Extracto
Introducción
LDH-A, la enzima responsable de la transformación de piruvato en lactato, se ha demostrado para estar regulado en muchos tipos de cáncer y para dar lugar a un comportamiento más agresivo mediante la regulación de la proliferación y la lucha contra la apoptosis. Sin embargo, su expresión en el cáncer gástrico (GC) no se ha caracterizado a fondo. El propósito de este estudio era aclarar la expresión y el impacto potencial de la LDH-A en GC.
Métodos
Hemos examinado la LDH-A expresión mediante inmunohistoquímica sobre tejido de microarrays GC (TMA) y el uso de Western blot en tejidos frescos GC y líneas celulares. Se evaluaron el valor pronóstico y la correlación con otros factores clínico-patológicos. Estamos transfectadas siRNA en células GC contra LDH-A. LDH-A se analizó mediante transferencia Western y en tiempo real de RT-PCR. El crecimiento celular se evaluó in vitro y in vivo. Se determinó el lactato y la producción de ATP por las células.
Resultados
Se ha producido significativamente mayor LDH-A expresión en el carcinoma que en la mucosa no neoplásica (NNM). Hubo una correlación positiva de la LDH-A expresión con la edad, tipo histológico y la metástasis en los ganglios linfáticos. El análisis de supervivencia demostró que la alta expresión de la LDH-A en GC se asoció con una menor supervivencia global (OS). Cuando se estratificó por calificación Lauren y clasificación histológica, apareció en importancia tipo difuso y tipo GC indiferenciada. En el análisis multivariante, la LDH-A expresión en GC fue un factor de riesgo independiente para el sistema operativo de pronóstico (razón de riesgo = 1,829; IC del 95%: 1,375 a 2,433, P & lt; 0,0001). siRNA específico contra LDH-A en el crecimiento celular retardada línea celular GC tanto in vitro como en modelos de ratón. LDH-A desmontables también redujo lactato y la producción de ATP en las células de GC.
Conclusiones
Nuestro estudio indica el papel oncogénico de LDH-A en GC. LDH-A expresión es un factor de riesgo independiente de pronóstico en pacientes con cáncer gástrico y hasta reguladas expresión de LDH-A podría ser predictivo de los resultados pobres de tipo difuso y tipo GC indiferenciada. Nuestros resultados sugieren que la LDH-A podría ser una posible diana terapéutica en el cáncer gástrico
Visto:. Sun X, Z Sun, Zhu Z, H Guan, Zhang J, Zhang Y, et al. (2014) Importancia clínico-patológicos y Valor pronóstico de la lactato deshidrogenasa Una Expresión en pacientes con cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (3): e91068. doi: 10.1371 /journal.pone.0091068
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Agosto, 2013; Aceptó 7 de febrero de 2014; Publicado: 7 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de los proyectos de investigación en la provincia de Liaoning Ciencia y Tecnología Departamento (Nº 2007225017, N ° 2009225011-2 y Nº 2011415052) y los proyectos de ciencia y tecnología en la ciudad de Shenyang (núm F11-264-1-19). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las propiedades metabólicas de las células cancerosas divergen significativamente de los de las células normales, como las células cancerosas preferentemente utilizan la glucólisis en lugar de la fosforilación oxidativa mitocondrial, incluso en presencia de oxígeno; este fenómeno se conoce como el efecto Warburg [1], [2], [3]. La sorprendentemente alta tasa de tomar la glucosa y producción de lactato en los tumores en presencia de oxígeno llevó Warburg a especular que el metabolismo aberrante podría ser la causa de muchos tipos de cáncer [2]. Sin embargo, la ventaja de la transformación metabólica confiere a las células cancerosas no está claro [4], [5]. Recientemente, el descubrimiento de la conexión entre los oncogenes y los procesos metabólicos ha dado lugar a un resurgimiento del interés en el trabajo de Warburg. Cada vez hay más pruebas que indican que la adaptación de la glucólisis aeróbica por las células cancerosas podría facilitar la proliferación del cáncer [5]. metabolismo del cáncer ha estado bajo una extensa exploración en la esperanza de descubrir nuevas terapias eficaces para el cáncer.
