Extracto
Hiperplasia benigna de próstata (HBP) y el carcinoma de próstata (CaP) están vinculados al envejecimiento y la presencia de andrógenos , lo que sugiere que los genes de andrógenos regulado desempeñan un papel importante en estas enfermedades comunes. la regulación de andrógenos de crecimiento de la próstata y el desarrollo depende de la presencia de las interacciones epitelio-estroma intacto. Además, el estroma prostático está implicada en la BPH. Esto sugiere que las líneas de células epiteliales son inadecuados para identificar los genes regulados por andrógenos que podrían contribuir a la HBP y CaP y que podría servir como potenciales biomarcadores clínicos. En este estudio, se utilizó un modelo de xenoinjerto de próstata humana para definir un perfil de genes regulados
in vivo fotos: por andrógenos, con énfasis en la identificación de biomarcadores candidatos. zona de transición benigna (TZ) de tejido de próstata humano de prostatectomías radicales se injertó en la página de cápsula sub-renal de ratones inmunodeficientes machos intactos o castrados, seguido por la eliminación o adición de los andrógenos, respectivamente. Se utilizó el análisis de microarrays de ARN a partir de estos tejidos para identificar genes que son; 1) altamente expresado en la próstata, 2) tenía significativos los cambios de expresión en respuesta a los andrógenos, y, 3) codificar proteínas extracelulares. Se seleccionaron un total de 95 genes que cumplen estos criterios para el análisis y validación de expresión en tejidos de próstata de pacientes utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Los niveles de expresión de estos genes se midieron en los ARN agrupados de tejidos de próstata humanos con mayor o menor gravedad de los cambios y de la PAC de la variación de la puntuación de Gleason patológico de HPB. Se identificaron una serie de genes regulados de andrógenos. Además, un subconjunto de estos genes se sobre-expresa en ARN de tejidos de BPH clínicos, y no se encontraron los niveles de muchos que se correlaciona con el estado de la enfermedad. Nuestros resultados demuestran la viabilidad, y algunos de los problemas, de usar un modelo de xenoinjerto de ratón para caracterizar los andrógenos regulado perfiles de expresión de tejidos de próstata humanos intactos
Visto: Amor. HD, Booton SE, Boone BE, Breyer JP , Koyama T, Revelo MP, et al. (2009) Genes Regulados de andrógenos en la próstata humana xenoinjertos en ratones: Relación con la HPB y el cáncer de próstata. PLoS ONE 4 (12): e8384. doi: 10.1371 /journal.pone.0008384
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Agosto, 2009; Aceptado: 18 Noviembre 2009; Publicado: December 21, 2009
Derechos de Autor © 2009 Love et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y renales (NIDDK) subvención MPSA Consorcio UO1-DK63587, Institutos nacionales de Salud (NIH) DK067049 subvención y los microarrays de recursos compartidos de Vanderbilt, apoyado por el Centro de cáncer Ingram Vanderbilt, P30 subvención CA68485, y el Centro de Enfermedades Digestivas de Vanderbilt, conceder P30 DK58404, y el Centro de Visión por Vanderbilt, conceder EY08126 P30. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la hiperplasia prostática benigna (HPB) es extremadamente común en hombres de edad avanzada, lo que contribuye al patrón de morbilidad conocida como síntomas del tracto urinario inferior (STUI) y resulta en costes sanitarios anuales significativas [1]. A pesar de la disponibilidad de tratamientos médicos y quirúrgicos para la HPB todavía hay falta de comprensión de los procesos implicados en el crecimiento patológico benigno de la próstata humana
in vivo
[2]. Tal información podría servir para predecir mejor qué pacientes pueden beneficiarse de la terapia médica actual o son más propensos a progresar a que requiere intervención quirúrgica, así como informar a la elección de los nuevos enfoques médicos destinados a nuevas vías.
