Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) se definen como una pequeña población de células cancerosas con las propiedades de alta auto-renovación, diferenciación y funciones iniciadoras del tumor. Estudios recientes han demostrado que la aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1) es un marcador de células madre cancerosas en cánceres en adultos. Aunque los CAC se han identificado en los diferentes tipos de tumores sólidos pediátricos, no se han realizado estudios sobre la eficacia de ALDH1 como marcador de células madre cancerosas. Por lo tanto, con el fin de dilucidar si ALDH1 se puede utilizar como un marcador de células madre cancerosas de sarcoma pediátrico, se examinaron las características de una población de células con una actividad de alto ALDH1 (ALDH1
pilas de gran) en rabdomiosarcoma (RMS), la más sarcoma de tejidos blandos común en los niños. Se utilizaron las líneas celulares de rabdomiosarcoma embrionario humano (ERMS) y RD KYM-1, y se clasifican las células en dos subpoblaciones de ALDH1
pilas de gran y células con una baja actividad ALDH1 (ALDH1
células de baja). En consecuencia, se encontró que los ALDH1
pilas de gran comprendían el 3,9% y el 8,2% de la población total de células, respectivamente, y mostraron una mayor capacidad de auto-renovación y formación de tumores de las ALDH1
células bajas. Con respecto a la quimiorresistencia, se encontró que la tasa de supervivencia de los ALDH1
pilas de gran a ser más alta que la de las células de baja ALDH1
después del tratamiento con agentes quimioterapéuticos para RMS. Además, los ALDH1
pilas de gran exhiben un mayor grado de pluripotencia y la expresión génica de Sox2, que es uno de los marcadores de células madre. Tomados en conjunto, los ALDH1
pilas de gran poseían características de células madre cancerosas, incluyendo la capacidad de formación de colonias, la quimio-resistencia, la diferenciación y la iniciación del tumor. Estos resultados sugieren que la ALDH1 es un marcador potencialmente útil de los CAC en erms
Visto:. Nakahata K, S Uehara, Nishikawa S, M Kawatsu, Zenitani M, Oue T, et al. (2015) de la aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1) es un marcador potencial de las células madre cancerosas en rabdomiosarcoma embrionario. PLoS ONE 10 (4): e0125454. doi: 10.1371 /journal.pone.0125454
Editor Académico: David M. Loeb, Universidad Johns Hopkins, Estados Unidos |
Recibido: 26 Septiembre, 2014; Aceptado: March 21, 2015; Publicado: 27 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Nakahata et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado financieramente por la JSPS KAKENHI la subvención Número 23592630 (SU) y 25861668 (KN). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción las células madre similares a
cáncer (CSC) se definen como una pequeña población de células cancerosas con las propiedades de alta tumoral-iniciador, auto-renovación y diferenciación de funciones [1]. Además, los CAC son resistentes a las terapias convencionales, tales como quimioterapia y radioterapia, y por lo tanto responsable de la recaída del tumor después del tratamiento, así como la invasión y metástasis [2, 3].
rabdomiosarcoma (RMS) es la más común sarcoma de tejidos blandos en los niños. A pesar de las mejoras significativas en la supervivencia en los últimos decenios, más de un tercio de los pacientes RMS siguen muriendo de la enfermedad [4]. Los pacientes con tumores metastásicos refractarios o presentan un pronóstico particularmente grave [5]. Aumentar los regímenes convencionales no ha mejorado significativamente la supervivencia, y la investigación de células madre cancerosas de RMS es muy importante para mejorar el pronóstico, ya que se supone que estas células para inducir la recaída y la metástasis. Aunque CD133 (prominin-1) ha sido informado de que un marcador de células madre cancerosas [6], que también existe en las células madre normales, y es necesario para identificar otros marcadores para RMS.
Estudios recientes han demostrado que aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1) es un marcador de células madre cancerosas en cánceres en adultos [7, 8, 9]. A pesar de que los CAC se han identificado en muchos tipos diferentes de tumores sólidos pediátricos [10, 11], actualmente no existen estudios sobre la eficacia de la ALDH1 como marcador de células madre cancerosas en el campo de la oncología pediátrica.