LDH-A, es una enzima crucial que juega un papel importante en la etapa final del efecto Warburg mediante la conversión de piruvato a lactato . En varios tipos de cánceres humanos, la expresión de LDH-A fue hasta reguladas [6], [7]. En el carcinoma esofágico de células escamosas, LDH-A fue hasta reguladas en tejidos de cáncer y promovió la supervivencia de las células tumorales [8]. Además, se informó de LDH-A para mejorar el crecimiento y la migración de células de cáncer gástrico [9]. Sin embargo, el estado de la expresión y la función de la LDH-A en el cáncer gástrico (CG) todavía siguen siendo desconocidos.
En este estudio, hemos examinado la expresión de la LDH-A en una gran cohorte de muestras de GC y su correlacionado expresión con los parámetros patológicos clínicos y la supervivencia global (SG). Nuestros resultados demuestran que la expresión de LDH-A fue hasta reguladas en las muestras clínicas de cáncer gástrico, y la expresión de la proteína se correlaciona con la edad y la clasificación histológica. Además, se encontró que los niveles altos de LDH-A expresión se asocia con un peor pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. Tomados en conjunto, nuestro estudio reveló la función oncogénica de LDH-A en cáncer gástrico y sugirió LDH-A como un nuevo factor pronóstico potencial y una posible diana terapéutica.
Materiales y Métodos
Los pacientes
el presente estudio incluyó a 264 pacientes con cáncer gástrico que siguieron a la cirugía curativa entre enero de 2006 mayo de 2007 en el primer Hospital afiliado de la Universidad médica de china. El grupo estaba compuesto de 194 hombres y 70 mujeres con una edad media de 59 (rango, 29-81) años. Ninguno de los pacientes fueron sometidos a quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. La información de seguimiento se había recogido de todos los pacientes.
Declaración de Ética
La aprobación ética para este estudio se obtuvo del Comité Ético de Investigación de la Universidad de Medicina China, China. Todos los pacientes con toma de tejido tumoral, así como muestras de tejidos normales gástricas firmaron un formulario de consentimiento antes de la extirpación quirúrgica del carcinoma gástrico para permitir esta investigación a realizar. Todos los procedimientos de estudio de los animales eran de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron realizados de acuerdo con las directrices éticas institucionales. Estos animales de laboratorio se adquirieron de Shanghai rama Center, Instituto de Ciencia Animal de Laboratorio de la Academia China de Ciencias Médicas (también conocido como Shanghai CAS, número de certificado: SCXK [Hu] 2.003-0003). Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso de la Universidad de Medicina China, Shenyang, China. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Muestras de Tejido y Patología
Todos los especímenes de cáncer gástrico pacientes derivados embebidos en parafina (n = 264) y sus especímenes emparejados NNM (2 cm de distancia del carcinoma n = 209) se obtuvieron de la resección quirúrgica y está archivada bajo protocolos aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad médica de china primer hospital afiliado. carcinoma gástrico fresco y NNM adyacente se recogieron y se congelaron en -80 ° C hasta la extracción de proteína mediante homogeneización en tampón de lisis RIPA. El diagnóstico histológico y otras características microscópicas fueron confirmados por los patólogos y se evaluó la estadificación TNM para cada carcinoma gástrico de acuerdo con el sistema de la Unión Internacional Contre le Cancer (UICC) para el grado de propagación del tumor. arquitectura histológica del carcinoma gástrico se expresó en la clasificación de Lauren y la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Además, se determinaron el tamaño del tumor, profundidad de la invasión y linfático.
Líneas celulares y cultivo
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN28 (bien diferenciadas), AGS, SGC-7901 (moderadamente diferenciados ), MGC803 (pobremente diferenciado) y la normal línea celular gástrica humana GES-1 en compras desde el banco de células de la Academia china de Ciencias. Cinco líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Hyclone ciudad, Logan, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Todas las líneas celulares se encontraban en un 5% de CO
2 atmósfera húmeda a 37 ° C.