HPB ocurre que los hombres se requiere de la edad, y andrógenos para el desarrollo de la condición [3], [4]. HPB se caracteriza patológicamente por hiperplasia glandular y estroma en la zona de transición de la próstata (TZ) [5]. El despertar del potencial inductivo embrionaria en el estroma prostático ha sido propuesto como una causa de la HBP [3], [5], [6], [7]. Esto se basa en la idea de que los resultados de crecimiento de la próstata a partir de la interacción local de factores de crecimiento entre los elementos epiteliales y estromales del órgano bajo la influencia de los andrógenos testiculares, lo que sugiere que los genes de andrógenos regulado juegan un papel importante en la enfermedad. Esta hipótesis está apoyada por la evidencia experimental considerable, en particular, a partir de modelos de recombinación de tejidos [8], [9], [10].
inflamación prostática también ha sido implicado en la patogénesis de la BPH [11], [12] , [13], [14]. La inflamación se asocia con la gravedad de la HBP, y los MTOPS (Terapia Médica de los síntomas prostáticos) estudio sugiere que el riesgo de progresión de la enfermedad y la retención urinaria aguda es mayor en los hombres con la inflamación de la próstata [13], [15]. Aumento de la inflamación de próstata también puede dar lugar a la interrupción de la estructura y arquitectura epitelial, lo que resulta en un aumento de los niveles séricos de antígeno prostático específico (PSA).
crecimiento prostático, la diferenciación y la función de adultos son dependientes de la presencia de andrógenos. Está bien establecido que el crecimiento de control de los andrógenos y la diferenciación a través de interacciones mesenquimales-epitelial. En la próstata adulta, se cree que los andrógenos a actuar a través del receptor del estroma de andrógenos (AR) para mantener una glándula crecimiento de reposo [16], [17] y a través de la AR epitelial para provocar la función secretora diferenciado del epitelio de próstata [18] . En contraste con el crecimiento normal de reposo, el crecimiento hiperplásico de epitelio glandular y estroma dentro de la zona de transición en la BPH representa cambios en el balance entre la división celular y la muerte. La HPB puede recapitular lo tanto inapropiada eventos clave en la biología del desarrollo prostática. Los genes mesenquimales y epiteliales reguladas por andrógenos que son importantes en el crecimiento anormal de la próstata en la BPH aún no se han definido completamente. Los estudios utilizando microarrays de ADNc de alto rendimiento con andrógenos estimulan líneas celulares de carcinoma son poco probable que sea relevante para el desarrollo, ya sea de próstata o hiperplasia prostática benigna. células epiteliales transformadas en cultivo tienen un fenotipo muy diferente, y el proteoma asociados, de sus
in vivo
homólogos. Además estos enfoques no permitir la detección simultánea de genes clave de células estromales o de genes que pueden ser modulados como consecuencia de interacciones cruciales epiteliales del estroma.
Estudios más biológicamente relevantes utilizando cDNA microarray análisis de los tejidos de BPH tienen ha informado. Luo, et al. analizado la expresión de 6.500 genes humanos en cáncer de próstata y tejidos de BPH de los pacientes sometidos a prostatectomía radical o resección transuretral de la próstata (RTUP) [19], [20]. Se encontró un número de genes que se upregulated consistente en BPH en comparación con la próstata normal. Entre ellos
IGF1
,
IGF2
,
TGFB3
,
BPM5
,
MMP2
,
COX2
, y
GSTM5
. Sin embargo, estos estudios utilizaron tejidos enriquecidos para células epiteliales. Como resultado, los análisis podrían haber perdido potencialmente genes cruciales expresa predominantemente en células del estroma. Estos estudios no se refirió a si alguno de los pacientes habían sido sometidos a terapia con andrógenos ablación previa. Enfoques basados en ARN extraído de tejidos también no permiten la manipulación directa de la estimulación hormonal, lo que limita la capacidad de detectar de manera más directa de genes regulados por los andrógenos, lo que podría servir como predictores de la respuesta a las terapias dirigidas a la estimulación androgénica u objetivos como novedosas para el tratamiento farmacológico alternativo en este proceso de la enfermedad de andrógenos impulsada.
en otro estudio pertinente, se analizaron los perfiles de expresión génica en las células del estroma de próstata de diferentes zonas de la próstata, la comparación de los tejidos normales y enfermos [21]. Se encontró un número de genes que se expresó diferencialmente entre la HPB y el estroma zona de transición normal (TZ) estroma. Si bien se identificaron muchos genes del estroma potencialmente importantes que pueden desempeñar un papel en la HBP, estos estudios utilizaron células estromales aisladas cultivadas
in vitro
, lo que probablemente daría lugar a alteración de los patrones de expresión génica de las que serían vistos
in vivo.