En este estudio , la hipótesis de que una subpoblación de células con una actividad alta ALDH1 (ALDH1
pilas de gran) exhibiría características de células madre cancerosas en RMS y posteriormente examinado las características de ALDH1
en pilas de gran RMS embrionario (ERMS). Se analizaron líneas celulares de rabdomiosarcoma embrionario usando un ensayo de ALDEFLUOR y encontró que los ALDH1
pilas de gran tenían características de células madre cancerosas, incluyendo la capacidad de formación de colonias, la quimio-resistencia y la iniciación del tumor, y evaluaron la expresión del ARNm de las isoformas ALDH1, oncogén y el gen stemness.
Materiales y Métodos
línea celular y cultivo celular
La línea celular de rabdomiosarcoma embrionario humano, RD y KYM-1 se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y JCRB (Ibaraki, Japón), respectivamente. Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS) y se cultivaron en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C.
se detectó ensayo ALDEFLUOR
el aldehído deshidrogenasa actividad (ALDH) usando un kit de ensayo ALDEFLUOR (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se tiñeron con BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA) y se incubaron durante 40 minutos a 37 ° C. Un inhibidor específico de la ALDH1, diemethylamino-benzaldehído (DEAB), se utilizó para el control de la fluorescencia de fondo. Se analizaron las células teñidas mediante el FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y se clasifican en el ALDH1
pilas de gran, que se detecta en el canal de fluorescencia verde (515-545 nm), y una subpoblación de las células con una actividad baja ALDH1 (ALDH1
células de baja). Los datos se analizaron utilizando el programa de software DIVA FACS (BD Biosciences). Con el fin de excluir las células no viables, se añadió 7-AAD (BD Biosciences) a una concentración final de 0,25 g /ml.
Colonia ensayo de formación de
Las células clasificadas se suspendieron en 10 ml de RPMI-1640 y 10% de FBS, y 1 × 10
4 células se sembraron en placas de cultivo con 3 ml de metilcelulosa que contiene-RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, de acuerdo con el protocolo de Rahadiani et al. [8]. Las células se tiñeron con cristal violeta (0,05% w /v), para visualizar las colonias, y se contó el número de colonias después de dos meses.
viabilidad de las células de ensayo
Para evaluar la viabilidad celular , las células clasificadas se cultivaron en placas a 5 x 10
3 células por placas de 96 pocillos (Corning, Corning, NY, USA) durante un día y después se incubaron con varias concentraciones de vincristina, ciclofosfamida y etopósido (Wako, Osaka, Japón ) por tres días. Posteriormente, el grado de viabilidad celular se investigó usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
diferenciación de los adipocitos ensayo
Para el ensayo de diferenciación de los adipocitos, las células seleccionadas se sembraron a una densidad de 1 × 10
4 células por placa de 6 pocillos (Corning, Corning, Nueva York, EE.UU.) con 0,1% de DMSO durante tres días. Después de ocho días en RPMI, conteniendo 1 mg /ml de insulina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina, dexametasona 10 mM, 1% de penicilina /estreptomicina y 10% de FCS, se detectó la acumulación de lípidos neutrales en células fijadas en 10% de formaldehído células fijadas utilizando Oil Red O (Wako, Osaka, Japón) de acuerdo con el protocolo de Hwang et al. [12].
ensayo de inmunofluorescencia La neurogénesis y
Para el ensayo de la neurogénesis, las células seleccionadas se sembraron a una densidad de 1 × 10
4 células por placa de 6 pocillos y se trató con 100 nM ATRA (ácido trans-retinoico, Wako, Osaka, Japón). Después de tres semanas, las células se tiñeron con NCAM (1/200) (123C3, monoclonales, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) a través de inmunofluorescencia según el protocolo de Walter et al. [6], y los núcleos se contratiñeron con DAPI (Dojindo)
.
