Extracto
Antecedentes
Los microARN (miRNA) han surgido como importantes reguladores de genes y son reconocidos como actores clave en la tumorigénesis. miR-145 se informó a ser baja regulado en varios tipos de cáncer, pero el conocimiento de sus objetivos en el cáncer de colon sigue siendo limitada.
Metodología /Principales conclusiones
Para investigar el papel de miR-145 en cáncer de colon, hemos empleado un enfoque basado en microarrays para identificar el miR-145 objetivos. Basado en el enriquecimiento sitio de semilla de análisis y análisis imparcial palabra, encontramos un enriquecimiento significativo de sitios de unión miARN en las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de las transcripciones de las reguladas en la sobreexpresión de los genes miARN. Ontología de genes análisis mostró una sobrerrepresentación de genes implicados en la muerte celular, el crecimiento celular y la proliferación, ciclo celular, la expresión génica y el cáncer. Varios de los genes miARN objetivos identificados anteriormente se han implicado en el cáncer, incluyendo
SÍ
,
FSCN1
,
ADAM17
,
BIRC2
,
VANGL1
, así como el factor de transcripción
STAT1
. Tanto
SI
y
STAT1
fueron verificados como directos miR-145 objetivos.
Conclusiones /Importancia
El estudio identifica y valida nuevo cáncer-relevante directa objetivos de miR-145 en células de cáncer de colon y por este medio se suma importante comprender el mecanismo de las funciones de tumor supresor de miR-145
Visto:. Gregersen LH, Jacobsen AB, Frankel LB, Wen J, Krogh A, Lund AH (2010) microARN-145 Objetivos
SI
y
STAT1
en células de cáncer de colon. PLoS ONE 5 (1): e8836. doi: 10.1371 /journal.pone.0008836
Editor: Grzegorz Kudla, Universidad de Edimburgo, Reino Unido
Recibido: 28 Octubre, 2009; Aceptado: 31 de diciembre de 2009; Publicado: 21 Enero 2010
Derechos de Autor © 2010 Gregersen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo en los autores de laboratorio es apoyado por la Comisión Europea (CE) financiación del 7PM (oncomiRs acuerdo de subvención número 201102. Esta publicación refleja sólo los puntos de vista de los autores. la Comisión no es responsable del uso que pueda hacerse de la información aquí), el Novo Nordisk Foundation, la Fundación Lundbeck, la Fundación Nacional danesa de Investigación, el Consejo danés de Investigación médica, la Sociedad danesa del cáncer y la Fundación Nacional de Tecnología avanzada de Dinamarca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los últimos años los pequeños RNAs no codificantes han sido reconocidos como importantes reguladores de genes [1] - [4]. miRNAs son un grupo abundante de endógenas pequeños RNAs no codificantes que funcionan como reguladores de los genes que codifican la proteína a través de la represión de traducción y /o degradación de sus ARNm diana [1]. Una amplia investigación ha revelado que los genes miARN miRNAs están involucrados en la regulación de numerosas funciones celulares clave tales como el metabolismo, la proliferación celular, la tumorigénesis, la apoptosis, el desarrollo y la diferenciación [1], [3], [4]. Para regular el ARNm diana maduro miRNAs se une a las proteínas AGO y guiar el ARN-AGO asociado inducida por silenciar complejo (RISC) para objetivos de mRNA a través de apareamiento de bases imperfecta entre el miARN y el objetivo. Esto a menudo implica pelar base perfecta entre el extremo 5 'de la hebra de miARN y su objetivo, también denominado el sitio de siembra. Bioinformática análisis sugieren que cada uno de los genes miARN pueden controlar cientos de genes diana en seres humanos y recientemente se ha informado de que más del 60% de proteínas de codificación de genes están bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con miRNAs, lo que indica que miRNAs tienen el potencial de regular la mayoría de las proteínas que codifican los genes [5].