en el presente estudio hemos utilizado microarrays de ADN para examinar la expresión de los genes regulados de andrógenos en el tejido prostático benigno humana crecer como xenoinjertos en inmunodeficiencia combinada (SCID) los ratones graves [22]. Este enfoque mantiene las interacciones biológicamente pertinentes del epitelio y el estroma como ocurre
in vivo
y permite la manipulación directa de los andrógenos, ya sea por la castración o la suplementación hormonal del huésped. entonces el conjunto de datos resultante se analizó para identificar los genes altamente expresados relativamente andrógenos que fueron regulados. En un esfuerzo por identificar biomarcadores potenciales susceptibles de futuras pruebas basadas en la sangre, se hizo hincapié en los genes cuyos productos se sabe o se prevé que sea extracelular. entonces la expresión de estos genes se analizó mediante QRT-PCR con las reservas de ADNc derivadas de tejidos de pacientes con cambios mínimos, leve, moderada y grave patología HPB, o con el casquillo, para determinar si la expresión correlacionada con el estado de la enfermedad.
materiales y Métodos
Ética Declaración
de-identificados muestras de tejido de próstata humana se obtuvieron a partir del tejido de Vanderbilt Adquisición Core a través del Departamento de Patología de conformidad con los protocolos de Vanderbilt IRB. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado que se aprueba el uso de sus tejidos con fines de investigación no especificados. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Protección de los Animales y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Vanderbilt. cuidado de los animales /bienestar y la supervisión veterinaria fue proporcionada por el Vanderbilt División de Cuidado de Animales.
Análisis histopatológico y Selección de la muestra
Para determinar la gravedad de los cambios patológicos de la HBP para los casos utilizados para la extracción de ARN, TZ las zonas afectadas por la hiperplasia glandular y estroma se describen en las secciones enteras de montaje de la prostatectomía radical (PR) muestras obtenidas a través del Departamento de Patología de conformidad con los protocolos de Vanderbilt IRB. volúmenes TZ se determinaron por planimetría con una tableta gráfica digitalizada, de una manera idéntica a nuestra determinación rutinaria de volumen total del tumor en RPs [23], [24], [25]. Se ha dado preferencia a los casos con tumores de la zona periférica de pequeño volumen (PZ), de modo que cualquier ampliación general de la próstata será debido a la ampliación TZ y para reducir la probabilidad de que el metabolismo hormonal potencialmente relevantes para la HPB se vería alterada por el cáncer de próstata gran volumen [26] . HPB se clasificó de 37 casos como mínimo (min), leve, moderada o grave, en base a los siguientes criterios. Min /de control: volumen de la ZT & lt; 4,5 cm
3, en peso de la próstata & lt; 34 g, pero no los nódulos de BPH; HBP leve: volumen de la ZT 4.5-8.99 cm
3 o próstata en peso 34-44.99 g o BPH nódulos; HPB moderada: volumen de la ZT 9 a 16,99 cm
3 o de la próstata en peso 45-59.99 g de BPH y nódulos; HPB aguda: volumen de la ZT ≥17 cm
3 o en peso de próstata ≥60 g y nódulos de BPH. tejidos de cáncer de próstata se clasificaron como moderadamente diferenciados (puntuaciones de Gleason 5-6) o pobremente diferenciados (puntuaciones de Gleason 8-9). Ajustar núcleos de tejido fresco congelado obtenidos como se describe a continuación se procesaron para el ARN y la histología [27].