Para la tinción de inmunofluorescencia, las células clasificadas se fijaron en 4% PFA y bloqueado en medio que contiene 3% de BSA y 0,1% Triton X-100 (Nacalai tesque, Kyoto, Japón). Las células clasificadas se tiñeron durante la noche a 4 ° C, y Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de ratón (1/1000) (A11001, Life Technologies) anticuerpos se utilizaron como anticuerpos secundarios. Todos los resultados se analizaron con tinción con el dispositivo BZ-9000 (KEYENCE, Osaka, Japón).
trasplante de xenoinjerto
Se recogieron las células clasificadas y se resuspendieron a una concentración de 10
2- 10
4 células por 100 l de RPMI-1640 y luego se mezcla con 100 l de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). La mezcla de células-Matrigel se inyectaron posteriormente en el espacio subcutáneo en 4 semanas de edad diabéticos no obesos /severa inmune-deficiencia combinada ratones (NOD. CB17-Prdkc
scid J, Laboratorio (NOD /SCID) /Charles River , Yokohama, Japón) bajo anestesia general. El crecimiento tumoral se controló cada dos días y se comprueba si se formaron los tumores durante dos meses
Los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Osaka. (número de permiso: 23-080-004), y llevado a cabo de conformidad con las directrices institucionales. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
La inmunohistoquímica
Los xenoinjertos de tumores de los ratones y las muestras clínicas se incluyeron en parafina, se fijaron y se analizó la hematoxilina, Miogenina (1/200) (5FD , policlonal, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.), desmina (1/200) (H-76, policlonal, Santa Cruz Biotechnology) y ALDH1 (1/200) (44 /ALDH, monoclonales, BD Biosciences) utilizando la tinción inmunohistoquímica (IHC). Como anticuerpo secundario, se utilizaron anticuerpos anti-ratón peroxidasa de rábano (HRP) de conejo marcado con (Dako, Glostrup, Dinamarca). Los resultados de la tinción se visualizaron con el EnVision + solo reactivo-kit (Dako).
análisis de PCR cuantitativa en tiempo real
Cuantitativo en tiempo real PCR se realizó utilizando el dispositivo AB7900HT (Applied Biosystems, foster City, CA, EE.UU.) para determinar la expresión relativa de los genes ALDH1 (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 y ALDH1L2), ABC transportador de genes (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 y ABCA2), oncogenes (c-Myc ) y el marcador troncalidad (Sox2).
El ARN total fue extraído por medio de NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). La transcripción inversa se llevó a cabo usando el PrimeScript RT Master Mix (Takara, Shiga, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
en tiempo real las reacciones de PCR se realizaron por triplicado utilizando el Platinum SYBR Green Super Mix con ROX (Vida Technologies) en AB7900HT. El gen de mantenimiento, deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH), sirvió como un control interno, tal como se expresa de forma estable en diferentes tejidos. La Tabla 1 muestra los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real. Los niveles de expresión se calcula en base al 2
método -ΔΔCT.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete de software GraphPad Prism6 (GraphPad Software, La Jolla , CA, EE.UU.).
Los valores P Red de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas según la prueba exacta de Fisher para el trasplante de xenoinjerto y
t-test
para los otros experimentos
Resultados de Student.
Detección y características de ALDH1
pilas de gran como células madre cancerosas en células RD y KYM-1 |
inicialmente se intentó identificar la ALDH
pilas de gran RD y en células KYM-1 usando un ensayo ALDEFLUOR. En las células RD, la relación de las ALDH1
pilas de gran teñidas con BAAA fue del 4,1%, mientras que la de las teñidas con BAAA y DEAB como control negativo fue 0,2%. Por lo tanto, la relación real de los ALDH1
pilas de gran era 3,9% de todas las células RD cultivadas (Fig 1A). Del mismo modo, la relación de las ALDH1
pilas de gran era del 8,2% en KYM-1 células (Figura 1B) guía
RD (A) y KYM-1 células (B) se tiñeron con DEAB (de control.: panel izquierdo) o sin DEAB (panel derecho) después de haber sido manchado con BAAA y luego analizados mediante FACS Aria II con el kit de ensayo ALUDEFLUOR. La proporción de ALDH1
pilas de gran era de 3,9 ± 0,26% en las células RD y 8,2 ± 0,14% en las células KYM-1. La media ± desviación estándar se calcula a partir de tres experimentos independientes. Todo ALDH1
pilas de gran y un subconjunto de los ALDH1
baja células fueron ordenados como se muestra en los paneles de la derecha de la figura 1A y 1B.