expresión inapropiada de miRNAs, que regulan los genes que funcionan ya sea como supresores de tumores u oncogenes en última instancia, puede conducir a la adquisición de las características del cáncer, especificando tanto miRNAs ya que ambos supresores de tumores y oncogenes [ ,,,0],3], [6], [7]. Los cambios específicos en los niveles de expresión de los genes miARN se han asociado con varios tipos de cáncer [8] y un gran número de miRNAs están localizadas en las denominadas regiones genómicas asociadas con el cáncer, que con frecuencia están expuestos a los cambios en las células del cáncer [9]. Sin embargo, en contraste con el gran número de miRNAs que ha sido identificado en los últimos años, sólo relativamente pocos genes miARN objetivos han sido validada experimentalmente. Dada la abrumadora evidencia de que miRNAs son importantes reguladores de la tumorigénesis [3], [6], la identificación de los genes miARN objetivos es necesario con el fin de comprender la base mecánica de la participación de miRNAs en el cáncer.
miR-145 tiene con frecuencia ha informado que las reguladas en los cánceres, incluyendo el cáncer de próstata [10], [11], cáncer de vejiga [12], el cáncer de colon [13] - [18], el cáncer de ovario [19], [20], así como B tumores malignos de Célula [21], [22], y se ha informado de que la región genómica de codificación de miR-145 se encuentra en un sitio frágil menudo suprimido en el cáncer [23]. En consecuencia, miR-145 sobreexpresión se ha demostrado que tienen un efecto inhibidor del crecimiento [16], [17], [24], [25] y para suprimir el crecimiento de anclaje independiente [16]. Además, se ha demostrado que la expresión de miR-145 es inducida por p53 [16]. A continuación, se informó de que el miR-145 objetivos de c-Myc a través de apareamiento de bases de semilla imperfecta [16] y se ha sugerido que la regulación a la baja de p53 mediada por c-Myc es, al menos parcialmente, por la regulación al alza mediada por p53 de miR-145 . Otro estudio también encontró un aumento del nivel de miR-145 inducida por la doxorrubicina [26]. Sin embargo, en lugar de una activación de la transcripción de miR-145 se encontró que p53 se activa el procesamiento de los primarios de miR-145 en las transcripciones de miR-145 precursores [26]. Este fenómeno no sólo se limita a miR-145, pero también se aplica a varios otros miRNAs con funciones supresoras de crecimiento conocidos, lo que indica la regulación mediada por p53 de procesamiento de miRNA como una manera de ejercer su función supresora de tumores [26]. Además de c-Myc, miR-145 también se ha sugerido para dirigir el receptor de insulina humana sustrato-1 (IRS-1) y de tipo I del factor de crecimiento receptor de la insulina (IGF-IR) en el cáncer de colon [25], [ ,,,0],27]. Sin embargo, la especificidad de la interacción de destino no se confirmó mediante análisis mutacional de los sitios de semillas en cualquiera de estos casos
.
se induce El nivel de expresión de miR-145 durante la diferenciación de las células madre embrionarias humanas y miR-145 sobreexpresión se ha demostrado que poner en peligro el pluripotencia de las células madre embrionarias humanas mediante la focalización de
Oct4
,
Sox2
y
KLF4 Windows que están involucrados en el mantenimiento de la capacidad de auto-renovación de Las células madre de embriones humanos [28]. Este papel de miR-145 como un inductor de la diferenciación en las células madre embrionarias está de acuerdo con el papel de miR-145 como un represor del crecimiento en células de cáncer. Un modelo de ratón diseñado para investigar el patrón de expresión de miR-145 reveló la expresión de miR-145 en células progenitoras multipotentes cardiacas y células musculares lisas [29] y sugirió que el miR-145 promueve la diferenciación en células musculares lisas [29]. Sin embargo, otro estudio mostró que los ratones que carecen de miR-145 eran viables sin anomalías evidentes en la diferenciación de células de músculo liso [30], lo que demuestra la existencia de promotores adicionales de diferenciación.
En conjunto, miR-145 parece tener funciones supresores de tumores cuando se sobreexpresa en células de cáncer y, normalmente, pueden jugar un papel en los procesos de diferenciación. Aquí, nos hemos centrado en la identificación de objetivos de miR-145 en el cáncer de colon, sobre la base de perfiles de expresión de microarrays de células que sobreexpresan el miR-145. análisis de ontología de genes de miR-145 genes que responden a confirmar la regulación de genes implicados en la muerte celular, la regulación del ciclo celular y el cáncer. Hemos identificado una serie de miR-145 objetivos que podría ser interesante en un contexto de cáncer y verificado que el miR-145 objetivos SÍ y STAT1 en las células de cáncer de colon.