Sub-renal xenotrasplante de muestras frescas TZ Humana y hormonal Ablación Estrategias
identificada-De tejido de la próstata humana las muestras se obtuvieron a partir del tejido Vanderbilt Adquisición Core a través del Departamento de Patología de acuerdo con protocolos Vanderbilt IRB. núcleos de 6 mm de diámetro obtenidos durante la operación de la pieza de PR frescos fueron adquiridos desde la derecha y la izquierda TZ y PZ desde mediados de base y desde el centro hasta el ápice como se describe [27] y el análisis histológico se realizó en secciones congeladas de las secciones transversales de espesor completo. Núcleos de determinados a contener tejido TZ normal, se cortaron en piezas de aproximadamente 2-3 mm de espesor y 4-6 piezas fueron entonces xenoinjertados bajo las cápsulas renales de inmunodeficiencia combinada (SCID) los ratones graves adulto de sexo masculino [CB-17 /ratones IcrHsd-scid ( Harlan, Indianapolis, IN)]. TZ tejidos de cada uno de los seis pacientes fueron xenoinjertado en grupos de 10 ratones SCID castrados con algunos grupos de ratones que recibieron el tejido a partir de dos pacientes diferentes cuando esté disponible, injertada en los riñones contralaterales. Cinco ratones de cada grupo se les dio implantes sub-cutánea que consisten en una longitud de 2,5 cm de tubo de silastic (ID 1,98 mm x 3,18 mm OD, Dow Corning, Midland, MI) que contenía 25 mg de testosterona (PCCA, Houston, TX). Los extremos de los tubos de silastic se sellaron con silicona tipo A adhesiva médica (Dow Corning). Se añadió una pequeña cantidad de aceite de maíz antes de sellar el tubo para facilitar la disolución de la testosterona. Después de permitir que los xenoinjertos de establecer durante un mes, los implantes se retiraron de los ratones de testosterona suplementado, y gránulos de 25 mg de testosterona (producido con un Parr Pellet Press, modelo 2816 con 4,5 mm morir, Parr Instrument Company, Moline, IL) se implantaron por vía subcutánea en los ratones que no habían recibido la testosterona. Los ratones de control fueron sacrificados en el momento de la adición de andrógenos o la extracción, y los ratones restantes de cada grupo se sacrificaron a los 1, 3, 7, y 14 días después de la adición de andrógenos o la eliminación. xenoinjertos cosechadas fueron disecados rápidamente con una lupa y se congelaron en nitrógeno líquido. Los tejidos congelados fueron almacenados a -80 ° C.
Extracción de ARN y de ADNc Microarrays
extracción de ARN de los tejidos TZ y xenoinjertos cosechadas snap-congelado se realizó utilizando una modificación de los métodos descritos anteriormente [27] , [28]. Brevemente, el ARN se extrajo usando TRIzol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), seguido de un segundo aislamiento de ARN usando RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) con tratamiento de ADNasa. RNA de muestras fueron almacenadas a -80 ° C. la calidad del ARN se analizó por el Vanderbilt Microarray recurso compartido (VMSR) utilizando espectrofotometría (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y bioanálisis (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Las muestras de ARN de xenoinjertos se presentaron a la VMSR para la amplificación (Sistemas Nugen, Inc., Traverse City, MI) y el etiquetado, seguido por hibridación con microarrays impresos de la liberación humana 2.0 OligoLibrary, (Compugen, San Jose, CA), que contiene 28.830 genes únicos de un total de 29,134 oligos. El ARN de referencia se ha creado mediante la agrupación de las muestras de RNA de ambos tejidos de castración y andrógenos tratada de ratones de control día cero.