A continuación, se realizó un ensayo de formación de colonias de documentar la capacidad de auto-renovación de las ALDH1
y pilas de gran ALDH1
células bajas. En consecuencia, el número de colonias de ALDH1
pilas de gran fue mayor que la de ALDH1
células bajos (30,3 vs. 14,5 colonias /pocillo, respectivamente, P & lt; 0,05) (Fig 2A y 2B). Los ALDH1
células de altura, por lo tanto, tenían una capacidad de formación de colonias mayores que los ALDH1
células bajas.
A, ensayo de formación de colonias. El número de colonias que eran visibles macroscópicamente, derivado de las ALDH1
alto y ALDH1
células bajos de células RD, se contó y anotó a los dos meses después de la siembra. La media ± desviación estándar se calculó a partir de tres experimentos independientes (nueve pozos para ALDH1
altas o ALDH1
baja células en total). Los ALDH1
pilas de gran formaron colonias significativamente más que los ALDH1
células bajas. B, Las imágenes representativas de las colonias se muestran en el panel izquierdo (ALDH1
alto) y el panel de la derecha (ALDH1
bajo).
En cuanto a la quimio-resistencia, se analizó la tasa de supervivencia de los ALDH1
pilas de gran en las células RD y células KYM-1 cultivadas con vincristina, ciclofosfamida y etopósido utilizando la (ensayo WST-8) Cell Counting Kit-8. La viabilidad de las ALDH1
pilas de gran después de cultivar con vincristina, ciclofosfamida y etopósido fue significativamente mayor que la de las células de baja ALDH1
tratados con estos agentes quimioterapéuticos, lo que sugiere que los ALDH1
pilas de gran poseían una mayor capacidad para la quimio-resistencia de los ALDH1
células bajas (figura 3).
El ALDH1
células bajas y altas ALDH1
de RD (a) y KYM-1 células (B) fueron tratados con 100 nM-10 mM vincristina, ciclofosfamida 5 mM-15 mM y 10 mM-100 mM etopósido y la viabilidad celular se midió después de 72 horas usando un ensayo de WST-8. La viabilidad de las células "no tratamiento" también se midió como un control. La media ± SD se calculó a partir de pocillos por triplicado de un experimento representativo, y los datos de tres experimentos independientes se muestran en la figura. La viabilidad de las ALDH1
pilas de gran fue significativamente mayor que la de los ALDH1
células bajas.
A medida que los CAC se han documentado para exhibir la pluripotencia, se analizó la capacidad de diferenciación de la ALDH1
pilas de gran a adipocitos y células neuronales en las células RD. Se encontró que los ALDH1
pilas de gran a ser más ricos con las gotas de lípidos teñidas con Oil Red O que los ALDH1
baja células (Fig 4A), y no se observaron tinciones positivas para NCAM en el ALDH1
pilas de gran, indicativa de la diferenciación neuronal (Fig 4B). Estos resultados indican que la ALDH1
altos células de las células RD tienen la capacidad de diferenciarse en adipocitos y las células neuronales, lo que indica el potencial de pluripotencia.
A, ensayo de diferenciación de adipocitos. Los ALDH1
células bajas y altas ALDH1
de RD células fueron cultivadas en un medio de diferenciación de los adipocitos. El ensayo se repitió tres veces, y las imágenes representativas de Oil Red O tinción se muestran en el panel izquierdo (ALDH1
alto) y en el panel de la derecha (ALDH1
bajo) (× 40). las gotas de lípidos de adipocitos teñidas de color rojo con rojo aceite O. B, ensayo de diferenciación de las células neuronales. Los ALDH1
células bajas y altas ALDH1
de RD células fueron tratadas con ácido retinoico 100 nM y se tiñeron para NCAM (verde). Los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul). El ensayo se repitió tres veces, y las imágenes representativas de la tinción de inmunofluorescencia se muestran en el panel izquierdo (ALDH1
alto) y en el panel de la derecha (ALDH1
bajo).
El tumor capacidad de la ALDH1 -initiating
pilas de gran en las células RD se examinó mediante la inyección de 1 x 10
2, 1 × 10
3 y 1 × 10
4 ALDH1
en pilas de gran NOD /ratones SCID; También se inyectaron ALDH1
células de baja de la misma manera. En consecuencia, se observó la formación de tumores en dos de los siete ratones inyectados con 1 x 10
3 ALDH1
pilas de gran y cinco de los seis ratones inyectados con células 1 × 10
4 ALDH1
altos, mientras no hay tumores se encuentran en los ratones inyectados con ALDH1
células bajas, ya sea en la densidad de células (p & lt; 0,05, Tabla 2 y Fig 5A). Estos resultados muestran que la ALDH1
pilas de gran tienen una capacidad de iniciación de tumor significativamente mayor que los ALDH1
pilas de gran.