Tejido de microarrays (TMA) e inmunohistoquímica
Se identificaron áreas representativas de tumores sólidos y NNM adyacentes en las secciones de los casos seleccionados HE-manchado y un núcleo de tejido de 1,5 mm de diámetro por bloque donante se troquela y se transfiere a un bloque receptor con un máximo de 200 (10 × 20) núcleos utilizando un instrumento punzón de diámetro de 1,5 mm. Después de volver a fundir, secciones (4 micras de espesor) fueron cortadas consecutivamente desde cada bloque de microarrays de tejidos, SE tinción se realizó en TMA para la confirmación del tumor y el tejido de la mucosa. El análisis inmunohistoquímico se realizó en secciones de TMA, la recuperación de antígeno mediada Olla de presión se llevó a cabo en tampón de citrato (pH 6,0) durante 10 min. Las secciones se incubaron con 1:300 dilución de LDH-A (subunidad muscular) Conejo Monoclonal Antibody (Epitomics) durante la noche a 4 ° C, y después se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón o anti-conejo Envision System Plus-HRP (Dako Cytomation) para 30 min a temperatura ambiente. Después de enjuagar tres veces en PBS durante 10 minutos cada uno, las secciones se incubaron con DAB durante 1 min, a contratinción con hematoxilina de Mayer, deshidratadas, borran y se montaron. La omisión del anticuerpo primario se utilizó como control negativo.
análisis de transferencia Western
Proteínas concentraciones de las muestras extraídas de las muestras de tejido y líneas celulares utilizando tampón de lisis ensayo de precipitación radioinmune se determinaron usando el reactivo de Bradford ( Sigma) según las instrucciones del fabricante. proteína desnaturalizada se separó en un sulfato de dodecilo de sodio (SDS) en gel de poliacrilamida (10% de acrilamida) y se transfirió a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA), que a continuación se bloqueó en 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris (pH 7,5). Para la inmunotransferencia, la membrana se incubó durante la noche con LDH-A (subunidad músculo) Conejo anticuerpo monoclonal (1:1500) (Epitomics) a 4 ° C. A continuación, se enjuaga por TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 15 minutos. Las señales fueron detectados por un aumento de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL).
El seguimiento después de la cirugía
Los 264 pacientes que se sometieron a gastroctomy fueron sometidos a cerrar la observación clínica, incluyendo el pecho /abdomen /pelvis formación de imágenes por tomografía computarizada (TC), el valor del CEA, y las pruebas de sangre a intervalos de 2 a 3 meses y una gastroscopia anual. El seguimiento fue de acuerdo con la National Comprehensive Cancer Network (NCCN Directrices) de práctica en el cáncer gástrico. tasa de supervivencia global (OS) se define como el intervalo de la cirugía inicial hasta la muerte. La fecha de finalización del estudio de seguimiento para llevar a cabo el análisis fue de 29 de junio de 2012.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
Se valoró de forma independiente por dos investigadores que fueron cegados a los resultados del paciente. La evaluación se basa en la intensidad de la tinción. la intensidad de la tinción de la LDH-A se puntuó como 0 (negativo); 1 (débil); 2 (moderado); y 3 (fuerte). Las muestras se dividieron en dos grupos de acuerdo con sus puntuaciones: 0 y 1 son grupo de baja expresión; 2 y 3 son el grupo de alta expresión. En el caso de discrepancia en la puntuación, los portaobjetos fueron reexaminadas por ambos patólogos bajo un microscopio.
Generación de interferente pequeño (SI) de ARN de derribo líneas celulares estables
Sobre la base de la LDH -Una secuencia, shRNA fue diseñado usando siRNA Buscador de Target (Ambion): la secuencia de nucleótidos de la insertado ShLDH-A era 5'-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 '. La línea celular generada mediante la infección de células con plásmido revueltos se utilizó como control. 10 g shRNA y 25 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se mezclaron junto con 1350 l de medio RPMI-1640 (sin FBS), y después la mezcla se transfectó en MGC-803 células de cáncer gástrico. Se añadió la mezcla en un
2 cm matraz de 25-cultura que previamente se sembró con 1 × 10
6 MGC-803 células de cáncer gástrico. El medio de cultivo se reemplazó con medio completo 6 h después de la inoculación RPMI-1640 y en 28 h después de la transfección, se seleccionaron clones celulares estables durante 2 semanas con neomicina y se analizó mediante inmunotransferencia.