Resultados
Impulsada por la numerosa informes de miR-145 en el cáncer de regulación a la baja hemos tratado de identificar el miR-145 objetivos que podrían explicar el papel de miR-145 en el cáncer. Para profundizar en los niveles de expresión de miR-145 en líneas celulares establecidas, perfilamos los niveles de expresión en una serie de líneas celulares de cáncer, así como en líneas de células no tumorigénicas (Figura S1). Los perfiles de expresión de miR-145 mostraron que a excepción de MCF10A todas las líneas de células no tumorigénicas ensayadas expresaron miR-145, mientras que los niveles de expresión de miR-145 eran muy bajos en todas las líneas celulares de cáncer de prueba, el apoyo a los resultados anteriores, donde el miR-145 es las reguladas o se pierde en el cáncer. Debido a sus implicaciones en el cáncer de colon [13] - [18], se decidió investigar el papel de miR-145 en la línea celular de cáncer de colon DLD-1. La co-transfección de dúplex miR-145 con un indicador de luciferasa que contiene un sitio complementaria perfecta de los miRNAs maduros como resultado una regulación a la baja marcada de la actividad de la luciferasa, lo que demuestra una sobreexpresión (S2A figura) altamente eficaz. Como se ha demostrado por ambos ensayos de violeta cristal y de crecimiento MTT, la sobreexpresión de miR-145 dio lugar a una disminución de la proliferación celular (Figura 1 y Figura S3).
células transfectadas con 50 nM miR-145 exhiben un duplex 1 DLD- la proliferación celular reducida medida por ensayo de crecimiento de cristal violeta. Los datos se muestran como la media ± S.D. de cuatro repeticiones.
Identificación de miR-145 Objetivos
Teniendo en cuenta las indicaciones que el miR-145 juega un papel en el cáncer, junto con el conocimiento limitado de sus objetivos en el cáncer de colon, el objetivo era identificar objetivos funcionalmente relevantes que podrían ayudar a explicar el papel de miR-145 en el cáncer. Para lograr esto, se utilizó una estrategia basada en microarrays similar a la utilizada anteriormente para identificar objetivos de miR-21 [31]. LDN-1 células fueron transfectadas con 50 nM de miR-145 dúplex o falsamente transfectadas. El ARN total se cosechó 24 horas después de la transfección y se analizó en 2,0 arrays humanos Affymetrix HG-U133 Plus. Se analizaron un total de ocho matrices. Para el filtrado, los genes poco informativos con el mismo nivel de expresión en todos los arrays (incluidos los genes no expresado) se retiraron y los genes expresados diferencialmente, sus p-valores correspondientes y tasas de falso descubrimiento se calcularon como se describe en la sección Materiales y Métodos.
para determinar si los genes regulados en el miR-145 sobreexpresión estaban relacionados con las funciones celulares específicas, una búsqueda dentro de las anotaciones funcionales en la base de datos de Ingenuity (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) se realizó durante todo el miR-145 genes de respuesta. Las cinco principales categorías funcionales enriquecidos del análisis de ontología de genes se enumeran en la Tabla 1. Entre estas categorías son la muerte celular, el crecimiento celular y la proliferación, la regulación del ciclo celular y el cáncer. Correspondiente análisis utilizando conjuntos de genes al azar generados a partir de 2,0 anotaciones Affymetrix HG-U133 Plus, en algunos casos dieron lugar a un enriquecimiento de las mismas categorías que encontramos enriquecido en el conjunto de datos de miR-145, pero con valores de p 10 órdenes de magnitud más alta que en el miR-145 conjunto de datos (datos no mostrados).