A, imagen representativa de un ratón NOD-SCID portador del tumor. (A la derecha: ALDH1
pilas de gran, izquierda: ALDH1
células de baja). B-D, inmunohistoquímica (IHC) tinción de las secciones de xenoinjertos tumorales. Las secciones se tiñeron para hematoxilina, marcadores miogénicos (desmina (B), miogenina (C)) y ALDH1 (D). Las células tumorales fueron positivas para desmina y Miogenina mientras que sólo unas pocas células fueron positivas para ALDH1, lo que sugiere que la ALDH1
pilas de gran promovidos rabdomiosarcoma y se reconstituyeron para incorporar la gama completa de heterogeneidad.
El ALDH1
pilas de gran demostraron una capacidad iniciadoras del tumor más altos que los ALDH1
pilas de gran. se resumen los datos de dos experimentos independientes.
tinción
A continuación, se realizó inmunohistoquímica (IHC) de las secciones de xenoinjertos de tumores de la ALDH1
pilas de gran. Estas células se tiñeron positivas para marcadores miogénica (desmina, Miogenina) y ALDH1 (figura 5B-5D). Las células tumorales fueron positivas para desmina y Miogenina, mientras que sólo unas pocas células fueron positivas para ALDH1, lo que sugiere que la ALDH1
pilas de gran promovidos rabdomiosarcoma y se reconstituyeron para incorporar la heterogeneidad completa.
En su conjunto, nos llegó a la conclusión de que ALDH1
pilas de gran están enriquecidas con células madre cancerosas de RD y KYM-1 células.
los niveles de mRNA de ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, ABCB1, ABCG2 y Sox2 se upregulated en el ALDH1
altas las células de las células RD
Además, hemos investigado los niveles de expresión de varios miembros de la familia ALDH1 (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 y ALDH1L2) en las células RD. Como resultado, los niveles de expresión de ALDH1A3, ALDH1B1 y ALDH1L2, pero no ALDH1A1, en los ALDH1
pilas de gran fueron más altas con la observada en los ALDH1
células bajas (figura 6A).
a-tiempo real análisis de PCR cuantitativa se realizó para evaluar los niveles de expresión de ALDH1 (a), marcadores stemness (B) y los transportadores ABC (C). La media ± SE se calculó a partir de pocillos por triplicado de un experimento representativo, y los datos para uno de los tres experimentos independientes se muestran en la figura. La expresión de ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, Sox2 y ABC transportadores fue significativamente mayor en los ALDH1
pilas de gran que en los ALDH1
células bajos (p & lt; 0,01).
A continuación, se investigó si ALDH1
pilas de gran están enriquecidas para la expresión de los genes que se cree que desempeñan un papel importante en stemness, tales como c-Myc y Sox2. Cuantitativa en tiempo real PCR mostró un aumento de la expresión de Sox2 en el ALDH1
pilas de gran relativos a la ALDH1
células de baja, mientras que no se observaron aumentos significativos en la expresión de c-Myc (Fig 6B).
Los niveles de expresión relativa de los tres principales transportadores de fármacos ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 y ABCA2 se examinó también. Curiosamente, el ALDH1
pilas de gran mostró un incremento en la expresión de todos los transportistas, lo que sugiere que ALDH1
pilas de gran capaciity tienen un más alto para la quimio-resistencia de ALDH1
baja células (figura 6C).