Análisis estadístico de los datos Microarray
Debido a la considerable variación inherente en pacientes individuales, el tiempo 0 para cada muestra de tejido se utilizó como el control o muestra de referencia en lugar de una muestra de referencia estándar a través de todo el experimento. Los datos se normalizaron mediante el uso de software Lowess GeneTraffic (Iobion Informática, La Hoya, CA) y se importan en GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) para su posterior análisis. Inicialmente, se consideraron puntos únicamente día 0 y día 14 de tiempo, con genes que tenían al menos una regulación por incremento de 1,5 veces en el día 14 muestra vs. día 0 seleccionado, que produjo 5.679 genes /sondas. Se utilizó un análisis ANOVA para identificar genes con diferencias significativas en la expresión, con a
P
-valor de corte de 0,05, lo que indica 284 genes de falsos positivos esperados. Después se usó una prueba t de Welch para identificar genes con diferencias significativas (
P
-valor inferior a 0,05) en la expresión entre los días 0 y 14 en todas las muestras de tejido. A continuación, esta lista se filtró por el valor de la expresión de la señal, que conserva la parte superior del 95% del rango dinámico de la señal, produciendo 784 genes /sondas. Este método de análisis se llevó a cabo de forma independiente, tanto para la castración de testosterona y complementado conjuntos de datos. Todos los análisis estadísticos de los datos de microarrays se realizaron por el VMSR
identificación de dianas de biomarcadores candidatos
posibles genes candidatos fueron seleccionados de forma sistemática con la superposición de criterios de bioinformática, empleando WebGestalt:. 1) regulada por andrógenos (1,5 -fold o
P
≤0.05 dentro de nuestros datos de microarrays), 2) expresado en niveles significativamente más altos en la próstata en relación con otros tejidos (
P
≤0.05 por hipergeométrica prueba), y 3) espacio extracelular o de la superficie celular (Genética categorías Ontogenia). Estos criterios proporcionaron un conjunto de genes que incluían biomarcadores previamente validados, incluyendo
KLK3
,
ACPP
, y
MSMB
. Varios genes adicionales conocidos o sospechosos de estar implicados en la HBP en base a estudios previos fueron "manualmente" incluida en estudio:
IGF1
,
IGF1R
,
TGFB1
,
TGFB3
,
TGFBR1
, y
TGFBR2
. Un total de 84 genes blancos (y el
18S rRNA gen de control
limpieza) fueron elegidos para la confirmación de expresión en muestras de pacientes, varios evaluó con sondas redundantes.
Tiempo Real Confirmación QRT-PCR
una baja densidad TaqMan tarjeta de matriz de microfluidos, el formato 96a (Applied Biosystems, Foster City, CA) fue diseñado para analizar los genes candidatos a partir de los genes de análisis y control de microarrays, para un total de 96 objetivos. 1 g de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc de cadena sencilla utilizando de alta capacidad de cDNA Archivo kit (Applied Biosystems). Después de la síntesis de ADNc, el ARN se degrada por hidrólisis alcalina, se ajustó a pH neutro, y cDNA purificado por adsorción a gel de sílice (kit de purificación de PCR QIAquick, Qiagen Inc.) y se eluyó en 64 l de 10 mmol /L Tris HCl (pH 8,5) . cantidades de cDNA se midieron por espectrofotometría (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies). cDNA se diluyó hasta 0,25 ng /l en 1X TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems), se carga en la tarjeta de microfluidos, se selló y se centrifugó. Tarjetas luego se sometieron a ciclos en un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT, y los datos se analizaron con el software SDS 2.1 (Applied Biosystems). Después de la normalización para el control endógeno, 18S rRNA, los niveles se expresaron en relación al calibrador conjunto de ARN de control (cambio). ARNs preparados a partir de cada categoría de tejidos de BPH se agruparon de 5-10 pacientes. ARN de control se agruparon de pacientes con ninguna expansión TZ apreciable. El análisis incluyó cuatro réplicas para las piscinas de la HBP leves y graves, así como las piscinas de cáncer de próstata moderadamente diferenciados y pobremente diferenciados, y ocho réplicas para el control y las piscinas de la HBP moderados.