análisis del sitio de semillas enriquecimiento de las ocurrencias de miR-145 en los sitios de siembra 3'UTRs demostró un enriquecimiento altamente significativa entre las transcripciones reguladas por (FIGURA 2A). Los valores de p para el enriquecimiento de miR-145 sitios de semillas (incluyendo 7mer, 7mer-1A y sitios 8MER) fueron de 1,4 · 10
-21 y 7,6 · 10
-8 al considerar las transcripciones reguladas por vs . transcripciones hasta reguladas y transcripciones vs. no hay transcripciones de cambio de las reguladas, respectivamente. Dos métodos alternativos de cálculo de la planta de enriquecimiento de semillas, ya sea como ocurrencias sitio semilla después de corregir el arriba, abajo y ningún cambio fija con el mismo tamaño o como ocurrencias sitio de semilla por kb, mostró un enriquecimiento similar en la 3'UTRs reguladas por ( Figura S4). En conjunto, esto verifica que el enfoque basado en el microarray se puede utilizar para identificar los genes miARN objetivos. Cuando se utilizó la secuencia completa de ADNc de los transcritos para el análisis del sitio de semilla de enriquecimiento (reportado como el porcentaje de las transcripciones con los sitios de semillas), todavía encontramos un enriquecimiento significativo de sitios de semillas, a pesar de que el enriquecimiento es menos pronunciada en comparación con sólo teniendo en cuenta el 3 'UTR secuencias (Figura S5A). Un análisis similar de las secuencias de codificación y secuencias 5'UTR no reveló sitio de semilla para el enriquecimiento (S5B figura y S5C).
A, Los porcentajes de genes en el arriba, abajo (DN) y sin cambios (SC ) establece con los sitios de semillas en sus 3'UTRs. Sólo aquellas 6mers que no son parte de un 7mer o 8mero son reportados como 6mers y sólo aquellos 7mers que no están contenidas dentro de un 8mero se cuentan como 7mers. El promedio diario de los factores de cambio fueron de 0,36, 0,02 y -0,40 para el arriba, abajo y sin cambios conjuntos, respectivamente. Los valores de p se calculan probar la hipótesis nula de que la proporción de genes con sitios de semillas son los mismos para la los genes regulados (DN) o frente a las reguladas por los genes en comparación con la ausencia de cambios y las reguladas genes (dn vs Carolina del Norte). P-valores para las semillas 7mer planta de enriquecimiento fueron de 1,7 · 10
-33 (dn vs. arriba) y 2,9 · 10
-11 (dn vs Carolina del Norte). P-valores para 7mer-1A sitio de enriquecimiento de semillas fueron 3,7 · 10
-18 (dn vs. arriba) y 7,8 · 10
-7 (dn vs Carolina del Norte). B, imparcial análisis de palabras que muestra la suma continua de la puntuación para la sobrerrepresentación 7mer sitio de semilla de miR-145 en la lista clasificada de las secuencias 3'UTR (línea negro) en comparación con las permutaciones de la lista de genes clasificado (líneas rojas). Abajo y hasta los genes regulados (definidos como los genes con el FC & lt; -1.1 o FC & gt; 1,1) en la lista de genes clasificados se indican en el gráfico. C, validación RT-PCR cuantitativa de los datos de microarrays. Las células fueron transfectadas con 50 nM de miR-145 dúplex o transfectadas de forma simulada y el ARN total cosecharon 24 horas después de la transfección. Los 3'UTRs de
IQGAP1
y
STAT1
no contienen semillas partidos de miR-145, pero ambos genes contienen un partido de semillas 7mer en su región codificante. Todos los demás miR-145 genes de respuesta contienen al menos un sitio de semilla 7mer en su 3'UTR. El nivel de expresión de cada transcripción se muestra en relación con el nivel en las células transfectadas simuladas. Los datos se muestran como la media ± S.D. de tres repeticiones.
analiza palabra imparcial de las secuencias 3'UTR identificado el sitio de semilla 7mer de miR-145 como la palabra más 7mer enriquecido significativamente en los 3'UTRs de transcripciones reguladas por (TABLA 2). Varias de las otras palabras altamente enriquecido eran variaciones del sitio de semilla de miR-145 y la cuarta palabra más enriquecida era el partido de semillas 7mer-1A (Tabla 2). Un correspondiente análisis de palabras 6mer también identificó el miR-145 semillas partidos como las palabras más significativamente enriquecido (FDR & lt; 0,005) (Figura S6). El trazado de la suma acumulada de las puntuaciones de sobrerrepresentación del sitio semillas 7mer en las transcripciones ordenados según su logFC mostró claramente que la 3'UTRs de transcripciones reguladas por los tenían un alto grado de enriquecimiento de miR-145 semillas 7mer (línea de color negro) que no se observó de permutaciones de la lista de genes clasificado (líneas rojas) (Figura 2b).