Discusión
El concepto de los CAC se ha propuesto largo [13]. Los CCC se definen por dos características fundamentales, una mayor tumorigenicidad y la capacidad de auto-renovación /diferenciación [14]. Por lo tanto, la población aislada CSC no sólo da lugar a tumores de novo con una alta eficiencia, sino también recapitula el tumor con ambas poblaciones no CSC CSC y. Además, la mayoría de células madre cancerosas exhiben resistencia a las terapias contra el cáncer convencionales utilizando agentes quimioterapéuticos y radiaciones ionizantes [2]. Hasta la fecha, los CAC se han identificado en diversas enfermedades malignas, incluyendo leucemia mieloide aguda [15], tumores cerebrales [16], carcinoma hepatocelular [17], cáncer de mama [7], cáncer de pulmón [18], cáncer de páncreas [19] y de ovario cáncer [8].
enzimas ALDH constituyen una familia de enzimas que comprenden de 19 isoformas localiza en el citoplasma, mitocondrias y núcleo. ALDH son responsables de la oxidación de aldehídos a ácidos carboxílicos. Mientras que muchos aldehídos juegan un papel crítico en los procesos fisiológicos, tales como la visión, la neurotransmisión y el desarrollo embrionario, la mayoría de los aldehídos son citotóxicos y deben ser desintoxicados, tal como fue revisado por Marchitti et al [20].
Un método ampliamente aceptado para la identificación de los CAC se basa en la detección de la actividad enzimática de ALDH1, un desintoxicante enzima responsable de la oxidación de aldehídos intracelulares. La alta actividad de ALDH1 en CSC se ha utilizado para aislar células madre cancerosas en diferentes tumores malignos [6, 7, 8, 16, 18, 21, 22]. Por lo tanto, ALDH1
pilas de gran muestran características que suelen encontrarse en los CAC, incluyendo la auto-renovación, diferenciación y altas capacidades iniciadoras del tumor.
Nos confirmó que la ALDH1
altas células de la RD y KYM- 1 células poseen características de células madre cancerosas y, en otro experimento usando células RMS-YM, una línea celular erms, se analizó la actividad de ALDH. A diferencia de lo observado en el RD y células KYM-1, no se detectaron ALDH1
pilas de gran. A continuación, como CSC se ha documentado que tienen la capacidad de formar esferas, hemos examinado la capacidad de formación de esferas de estas células. En consecuencia, la RD y células KYM-1 forman esferas grandes, mientras que las células RMS-ym no forman esferas en medio libre de suero (datos no mostrados). Estos resultados refuerzan la hipótesis de que ALDH1
pilas de gran poseen características de células madre cancerosas.
De acuerdo con Lohberger et al. [23] y Awad et al. [24], ALDH1
pilas de gran típicamente se aislaron a partir de líneas celulares humanas sarcoma (fibrosarcoma, liposarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma, sarcoma de Ewing y). Su estudio demostró que ALDH1
pilas de gran se caracterizan por una alta tasa de proliferación, la formación de colonias y la expresión de genes transportadores ABC y marcadores stemness (β-catenina, Sox2 y Nanog). En el estudio actual, ALDH1
pilas de gran mostraron la formación de colonias, así como un incremento en la expresión de genes de los transportadores ABC (ABCB1, ABCG2 y ABCA2) y marcadores de troncalidad (Sox2). Por lo tanto, nuestros datos sugieren que ALDH1 es también un marcador potencial de células madre cancerosas en ERM.
El ensayo ALDEFLUOR fue desarrollado para detectar la actividad de la isoforma ALDH1 mediante el aislamiento con éxito de células madre hematopoyéticas viables a partir de sangre de cordón umbilical humano [25 ] y se ha informado que es específica para la isoforma ALDH1 encuentran en gran abundancia en estas células, ALDH1A1 [26]. Sin embargo, mientras que otras isoformas ALDH individuales hacen mostrar alguna especificidad sustrato preferido, sino que también exhiben una reactividad cruzada, por lo que es probable que el ensayo ALDEFLUOR detectará la actividad ALDH1 de varias isoformas ALDH expresadas en las células [27]. En el presente estudio, la expresión de ALDH1A3, ALDH1B1 y ALDH1L2 en los ALDH1
pilas de gran aumentó, mientras que la de ALDH1A1, que se cree que desempeñan un importante papel funcional en las células madre, no fue mayor en el ALDH1
pilas de gran. Marcato et al. [28] informó de que un aumento de la actividad ALDH en las células madre de cáncer de mama se debe a los efectos de la ALDH1A3 isoforma, mientras que Chen et al. [29] informó de que ALDH1B1 se expresa más profundamente en adenocarcinomas que ALDH1A1, aunque la función y la localización celular de ALDH1L2 siguen siendo desconocidos. Dado que nuestros datos son consistentes con estos resultados, los CAC de las células RD también pueden tener características similares a las de las células tumorales epiteliales.