tinción inmunohistoquímica
muestras de tejido de próstata humano de la parafina incrustados todo el montaje cuadras de los 43 pacientes caracterizan originalmente para la gravedad de la patología BPH y utilizados para correspondiente ARN derivado TZ se obtuvieron a partir del tejido Vanderbilt Adquisición Core a través del Departamento de patología y microarrays de tejidos fueron generados por una de los autores (MPR). Los microarrays contenían tres muestras de núcleos de 0,6 mm, dos de la ZT y uno de PZ lejos del área de cáncer implicado. La tinción de secciones de tejido se realizó utilizando un protocolo descrito previamente [29]. Secciones (5 micras) fueron cortadas y montadas en portaobjetos de vidrio cargadas. Después de la desparafinación y rehidratación, las secciones de tejido se sometieron a la recuperación de antígeno por calentamiento en un horno de microondas durante 10 minutos en el vector H-3300 solución desenmascaramiento antígeno (1:100; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Los portaobjetos se incubaron a continuación en peróxido de hidrógeno 0,3% en metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), seguido de una incubación de 1 hr en suero de cabra al 5% en PBS a RT. Las láminas fueron incubadas con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C en 5% de suero de cabra en PBS. Los anticuerpos utilizados fueron un anticuerpo monoclonal de ratón contra TIMP2 (1:300, sc-21735, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y el conejo policlonales contra FGF2 (1:500, SC-79, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y SMOC1 (1:100, Atlas Los anticuerpos, Estocolmo, Suecia). Los portaobjetos se lavaron y se incubaron en un anticuerpo secundario biotinilado (de conejo anti-ratón o anti-conejo de cerdo, 1:300, DAKO, Carpinteria, CA) a TA durante 60 min, se lavaron en PBS ampliamente, a continuación, se incubaron en ABC-HRP complejos (vector Laboratories) durante 30 min. Los anticuerpos unidos se visualizaron luego por incubación con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina líquido (DAKO). Los portaobjetos se aclararon extensivamente en agua del grifo, por contraste con hematoxilina y se montaron. secciones de tejido teñidas se fotografiaron y se procesaron utilizando un microscopio Zeiss AX10 Imager.M1 y el software AxioVision Versión 4.6.
Los immunostained diapositivas fueron revisados por un patólogo (MPR) cegado a la gravedad patología HBP del caso y los resultados se expresaron de una manera semi-cuantitativa. tinción Porcentaje se puntuó en una escala de 0 a 4, donde 0 = sin manchas, 1 = menos de 25%, 2 = 25% a 50%, 3 = 50% a 75%, y 4 = 75% a 100%. La intensidad de la tinción se puntuó en una escala de 1 a 3, donde 1 = leve, 2 = moderado y 3 = marcado. Para una muestra que no produce manchas, la puntuación de intensidad también era 0. Cuando estaba presente tanto estromal y tinción epitelial, la puntuación se hizo por separado. Para calcular el índice de expresión de la proteína, el porcentaje de puntuación se suma con la puntuación de intensidad. Las puntuaciones combinadas se trazan para cada categoría patología HPB (mínima, leve, moderada, severa cambios BPH), y las pruebas de Kruskal-Wallis se utilizaron para comparar las puntuaciones combinadas a través de diferentes estados de gravedad de la enfermedad.
Resultados
Perfiles de expresión génica regulada por andrógenos en la próstata humana Zona de Transición
perfilan los patrones de expresión de genes de xenoinjertos TZ de próstata humano, después de la adición o sustracción de testosterona. La Figura 1 ilustra el esquema general utilizado para la manipulación de los niveles de andrógenos en ratones SCID portadores de xenoinjertos de próstata cápsula sub-renal. El ARN total se preparó a partir de xenoinjertos cosechadas con o sin exposición a la testosterona durante 0, 1, 3, 7, y 14 días. Una piscina a partir de cantidades iguales de ARN a partir de día 0 de castración y xenoinjertos de ratón intactas fue utilizado como una referencia estándar. Se realizaron un total de 58 hibridaciones, que incluyó muestras de seis pacientes. El análisis inicial indica un nivel alto (hasta 10 veces) de paciente a paciente variación en los niveles de expresión en genes de andrógenos regulado conocidos como
KLK3
(PSA). Con el fin de hacer posible esta variabilidad biológica esperada entre los tejidos de pacientes individuales, las muestras de ARN derivados de tejido de cada paciente fueron re-centradas en cuando de ese paciente 0 controles. Para el análisis primario, se consideraron dos puntos de tiempo, días 0 y 14, produciendo 5.679 genes con un aumento de 1,5 veces o más en la expresión. Un análisis ANOVA se realizó en estos 5.679 genes, con un
P
-valor de corte de 0,05, que predice 284 falsos positivos. Los genes que tenían al menos un aumento de 1,5 veces o disminución de la expresión en el día 14 muestra vs. día 0 se filtraron después por el valor de la expresión de la señal, la retención de la parte superior 95% del rango dinámico de la señal, produciendo 784 genes. Los datos de microarrays se han depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus [30] y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE17862 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE17862) .
