Extracto
Anteriormente, se informó de que cancerosa inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (CIP2A) media la apoptosis efecto de bortezomib en el carcinoma hepatocelular (HCC). Aquí, se presenta un mecanismo independiente del proteasoma bortezomib por el cual induce la autofagia en el CHC. Nuestros datos indican que bortezomib autofagia activa en una dosis-y tiempo- manera dependiente en líneas celulares de HCC, incluyendo Huh-7, Sk-HEP1, y Hep3B. Bortezomib downregulated CIP2A, fosfo-Akt (P-Akt) y fosfo-4EBP1 (P-4EBP1) en una dosis y tiempo dependiente en todas las células de HCC probadas. La expresión ectópica de CIP2A abolió el efecto de bortezomib en la autofagia. Co-tratamiento de bortezomib y Calyculin, un inhibidor de PP2A, reduce el efecto de bortezomib en la P-Akt, P-4EBP1, y la autofagia. El aumento de la fosforilación de Akt, ya sea o 4EBP1 por las células protegidas sobreexpresión ectópica de autofagia bortezomib inducida. Además, se analizó el efecto de ΔBtz, un derivado de bortezomib que se parece mucho a bortezomib estructuralmente pero no tiene actividad del proteasoma, en el CHC. Curiosamente, ΔBtz demostró efectos similares a bortezomib en la autofagia, CIP2A, P-Akt y P-4EBP1, lo que sugiere que el efecto de bortezomib en la autofagia es independiente de la inhibición del proteasoma. Por otra parte, nuestros
in vivo
datos mostraron que tanto bortezomib y ΔBtz inhibió el crecimiento del tumor, regulados a la baja CIP2A, P-Akt y la autofagia inducida en Huh-7 tumores. En conclusión, bortezomib induce la autofagia en HCC través de una vía CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1
Visto:. Yu H-C, Hou D-R, Liu C-Y, Lin C-S, Shiau C-W, Cheng A-L, et al. (2013) canceroso inhibidor de la proteína fosfatasa 2A media la Bortezomib inducida por la autofagia en el carcinoma hepatocelular Independiente del proteasoma. PLoS ONE 8 (2): e55705. doi: 10.1371 /journal.pone.0055705
Editor: Peter Starkel, Hospital de la Universidad de St. Luc, Bélgica
Recibido: 25 Octubre, 2012; Aceptado: December 28, 2012; Publicado: 1 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio con el apoyo de las subvenciones, NTUH 101P01 (KFC) del hospital de la Universidad Nacional de Taiwán; NSC99-2314-B-002-017-MY2 (KFC), y NSC100-2325-B-002-036 (KFC) del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto tumor sólido más común en todo el mundo [1]. Avanzada HCC se caracteriza por la resistencia frecuente a los agentes quimioterapéuticos convencionales y radiación. Por tanto, existe una clara necesidad de desarrollar nuevos objetivos y estrategias terapéuticas para el tratamiento de HCC. Recientemente, la vía de la autofagia ha emergido como una nueva diana prometedora en el tratamiento del cáncer. La autofagia se conoce como un mecanismo homeostático para mantener la integridad celular y es un proceso catabólico que implica la degradación de componentes citoplasmáticos a través de la maquinaria lisosomal [2]. La autofagia desempeña múltiples funciones en el cáncer: puede promover la muerte de células de cáncer o la supervivencia en función de las complejas interacciones entre el estrés metabólico, las vías de apoptosis y la autofagia [3], [4], [5]; y la perturbación de la autofagia también puede contribuir a la tumorigénesis [3], [6]. Una mejor comprensión de la regulación de la autofagia puede facilitar el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas potenciales en el CHC.