Un mecanismo propuesto para la quimio-resistencia de las células madre cancerosas se basa en la mayor expresión de ATP-binding cassette proteínas de transporte (ABC), que son responsables de flujo de salida de drogas [30]. Una alta expresión de los transportadores ABC en las células madre en comparación con no las células madre resultados en la resistencia relativa de las células madre a los efectos tóxicos de los medicamentos de quimioterapia. En este estudio, hemos analizado la expresión de tres transportadores de fármacos (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 y ABCA2) de la familia de transportadores ABC y encontramos que todos los transportadores ABC se upregulated en las ALDH1
a partir de células de alta RD. Además, los ALDH1
pilas de gran mostraron el aumento de la resistencia a la vincristina, ciclofosfamida y etopósido, que se utiliza comúnmente como los fármacos quimioterapéuticos de rabdomiosarcoma. De hecho, se realizó la inmunohistoquímica usando las muestras de la alimentación por pilas, resecados antes y después de la quimioterapia, y se encontró que los especímenes resecados después de la quimioterapia exhibió una mayor expresión ALDH1 citoplasmática de la muestra primaria (Figura 7A y 7B).
la muestra de biopsia de erms obtenidos antes de la quimioterapia (a) y las piezas de resección obtenidos después de la quimioterapia (B) se tiñeron positivo para ALDH1 en inmunohistoquímica. Estas muestras fueron tomadas de los tejidos de la vagina erms-originado de una niña de 1 año de edad. Las piezas de resección después de la quimioterapia mostraron una mayor expresión ALDH1 citoplasmática de la muestra de biopsia primarias.
Estos datos sugieren que la mayor expresión del transportador ABC observado en los ALDH1
pilas de gran causa que la quimio-resistencia. Además, estos resultados son similares a las células de población lateral (células SP), que expresan diversos transportadores ABC responsables de la resistencia a los medicamentos, incluyendo ABCG2 (BRCP) [31]. Komuro et al. [32] informó se detectaron células SP en el RD usando FACS con colorante Hoechst. De hecho, de acuerdo con Yasuda et al. [33], y las células SP ALDH1
pilas de gran superponen en las células madre del cáncer de ovario. Por lo tanto, las poblaciones de células SP y los ALDH1
pilas de gran pueden solaparse en rabdomiosarcoma también.
Este es el primer estudio para documentar que ALDH1 se puede usar como un marcador para RMS. También se utilizó una línea celular de RMS alveolar (ARMS) (RH30) y examinamos la actividad de ALDH. Aunque se detectaron ALDH1
pilas de gran RH30 de células, de forma inesperada los ALDH1
altas células de armas no se formaron colonias o esferas (datos no mostrados). Una explicación probable de este fenómeno es que surgen los dos principales RMS subtipos de diferentes células de origen, habida cuenta de las diferencias clínicas y biológicas sustanciales entre ellos, como se informó anteriormente por Pressey et al. [34]. Actualmente estamos planeando para examinar si ALDH1 puede ser utilizado como un marcador en otras líneas celulares de armas.
En los últimos años, la investigación sobre células madre pluripotentes inducidas (iPS) ha progresado rápidamente y se ha aplicado al campo de la oncología. Oshima et al. [35] informó de la generación de células madre cancerosas inducidas (ICSC) mediante la introducción de factores definidos (Oct3 /4, Sox2 y Klf4) en líneas celulares de cáncer colorrectal humano. Como resultado, los niveles de expresión de ALDH1 se incrementaron en los FISQ. Por lo tanto, ALDH1 puede estar relacionado con las propiedades y funciones de CSC como una herramienta útil para la investigación sobre células madre cancerosas. Aunque la teoría de las células madre del cáncer sigue siendo controvertida [36], nuestros resultados apoyan la existencia de células madre cancerosas en la alimentación por pilas, y creemos que ALDH1 puede ser útil para la detección de células madre cancerosas como diana terapéutica.
En conclusión, se confirma que los ALDH1
altos de células erms poseen características de células madre cancerosas, incluyendo la capacidad de formación de colonias, la quimio-resistencia y la iniciación del tumor. Estos resultados sugieren que la ALDH1 es un marcador potencialmente útil de los CAC en erms.