Extracción de ARN y cuantitativa en tiempo real Análisis RT-PCR
ARN total fue aislado de las células usando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen), y 1 g de ARN se procesó directamente a cDNA utilizando un kit de transcripción inversa (Promega, Madison, Wisconsin), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen de 20 l con 0,2 l de SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, California). Estas reacciones se realizaron por triplicado usando un BioRad iCycler (Bio-Rad). ß-actina se utilizó como control interno. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: LDH-A, 5'-CTCCTGTGCAAAATGGCAAC-3 '(hacia delante) y 5'-CCTAGAGCTCACTAGTCACAG-5' (inverso); andβ-actina, 5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 '(hacia delante) y 5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3' (hacia atrás). La especificidad de la PCR en tiempo real cuantitativa se verificó por análisis de la curva de fusión y la electroforesis en gel de agarosa.
MTT y la formación de colonias de ensayo
Para el análisis de crecimiento de las células, un número igual de células se sembraron en 48 -Bueno placas. El número total de células se midió cada día mediante el ensayo de MTT de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Applied Science). Para el análisis de la formación de colonias, el mismo número de células de control y las células de silenciamiento de la expresión de LDH-A se sembraron en placa de cultivo de 60 mm por triplicado. Las células fueron cultivadas durante 7 días, el crecimiento celular se detuvo después de 7 días en cultivo mediante la eliminación del medio y la adición de solución de cristal violeta 0,5% en 20% de metanol. Después de la tinción de 5 min, las células fijadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), fotografiado, y se disolvieron con 1% de SDS. Se contó el número de colonias en cada grupo.
tumorigenicidad Ensayo
Los MGC-803 células GC xenoinjertos fueron producidos en ratones desnudos atímicos hembra de 6 semanas de edad (Vital River Laboratories, Beijing, China) por la inyección de 5 × 10
6 células en 0,2 ml de PBS en el flanco de cada ratón (6 ratones /grupo). La formación de tumores se evaluó cada semana. El volumen del tumor se calculó según la fórmula:. V (mm
3) = a x b
2/2 (donde a es el diámetro superficial más grande y b es el diámetro superficial más pequeño)
Medición de la concentración de lactato y la producción del ATP
Después de 48 horas de incubación, lactato, y los niveles de ATP en los medios de cultivo se midieron usando kits de ensayo disponibles en el mercado (adquirido de BioVision [Mountain View, California], y Ciencias Aplicadas Roche , respectivamente). Los resultados fueron corregidos por el número final del recuento de células.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). En general las tasas de supervivencia se determinaron utilizando el estimador de Kaplan-Meier, un evento que se define como la muerte por causa relacionada con el cáncer. Se utilizó la prueba de log-rank para identificar las diferencias entre las curvas de supervivencia. En el análisis univariante, dos colas χ
2 pruebas o prueba de dos colas t se utilizaron para las comparaciones estadísticas. Y el modelo de riesgo proporcional de Cox se utilizó en el análisis univariado y multivariado, para identificar los factores importantes correlacionaron con un pronóstico. Para todos los análisis, sólo los valores de p. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
LDH-A expresión en el tejido de cáncer gástrico humano
Se calificó secciones teñidas de TMA de GC y NNM núcleos de tejido para su intensidad de tinción inmunohistoquímica citoplasmática contra la LDH-Una proteína. Las muestras legibles incluyen 264 carcinoma gástrico y 209 NNM emparejado. La típica tinción citoplásmica difusa de la proteína se puede encontrar en muchos carcinoma gástrico y los tejidos gástricos normales, como se muestra en la Figura 1, el tejido de cáncer mostró tinción citoplásmica positiva para 201 casos (76,14%), mientras que entre los 209 casos de NNM, 131 casos ( 62,68%) tenían LDH-A expresión positiva (Tabla 1). Para investigar la cantidad de expresión de LDH-A en muestras de GC, la expresión de LDH-A se examinó mediante análisis de transferencia Western en siete tumores seleccionados al azar y los tejidos normales emparejados. Sobre regulación de LDH-A se observó en muestras de GC en comparación con los tejidos normales emparejados (Fig. 2a). Estos estudios indicaron que LDH-A se upregulated significativamente en muestras cancerosas en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes (la Tabla 1. p = 0,002)
LDH-A se expresa en el citoplasma de NNM y carcinomas:. Un LDH positividad -A se observó en el citoplasma de NNM, b LDH-a se detectó en el citoplasma de carcinoma gástrico diferenciada, c y en el carcinoma gástrico mal diferenciado.