potenciales de miR-145 Objetivos
Dado que el miR-145 es el regulado o se pierde en el cáncer, re sería de esperar -Introducción de miR-145 para causar una regulación a la baja directa de los objetivos de oncogenes. De hecho, un número de genes con función oncogénica se redujeron reguladas a la sobreexpresión de miR-145 que incluye el miembro de la familia Src
SÍ
y la proteína actina entrecruzamiento
FSCN1
, que se encuentra en la celda proyecciones de superficie implicadas en la motilidad celular [32]. La metaloproteinasa
ADAM17
y miembro del inhibidor de la apoptosis (IAP) de la familia
BIRC2 gratis (también conocido como
cIAP1
), que ambos contienen 8MER miR-145 sitios de semillas en sus 3'UTRs, también se observaron como las reguladas en el miR-145 sobreexpresión. Además,
VANGL1
que está implicado en la respuesta de líneas de células epiteliales intestinales mediante la promoción de la migración celular cicatrización de la herida fue también identificado como un putativo de miR-145 de destino [33].
Algunas de las reguladas por los genes no tenían un sitio de semilla de miR-145 en su 3'UTR, pero en su lugar había una o más semillas a sitios en la región codificante. STAT1, un conocido factor de transcripción [34], [35] y IQGAP1 un regulador negativo de las adherencias célula-célula y estimulador de la motilidad celular y la invasión [36], ambos tenían miR-145 sitios de semillas en las regiones codificantes de sus transcripciones. En el caso de
STAT1
, el sitio de semilla de miR-145 se encuentra en la segunda último exón del transcrito. Desde
STAT1
fue una de las mayoría de las transcripciones abajo-regulada en el análisis de microarrays, también se consideró como un objetivo potencial y se incluye en las investigaciones posteriores. Los miR-145 objetivos previamente identificados
Oct4
,
Sox2
y
KLF4 Hoteles en células madre embrionarias humanas no fueron expresadas en las células DLD-1 (datos no mostrados).
MYC
,
ISR-1 | y
IGF-1R
, sugerido por otros como el miR-145 objetivos [16], [25], [27], no mostraron cambio en el nivel de expresión de miR-145 en la sobreexpresión en nuestro conjunto de datos (datos no mostrados). La lista completa de miR-145 objetivos potenciales identificados que contienen sitios de siembra en su 3'UTR se presenta en la Tabla S1.
Validación del destino
A continuación confirmó los datos de microarrays de RT-PCR cuantitativa para siete transcripciones seleccionados que fueron encontradas las reguladas en el análisis de microarrays (Figura 2C). En particular,
STAT1
y
SÍ
, que tienen el miR-145 sitios de semillas en la región codificante y 3'UTR, respectivamente, mostraron una clara regulación a la baja en el nivel de transcripción en el miR-145 sobreexpresión. Para determinar si el miR-145 regula directamente
SÍ
y
STAT1
, se clonaron construcciones de reportero de luciferasa. El apareamiento de bases entre los sitios de siembra miARN y los posibles objetivos de ARNm se representa en la figura 3A. En ambos casos, la sobreexpresión de miR-145 produjo una reducción de la actividad de la luciferasa, lo que indica que el miARN puede unirse tanto a la
SÍ
3'UTR y la
STAT1
ADNc y directamente mediar en la represión (Figura 3B ). Este no fue el caso con el reportero construcciones donde se habían mutado los sitios de siembra (Figura 3b). Para confirmar aún más el miARN mediada baja regulación de STAT1 y SÍ a nivel de proteínas, análisis Western Blot se realizaron tanto en las células DLD-1 y las células de cáncer de colon HCT116. La eficiencia de la sobreexpresión de miR-145 en HCT116 medida por construcciones de reportero de luciferasa fue similar a la observada en las células DLD-1 (Figura S2B). Una marcada disminución de nivel de proteína SÍ mediada por miR-145 se observó 48 horas después de la transfección en las células DLD-1 y HCT116 (Figura 3C). Una regulación a la baja más sutil, pero todavía clara de STAT1 mediada por el miR-145 también se observó (Figura 3D). En particular, el grado de represión STAT1 variaba entre las células DLD-1 y HCT116, con la represión fuerte de STAT1 observada en las células DLD-1.
A, la alineación de secuencias de la región de semilla de miR-145 y objetivos de mRNA. Las coordenadas de posición están indicados para las isoformas de transcripción se indican a continuación.