TZ tejidos de seis pacientes fueron xenoinjertado debajo de las cápsula renal de ratones SCID macho castrado (10 ratones por paciente). Cinco ratones de cada grupo se les dio implantes sub-cutánea que contienen 25 mg de testosterona. Después de permitir que los xenoinjertos para establecer durante un mes, los implantes se retiraron de los ratones de testosterona suplementado, y 25 gránulos de testosterona mg se implantaron en ratones que no habían recibido la testosterona. Los ratones de control fueron sacrificados en el momento de la adición o remoción de andrógenos, y los ratones restantes de cada grupo fueron sacrificados a las 1, 3, 7 y 14 días.
Los genes regulados por los andrógenos en Humana TZ xenoinjertos
la Tabla 1 enumera las 45 principales genes que son regulados hasta en respuesta a los andrógenos, ordenados por el cambio veces (en orden descendente). Los tres primeros genes,
KLK3 gratis (PSA),
MSMB gratis (beta-microseminoproteína), y
TMEPAI gratis (próstata transmembrana inducida por andrógenos proteína) fueron previamente bien conocida ser regulados por los andrógenos en la próstata humana [31], [32], [33]. Varios otros genes identificados como hasta reguladas en xenoinjertos TZ humanos por parte de la testosterona también han sido previamente demostrado ser regulada por andrógenos. Estos incluyen
TRPM8 gratis (miembro receptor de potencial transitorio melastatina 8), un marcador pronóstico putativo y diana terapéutica en el cáncer de próstata [34], [35],
ACPP gratis (fosfatasa ácida prostática) [36 ],
SCGB1A1 gratis (uteroglobina) [37],
NDRG1 gratis (N-myc gen abajo regulada 1) [38], y
CREB3L4
proteína de unión (cAMP elemento sensible 3-como 4) [39].
RNASEL
Se ha informado que un candidato gen hereditario del cáncer de próstata [40]. Otros genes identificados que han sido reportados como regulada por andrógenos o que participan en la BPH o cáncer de próstata incluido
PTGDS gratis (D2 sintasa de prostaglandina),
FGFBP1
,
KLK11 gratis (calicreína 11),
CXCL5 gratis (quimiocina (motivo CXC) ligando 5),
FKBP11 gratis (proteína de unión a FK506-11) y
TIMP1 gratis ( inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1).
TMEPAI gratis (proteína transmembrana inducida por andrógenos de la próstata) fue el gen regulada por andrógenos más altamente expresado identificado. , genes regulada por andrógenos adicionales altamente expresados incluyen
KLK3 gratis (PSA),
MSMB gratis (beta-microseminoproteína),
ACPP gratis (fosfatasa ácida prostática) y
SCGB1A1 gratis (uteroglobina).
los genes regulados en respuesta a andrógenos retirada
Tabla 2 se enumeran las 45 principales genes que son regulados hasta en respuesta a la retirada de andrógenos durante 14 días ordenado por el cambio veces (en orden descendente). Uno de los genes identificados,
GLI1
está regulado en la próstata del ratón después de la castración [41]. Otro gen identificado con el aumento de expresión fue
ANNAT1
(anexina 1), que se ha informado a la disminución en andrógenos estimulada por cáncer de próstata en comparación con el epitelio benigna de próstata [42].
Quantitative RT análisis-PCR de ARN humano de próstata piscinas
Para investigar más a fondo los niveles de expresión de los genes regulados de andrógenos identificados por el análisis de microarrays, se realizó análisis cuantitativo de RT-PCR en objetivos seleccionados utilizando ARN piscinas derivadas de tejidos de próstata humanos. Una importante necesidad clínica es identificar biomarcadores que proporcionan información de pronóstico en relación con progresión de la enfermedad o que pueden predecir la respuesta a los tratamientos, incluidos los inhibidores de la 5 alfa. Las proteínas secretadas que se pueden medir fácilmente en la sangre son objetivos clínicos particularmente atractivas. A partir de los perfiles de expresión génica en la hormona manipulado xenoinjertos TZ, biomarcadores potenciales se seleccionaron sistemáticamente con la superposición de criterios de bioinformática, empleando WebGestalt. objetivos de genes seleccionados fueron regulados-andrógeno 1) dentro de nuestros datos de microarrays, 2) expresado en niveles significativamente más altos en la próstata en relación con otros tejidos, y 3) conocida o predicha para expresar proteínas secretadas o de la superficie celular. Estos criterios proporcionaron un conjunto de genes candidatos (Tabla 3) que incluían algunos marcadores biológicos conocidos con anterioridad, incluyendo
KLK3
,
ACPP
, y
MSMB
, además de validar nuestro enfoque experimental . Otros genes de interés añadido "manual" para el análisis de RT-PCR fueron
IGF1
,
IGF1R
,
TGFB1
,
TGFB3
,
TGFBR1
, y
TGFBR2
. Los niveles de expresión de estos genes diana se midieron en las piscinas de ARN preparadas a partir de tejidos TZ designados como poseedores de cambios HBP leve, moderada y grave, así como moderadamente y pobremente diferenciados cáncer de próstata. ARN para cada categoría de la HPB o próstata cáncer de los tejidos se agruparon a partir de 5-10 muestras de pacientes. ARN de control se agruparon a partir de muestras de pacientes con TZ no expansión TZ apreciable de la hiperplasia glandular y estromal.