a el nivel de proteína de LDH se analizó -A en muestras de cáncer gástrico y los tejidos normales emparejados. b se determinó la expresión de la LDH-A en 4 líneas celulares de cáncer gástrico y GES-1. La LDH-A expresión en las líneas celulares GC MGC803 y AGS fue hasta reguladas en comparación con GES-1. GAPDH se utilizó como control interno.
Análisis de Expresión de la LDH-A en líneas de células gástricas
Análisis de Western Blot se realizó en líneas de células gástricas. La transferencia de Western mostró que la expresión de la LDH-A fue significativamente fuerte en MGC803 pobremente diferenciado y moderadamente diferenciado AGS; débil en moderadamente diferenciado SGC-7901 y bien diferenciado MKN28; y ausente en la línea celular humana gástrica normal GES-1 (Fig. 2b).
Las variables clinicopatológicas en 264 casos de carcinoma gástrico
Como se resume en la Tabla 2, se encontró que el aumento de expresión de LDH-A se asoció significativamente con la edad de los pacientes (p = 0,004) y el tipo histológico (p = 0,02), metástasis a los ganglios linfáticos (P = 0,043), pero no con el sexo (p = 0,072), el tamaño del tumor (p = 0,086) , profundidad de la invasión (P = 0,328), invasión linfática (p = 0,738), grado Lauren (P = 0,152) o el estadio TNM (p = 0,417).
Análisis de supervivencia
la tasa de SG a 5 años de los 264 pacientes con cáncer gástrico primario fue del 46% (122/264), con 142 muertes observadas durante el período de seguimiento. La duración media de seguimiento fue de 50 meses (rango, 9-78 meses). El análisis de supervivencia mediante la prueba de curva de supervivencia y log-rank Kaplan-Meier demostró que los pacientes con alta expresión de LDH-A en el tejido tumoral tenían una supervivencia global significativamente peor que los pacientes con tumor de bajo LDH-A de la expresión (P & lt; 0,001; Fig. 3) . Con el propósito de explorar la posible relación entre la expresión de LDH-A y el pronóstico de los diferentes tipos de GC, se evaluó la supervivencia de los pacientes en diferentes subgrupos: Cuando se realizó el análisis estadístico estratificado por calificación Lauren y clasificación histológica, la significación apareció en tipo difuso GC y GC tipo indiferenciado (P & lt; 0,001, respectivamente), pero no en intestinal (P = 0,179) o (P = 0,104) los diferenciadas. El análisis multivariante se realizó mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox para todas las variables significativas en el análisis univariado. La Tabla 3 muestra el significado: Ajustado por otras variables, los resultados del análisis multivariante mostró que la LDH-A expresión (P & lt; 0,001), invasión linfática (p = 0,046) y el grado Lauren (P = 0,001), el estadio TNM (p = 0,006), pero no la edad (p = 0,053), el tamaño del tumor (p = 0,111), la profundidad de la invasión (P = 0,598), la metástasis de los ganglios linfáticos (P = 0,089), o el tipo histológico (p = 0,674), fueron independientes de pronóstico factores de riesgo para el sistema operativo (Tabla 3).
Las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia acumulada de los pacientes con GC de acuerdo con el tejido GC LDH-a expresión (a), las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia acumulada de los pacientes con de tipo intestinal GC (b) y GC (c) estratificada por el grado de Lauren, y las curvas de Kaplan-Meier para la GC diferenciada tipo (d) y el tipo indiferenciado GC (e) se estratificó según el tipo histológico de tipo difuso.