YES1
3'UTR: ENSG00000176105: ENST0000035983
STAT1
ADNc: ENSG00000115415: ENST00000361099. B, ensayo de luciferasa de la luciérnaga pGL3 con + construcciones que sostiene un fragmento 3'UTR de
SÍ
o un fragmento de ADNc de
STAT1
, aguas abajo del gen de la luciferasa de luciérnaga. Las células se co-transfectaron con la prensa a lo largo de la luciferasa de luciérnaga con un
Renilla
plásmido de control de transfección de luciferasa, ya sea solo o con 50 nM miR-145 duplex y 50 nM AllStar duplex como control negativo. En los vectores pGL3 + mut han mutado dos pares de bases en el sitio de semilla de miR-145. La luminiscencia se midió 24 horas después de la transfección y la relación de la luciérnaga a la actividad
Renilla
se muestra en relación con la transfección sin RNA dúplex y el vector vacío. Los datos se muestran como la media ± S.D. de cuatro repeticiones. *, P & lt; 0,05 usando una prueba t de dos colas, ***, p & lt; 0,01 usando una prueba t de dos colas. C y D, Western blot de células DLD-1 y HCT116 transfectadas con el miR-145 dúplex o células transfectadas de manera simulada borrados por el SI (C) y STAT1 (D). Vinculina o tubulina se utilizaron como controles de carga. Las bandas se cuantificaron con relación a los controles de carga apropiadas utilizando el software TotalLab y se muestran en relación con el nivel de proteína en las células transfectadas simuladas. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos.
Efectos Secundarios Debido a STAT1 desregulación
STAT1 es un factor de transcripción bien caracterizado mejor reconocido como un activador de la transcripción, pero los ejemplos de la regulación transcripcional negativo también se han descrito [34]. El motivo de unión STAT1 como se define por la base de datos JASPAR de núcleo [37] se muestra en la FIGURA S7A. Para determinar si el miR-145 mediada downregulation de STAT1 también causó un cambio del nivel de expresión de STAT1 genes diana en el análisis de microarrays, una búsqueda de STAT1 sitios en los promotores de unión a la baja regulado, hasta reguladas y las transcripciones sin se llevó a cabo el cambio en el nivel de expresión. Fuera de todos los factores de transcripción núcleo JASPAR, STAT1 era el sitio de unión enriquecido significativamente mayor tanto cuando el (valor de p = 4,18 · 10
-4) las reguladas y los genes regulados (p-valor = 1,34 · 10
-4) se compararon con los genes con ningún cambio en la expresión (Tabla 3). Este no fue el caso de una matriz de unión STAT1 permutado al comparar los genes a los genes regulados, sin cambios en el nivel de expresión (Figura S7B). Sin embargo, al considerar las reguladas por los genes en comparación con los genes de ausencia de cambios, también hubo un ligero enriquecimiento de STAT1 permutado sitios de unión, lo que indica que algunos de los efectos observados pueden ser no específicos (Figura S7C).
Discusión
miRNAs están surgiendo como importantes reguladores de genes y la investigación intensiva de sus funciones y objetivos han revelado un papel de miRNAs en varias funciones celulares clave. A pesar de que nuestra comprensión de los roles funcionales de miRNAs en los cánceres está aumentando de manera constante, el conocimiento sobre el miR-145 y sus objetivos en el cáncer de colon es todavía en gran parte que falta. Nosotros por lo tanto, se centró en la identificación de objetivos de miR-145 en células de cáncer de colon. Apoyando a los resultados anteriores que el miR-145 es el regulado en los tumores [10] - [13], [15], [16], [18] - [21], [38] - [42], un perfil de miR 145 expresión en líneas celulares establecidas demostró que los niveles de expresión de miR-145 se redujeron drásticamente en líneas celulares de cáncer en relación con las líneas celulares no tumorigénicas. De acuerdo con informes que muestran un efecto inhibidor del crecimiento de miR-145 [16], [17], [41], también se observa una reducción del crecimiento de DLD-1 células tras transfección transitoria de miR-145, lo que implica que el miR-145 posee una función supresora de tumores
in vitro
.