Los resultados de los análisis de QRT-PCR se muestran en la Tabla 4. Los niveles de expresión de ARN se determinaron para 86 Los genes candidatos de biomarcadores. De estos, 72 genes estaban determinados a tener un mayor que 6 veces más alto que el nivel de control normal de la piscina en al menos una de las BPH o de próstata piscinas cáncer. En relación con el conjunto de ARN de control de próstata, los niveles medios de las BPH o de próstata ARN piscinas cáncer con los niveles de expresión & lt; 1 veces se designan como "baja", de 1 a 6 veces fueron designados como "moderado", y & gt; 6 veces fueron designados como "alta". Sobre la base de estos criterios, cada gen fue asignado a una de las seis categorías (Tabla 4). Quince genes fueron altas en ambos BPH y cáncer de próstata, 41 genes fueron altas en BPH y moderada en el cáncer de próstata, dos genes fueron altas en BPH y baja en el cáncer de próstata, y cinco genes fueron moderados en la BPH y alta en el cáncer de próstata. No se encontraron genes que estaban clasificadas como de "bajo" en la BPH.
Los genes candidatos HPB biomarcadores
Una serie de genes tenían niveles de expresión en las piscinas de la HBP que el aumento de la gravedad de la enfermedad . Algunos de los genes tenían niveles de expresión que fueron elevados en particular en BPH, pero relativamente baja en las piscinas de cáncer de próstata. Sería de esperar que estos genes para tener el mejor potencial como biomarcadores candidato BPH, incluyendo especificidad en comparación con el carcinoma de próstata. Los expresados extracelularmente y con un nivel medio de expresión por lo menos tres veces mayor en las piscinas de ARN HBP que en el ARN del cáncer de próstata incluyen piscinas:
CDH13
,
CHRNB1
,
COL4A5
,
EFEMP2
,
EMP3
,
F10 gratis (16 veces),
FGF2
,
FGFBP1 gratis (10 veces ),
IGF1
,
IGF2 gratis (18 veces),
LIPG
,
RARB
,
ASGC
,
SGCD
,
TGFB1
,
TGFB3 gratis (14 veces),
TGFBR2
y
TIMP2 Red de la "alta en la BPH, moderada en grupo de cáncer de próstata ";
SMOC1 gratis (26 veces) en el "alto contenido de HPB, baja en el cáncer de próstata" grupo; y
SCGB3A1 gratis (15 veces) y
SCGB1A1 gratis (14 veces) en el "moderado en la HPB, la baja en el cáncer de próstata" grupo.
tinción inmunohistoquímica para ciertos los objetivos de genes en Patología-Caracterizado BPH tejidos
para determinar si las diferencias en los niveles de expresión de ARN observados en los tejidos de HPB también estuvieron presentes en el nivel de proteínas y para caracterizar mejor el epiteliales y /o estromal de localización del potencial aumento de la expresión , se realizó inmunohistoquímica (IHC) en un microarray de tejido BPH (TMA). La matriz contenía 129 secciones de tejido de 43 pacientes únicos, que contiene los tejidos de BPH con patologías que van desde mínima a severa tal como se define en Materiales y Métodos.