Desmontables de LDH-a de siRNA disminuye la expresión de la LDH-a en MGC-803
de acuerdo con los resultados de Western blot y en tiempo real de RT-PCR, la expresión de la LDH -A disminuyó de manera efectiva en la LDH-a-siRNA que expresan las células MGC-803. Como se muestra en la Figura 4, la expresión de LDH-A de proteína se ensayó mediante transferencia de western era apenas detectable, y el nivel PKM2 ARNm se redujo en un 74% en el LDH-A-siRNA que expresan las células MGC-803. LDH-A expresión permaneció inalterada en ambas líneas celulares de GC y las líneas celulares que expresan un control de siRNA.
En la LDH-A-siRNA que expresan las células, la expresión de LDH-A de proteína se ensayó mediante transferencia de western era apenas detectable ( un); Se detectó significativa baja regulación de la LDH-A en el ARNm después de la infección siLDH-A (b).
Desmontables de LDH-A inhibido el crecimiento de líneas celulares GC MGC-803
Para evaluar el crecimiento de las células tumorales, se utilizó MTT y ensayos de formación de colonias. En el ensayo de MTT, silenciar la expresión de LDH-A inhibe la proliferación de células MGC-803 (Fig. 5a, b). El crecimiento de MGC-803 células que expresan LDH-A siRNA disminuyó en un 64%, después de 168 horas de incubación en comparación con la de las células de control (P & lt; 0,05). Consistentemente, silenciar la expresión de la LDH-A atenuó el crecimiento independiente de anclaje de MGC-803 células (Fig. 5c, d). LDH-A desmontables en estas células impedido la formación de colonias, lo que indica que el crecimiento dependiente de anclaje fue restaurada. Estos resultados sugieren además la función oncogénica de LDH-A en el cáncer de GC.
El crecimiento de las células que expresan ARNsi disminuyeron en un 64%, después de 168 horas de incubación en comparación con la de las células de control en el ensayo MTT (una y b, P & lt; 0,05). Silenciamiento de la expresión de LDH-A atenúa la formación de colonias de MGC-803 células (C y D). La capacidad tumorigénico in vivo de la línea celular MGC-803 se redujo significativamente por siRNA desmontables de la LDH-A (E y F, p & lt; 0,05).
desmontables de LDHA inhibió la tumorigenicidad en modelos de xenoinjerto en ratones
en este estudio, se examinó la capacidad tumorigénico de la LDH-a in vivo. La tumorigenicidad in vivo de MGC-803 células siLDH-A y control de las células se evaluó mediante inyección sc de células en ratones desnudos atímicos. En concordancia con los estudios in vitro, el silenciamiento de la expresión de LDH-A atenuado drásticamente la tumorigenicidad de las células LDH-A en el tamaño del tumor. Para todos los xenoinjertos emparejados, los tumores siLDH-A fueron significativamente más pequeños que los de los controles (Fig. 5e, f).
Desmontables de LDH-A de siRNA Reduce lactato y la producción del ATP en GC humano Líneas celulares MGC- 803
Debido LDH-a es la enzima clave para la transformación de piruvato en lactato, alteración de su expresión en células de GC debería afectar a la producción de lactato y el metabolismo energético. Para probar esta hipótesis, se comparó la producción de lactato y ATP entre desmontables células LDH-A siRNA y control de las células después de una incubación de 48 horas. Cuando LDH-A fue derribado por siRNA, la capacidad de la célula para producir lactato y el ATP se redujo drásticamente en un 61,5% y un 63,3% a las 48 horas, respectivamente (Fig. 6a, b).
Después de 48 horas de incubación, LDH-a desmontables llevaron a la reducción significativa de lactato (a) y la producción de ATP (b) en el MGC-803 células (p & lt; 0,05).
Discusión
la década de 1920, Warburg demostró por primera vez que las células cancerígenas absorben tasas más altas de glucosa que las células normales y producen energía casi a la glucólisis aeróbica para sus necesidades de energía para adaptar las limitaciones ambientales tales como la hipoxia intermitente [10], [11]. Sin embargo, este cambio metabólico no es simplemente una adaptación a un entorno hipóxico, pero es una estrategia celular activa que confiere una ventaja significativa para la proliferación y la malignidad. Ahora Vegran
et al
. [12] han informado de que el lactato puede modular directamente el fenotipo de las células endoteliales, lo que potencialmente representa un mecanismo importante por el que los tumores de control de su propio suministro de sangre a través de la morfogénesis vascular. Dado que las especies reactivas de oxígeno (ROS) son naturales subproductos de la respiración mitocondrial, se ha propuesto que la conversión de glucosa en lactato podría proteger a las células de cáncer del estrés oxidativo [13]. Recientemente, hallazgos sugieren que el restablecimiento de la fosforilación oxidativa normales en células cancerosas no sólo puede inhibir el crecimiento y la proliferación celular, sino también poner en peligro la capacidad metastásica de las células malignas [14]. Por lo tanto, la importancia de la glucólisis aeróbica constitutivamente regulados hasta hace poco ha sido reconocido en la progresión tumoral, pero los mecanismos moleculares que conducen a este fenotipo y sus contribuciones al desarrollo del cáncer no se conocen bien.