a continuación, hemos utilizado microarrays de perfiles sobre el miR-145 sobreexpresión como un método de identificación de objetivos potenciales. los perfiles de expresión de microarrays en combinación con el análisis de sitios de enriquecimiento de semillas es un método bien establecido utilizado para identificar potenciales genes miARN objetivos [31], [43], [44]. Tiene la ventaja sobre predicción objetivo estrictamente computacional que no sólo se basa en la presencia de un sitio de semillas y características de secuencia de la diana potencial, pero tiene en cuenta si la diana se expresa en la línea celular considerado y si se regula el objetivo en el nivel de transcripción. Desde este enfoque se basa exclusivamente en los cambios observados en el nivel de transcripción, los objetivos regulados exclusivamente por la represión de traducción no será identificado.
El análisis de semillas y la planta de enriquecimiento de análisis imparcial palabra mostraron un claro enriquecimiento de miR-145 sitios de semillas en el 3'UTRs de transcripciones reguladas por, lo que confirma nuestro enfoque para identificar el miR-145 objetivos. No se observó ningún tipo de enriquecimiento de miR-145 sitios de semillas en la región de codificación de las transcripciones reguladas por. Sin embargo, dado que algunos de los genes que contienen sitios de siembra dentro de la región de codificación previamente habían sido implicado en el cáncer, especuló que estos candidatos a blancos también pueden desempeñar un papel funcional de aguas abajo de miR-145. El análisis de palabras imparcial, que se utiliza aquí para evaluar el enriquecimiento de las palabras en 3'UTRs según la logFC de la transcripción a miR-145 sobreexpresión, presenta un método extremadamente útil para la visualización de los efectos de la sobreexpresión de los genes miARN sin hacer ninguna suposición con respecto a prejuicios de corte valores. La forma de la curva suma continua muestra un pico agudo de los miR-145 7mer sitios de semillas para la mayoría de los genes regulados objetivo que sugieren que la transcripción de baja regulación en gran parte se debe a los efectos directos de miR-145 de orientación. El análisis imparcial palabra confirma informes anteriores que muestran que una A en la posición 1 del sitio semilla es beneficiosa independientemente de su potencial para el par de bases con el miARN [2], [45].
Muchos de los objetivos identificados aquí previamente han sido implicados en el cáncer. Las categorías funcionales enriquecidos de todos los objetivos que responden miARN apoyaron aún más la implicación de miR-145 en el cáncer e implican que los efectos directos de miR-145, así como efectos secundarios pueden explicar el papel de miR-145 en el cáncer. Un número de genes con función oncogénica, muchos de los cuales también se han asociado con el cáncer de colon, se identificaron como posibles miR-145 objetivos basados en el análisis de microarrays. Estos incluyen
ADAM17
,
BIRC2
y
VANGL1
. ADAM17 ha informado hasta reguladas en carcinomas de colon y se ha demostrado para promover la liberación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ligandos de la membrana celular, activando así EGFR [46]. BIRC2 se ha demostrado que es esencial para mantener la supervivencia de células endoteliales y la integridad vascular en el pez cebra mediante la activación de la formación del complejo receptor de TNF I, así como la promoción de la degradación de I? B, en la que NF-kappa B es liberado y se transloca en el núcleo donde se activa los genes pro-supervivencia en las células endoteliales [47]. La fracción asociada membrana celular de VANGL1 aumenta con la diferenciación y se demostró para co-localizar con E-cadherina en células de colon humano [33]. Además, se demostró que la sobreexpresión de
VANGL1
estimulado enrollada cierre de líneas de células epiteliales intestinales, mientras que siRNA dirigido contra Vangl1 inhibió la respuesta migratoria [33]. Se informó anteriormente de miR-145 objetivos, incluyendo
Oct4
,
Sox2
y
KLF4
ha participado en la promoción de la proliferación de células madre no se expresa en las células DLD-1, lo que implica que la efecto inhibidor del crecimiento de miR-145 sobreexpresión en células DLD-1 no se debe a la regulación negativa de estos genes. Otro factor clave regulador de la proliferación celular,
MYC
, previamente reportado como un objetivo de miR-145 no mostraron cambios en el nivel de expresión de miR-145 en la sobreexpresión en nuestro medio.
