaciones [34], [35]. Curiosamente, en los tumores con deficiencia de reparación de genes, no se observaron diferencias significativas en la frecuencia de
RASSF1A metilación entre
inestable CRC esporádica y tumores asociados con el síndrome de Lynch [37]. Los resultados mencionados anteriormente [32], junto con la demostración de
RASSF1A
metilación en muestras de tumores de pacientes con lesiones múltiples, y la falta de diferencias en otros factores que predisponen a la multiplicidad tumor (es decir, antecedentes familiares) favorecen la hipótesis de un defecto subyacente epigenética. Sin embargo, si este mecanismo de silenciamiento génico metilación impulsada representa un efecto de campo potencial debido a una alteración molecular no identificado en mucosa normal o la expresión de múltiples pólipos hiperplásicos de la que CRC surge a través de la vía serrada [38] pre-existente, como lo ha sido sugirió recientemente [32], sigue siendo desconocido
.
Como se mencionó, la metilación aberrante de algunas islas CpG se ha visto en la mucosa colorrectal apariencia normal. En un estudio [13], este fenómeno se demostró por
ER
y
MYOD
genes, así como para el
P16 (INK4A)
,
MLH1
,
TIMP3
y
DAPK
genes en un nivel más bajo. Curiosamente, algunos polimorfismos de genes se asociaron con una metilación inferior de las islas CpG examinados, lo que sugiere que los factores genéticos pueden influir en esta alteración epigenética en la mucosa colorrectal normal [13]. Las condiciones fisiológicas asociadas con la metilación aberrante promotor en la mucosa colorrectal aparentemente normales también se han evaluado recientemente con respecto a los dos genes de reparación del ADN,
MLH1
y
MGMT
[14]. En ese estudio, las muestras de machos mostraron ningún patrón consistente, ya sea para el promotor, pero la prevalencia de
MLH1
y
MGMT metilación
aumentó significativamente con la edad, sobre todo en el colon derecho, y fueron consistentes con perfiles epigenéticos actuales de subconjuntos de CRC.