LDH-A, la enzima responsable de la transformación del piruvato en lactato, juega un papel importante en el proceso de la glucólisis. Varios estudios han informado de que la expresión de LDH-A podría ser inducida por un número de oncogenes [15]. Estos informes apoyan la idea de que LDH-A de inducción es crítico para la actividad oncogénica de estos oncogenes en células de cáncer.
La actividad oncogénica de LDH-A ha sido reportado en el carcinoma de esófago, cáncer de páncreas y células de cáncer gástrico [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang
et al
. informó de que la LDH-A reducción puede suprimir la tumorigenicidad de las células de tipo intestinal cáncer gástrico (ITGC) mediante la regulación negativa Oct4 [17]. Y zhiyu Wang
et al
. informó de que la LDH-A silenciamiento suprime la tumorigenicidad cáncer de mama a través de la inducción de estrés oxidativo mediado por apoptosis vía mitocondrial [18]. Aquí, hemos examinado, el tejido tumoral incluido en parafina y fijado en formalina de 264 pacientes para la expresión de LDH-A y reportamos la caracterización de la LDH-A expresión en GC humana, y presentar su correlación con los parámetros clínico y el pronóstico de los pacientes. En primer lugar, se encontró que la expresión de LDH-A fue elevado en las muestras de GC en comparación con los tejidos normales emparejados. Este resultado puede ser consistente con estudio previo que en varios tipos de cánceres humanos, la expresión de LDH-A se reguló hasta-[4], [5]. En el tejido tumoral, nuestro estudio mostró que la LDH-A expresión se correlaciona fuertemente con GC clínico patológica características: edad, metástasis de los ganglios linfáticos y la clasificación histológica. Por ello, proponemos que el plano regulada LDH-A expresión puede contribuir a la proliferación y el desarrollo de los GC. En segundo lugar, además se analizó el papel pronóstico de LDH-A sobre la supervivencia global de los pacientes con GC. De Kaplan-Meier análisis mostró una asociación significativa entre la LDH-A expresión y la supervivencia global de los pacientes, y los pacientes con fuerte LDH-A tinción tenido una tasa de supervivencia más baja. Cuando se realizó el análisis estadístico estratificado por grado Lauren y clasificación histológica, la significación apareció en GC tipo difuso y tipo GC indiferenciado, pero no en los intestinales o diferenciadas. siRNA específico contra LDH-A se llevó a cabo en MGC803 células y el crecimiento de células retardado tanto in vitro como en modelos de ratón. LDH-A desmontables también redujo lactato y la producción de ATP en las células de GC. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la expresión de LDH-A fue un factor independiente de pronóstico de OS, y se indica que LDH-A podría tener un papel oncogénico en el desarrollo de tumores, especialmente en GC tipo difuso o pacientes tipo GC no diferenciadas. De acuerdo con nuestro estudio, se ha informado de que la anulación de la expresión de LDH-A en células de carcinoma hepatocelular humano podría inducir la apoptosis [8], y la regulación por disminución de la LDH-A podría aumentar la producción de ROS y Ca2 + citosólico de señalización, que disminuyó la membrana mitocondrial interna potencial y condujo a la liberación de citocromo C en células de carcinoma hepatocelular.
en conjunto, nuestro estudio indica que la expresión regulada hasta de LDH-a proporciona células de cáncer gástrico con ventajas de desarrollo. Al mismo tiempo, nuestro estudio sugiere LDH-A como una diana terapéutica potencial.