Validación experimental de
SÍ
y
STAT1
como miR-145 objetivos han demostrado una marcada baja regulado en el nivel de ARNm y proteínas, lo que demuestra el efecto biológico de miR-145 en los objetivos endógenos. La regulación a la baja en los ensayos /ADNc de luciferasa 3'UTR valida, además, que este es el resultado de interacciones directas, ya que las mutaciones de los sitios de semillas de miR-145 abolir esta regulación. La razón de los diferentes efectos de miR-145 en los diferentes ensayos es probablemente debido a una falta de comparabilidad directa entre estos ensayos. Esta diferencia también podría deberse a otros factores de unión implicados en la regulación de la transcripción endógeno, ya que estos sitios de unión no están presentes en los fragmentos de ADNc 3'UTR o utilizados en las construcciones de reportero de luciferasa clonados.
Varios Los estudios han relacionado la expresión aumentada de SI en el cáncer con el aumento de la motilidad celular y la invasión tumoral [48], [49]. SI es parte de la familia Scr quinasa [50] y su actividad tirosina quinasa ha demostrado ser elevados en adenomas de colon en comparación con su actividad en la mucosa normal adyacente [51]. Además SÍ se encontró que la actividad que se correlaciona con el riesgo de cáncer predicho basado en el tamaño, la histología, y el grado de displasia [51]. Tomados en conjunto, los datos actuales sugieren que la regulación positiva de SI es importante para el crecimiento y la transformación de las células intestinales.
proteínas STAT funcionan aguas abajo de JAKs y MAPKs, que inducen la dimerización de proteínas STAT, lo que permite la translocación de STAT las proteínas en el núcleo [34], [35]. STAT1 es mejor conocido por su papel pro-apoptótica en respuesta a los interferones, pero STAT1 También se ha informado que tienen un papel pro-supervivencia en algunos tipos de cáncer [35]. Se ha observado una regulación a la baja de
STAT1
en el nivel de transcripción y el nivel de proteína tras la sobreexpresión de miR-145. Además, se muestra que esta regulación a la baja de STAT1 se traduce en un efecto sobre el nivel de expresión de los objetivos potenciales de STAT1. Este es el caso para genes tanto positiva como negativamente regulados por STAT1, pero el efecto es el mayor en genes regulados negativamente por STAT1. A pesar de que STAT1 ha informado tanto como un activador transcripcional y represor, el principal mecanismo de regulación de la transcripción STAT1 es la activación de sus genes diana [34]. Nuestros hallazgos sugieren que la represión transcripcional está más extendido de lo reconocido anteriormente. En resumen, los análisis de factor de transcripción de los promotores de los genes desregulados proporciona un medio para caracterizar los efectos secundarios según lo publicado previamente para miR-34a [52]. El enriquecimiento identificado de STAT1 sitios de unión en los promotores de genes regulados demuestra que los efectos secundarios de los miRNA sobreexpresión se pronuncian ya 24 horas después de la transfección. Por lo tanto, es importante tener en cuenta los efectos secundarios en el análisis de los genes miARN sobreexpresión conjuntos de datos.
En conclusión, el uso de un enfoque basado en microarray hemos identificado objetivos adicionales para el cáncer asociados miARN miR-145 en células de cáncer de colon. Los miARN objetivos identificados en este estudio pueden servir para aclarar el papel de miR-145 en el cáncer de colon, así como otros tipos de cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares
células DLD-1 se cultivaron en DMEM GlutaMAX ™ -I medio de alta glucosa (31966, Gibco Invitrogen) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS, CH30160.03, Hyclone), 50 U /ml de penicilina y 50 g /ml de estreptomicina (P /S, 15140 Gibco Invitrogen) y se incubaron en 5% de CO
2 más 20% de oxígeno. células HCT116 se cultivaron en medio de McCoy 5A-L glutamina (22330, Gibco Invitrogen) suplementado con 10% (v /v) de FBS y P /S. La sobreexpresión de miR-145 se consiguió mediante la transfección con un dúplex de miR-145 que imita la madurez de miR-145 (PM11480; Ambion). La transfección con
Caenorhabditis elegans
lin-4 duplex (PM10768, Ambion) o AllStar ARNsi de control negativo (1027281, Qiagen) se utilizó como control. Todas las transfecciones se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine ™ 2000 reactivo de transfección (11668-019, Invitrogen) de acuerdo con los fabricantes de protocolo.