El bortezomib es el primer inhibidor de proteasoma boronato en su clase dipéptido designado específicamente para apuntar el proteosoma 26S [7], [8]. Bortezomib ha sido aprobado para el tratamiento de mieloma múltiple y linfoma de células del manto no Hodgkin (NHL) y está bajo investigación clínica para su uso en otros tipos de cáncer [9], [10]. Además de sus efectos sobre la inducción de la apoptosis, la inhibición del ciclo celular (fase de la detención G2-M) y muchos otros mecanismos celulares asociados con la inhibición del proteasoma [10], [11], [12], bortezomib Recientemente se ha demostrado que induce la autofagia en hipóxica HeLa células de carcinoma de cuello uterino en respuesta a retículo activado endoplasmático (ER) [13], en células de cáncer de próstata humano a través del MIM-2α fosforilación [14], y en las células de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas humanos en asociación con JNK proteasoma dependiente activación y Bcl-2 fosforilación [15]. Aunque estos estudios sugieren comúnmente autofagia inducida por bortezomib se correlaciona con la inhibición del proteasoma [13], [14], [15], el mecanismo exacto de la autofagia inducida por bortezomib no se entiende completamente.
Es bien conocido que mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) es un regulador clave del crecimiento celular y la autofagia [16]. Además, complejo activado mTOR 1 (mTORC1), uno de los dos componentes principales de mTOR, activa S6K y fosforila 4EBP-1 (liberando de este modo 4EBP-1 de eIF4E) la promoción de la traducción del ARNm [17]. Además, mTORC1 interactúa directamente con e inhibe el complejo ULK1, un componente esencial en la iniciación de la autofagia [18]. La mediación de la señalización del factor de crecimiento por mTOR es principalmente en respuesta a la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt vía [19]. Akt tiene un papel crucial en la supervivencia de células de cáncer y la regulación de la apoptosis, y estudios recientes han demostrado que la inhibición de Akt también promueve la autofagia [20], [21], [22]. En HCC, la vía de Akt se ha demostrado para ser activado de forma constitutiva y correlacionada con un peor pronóstico [23]. Nuestro estudio anterior demostró también que la regulación por disminución de p-Akt es un determinante importante molecular de la apoptosis inducida por bortezomib en células de HCC [24]. Es de destacar que la regulación negativa de la señalización de Akt se puede lograr mediante fosfatasas, tales como fosfatasa y tensina suprimido homólogo en el cromosoma diez (PTEN) y la proteína fosfatasa 2A (PP2A). PTEN es una fosfatasa dual de proteína /lípido que contrarresta PI3K señalización /Akt por dephosphorylating fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) en la posición 3 [20]. Por el contrario, PP2A es una proteína fosfatasa serina /treonina que puede directamente dephosphorylate p-Akt y p-ERK [25]. PP2A se compone de C subunidad catalítica (PP2Ac), andamios subunidad A (PR65) y subunidades B de regulación [26]. PP2A se ha sugerido que es un supresor de tumor [27]. Por ejemplo, el aumento de la actividad de PP2A puede inducir la apoptosis a través de la inactivación de Bcl-2 o la activación de Bad [28]. PP2A también regula el ciclo celular, la supervivencia y la proliferación celular ya sea por inhibición directa o indirectamente cdc2, MAPK y Akt quinasas [28]. Nuestros datos recientes también indican que el bortezomib aumenta la actividad de PP2A regulación negativa de esta manera p-Akt y la inducción de apoptosis en células de HCC [29]. Por otra parte, varios inhibidores celulares de PP2A, como SET [30] y CIP2A se han identificado [31]. CIP2A ha surgido como una novela oncoproteína y un número creciente de informes muestran que se sobreexpresa en muchos tumores malignos humanos, incluyendo HCC [32], [33], [34], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39]. CIP2A se ha demostrado para estabilizar c-Myc oncoproteína mediante la inhibición de la actividad de PP2A hacia c-Myc, promoviendo así el crecimiento celular independiente de anclaje y
vivo
formación de tumores en [31]. Recientemente, hemos demostrado, además, que CIP2A, a través de la inhibición de la inactivación de p-Akt PP2A-dependiente, media la apoptosis efecto de bortezomib en células de HCC [40].
En este estudio, se presenta un mecanismo independiente por proteasoma bortezomib, que induce la autofagia en el CHC. Nuestro presente trabajo sugiere que el bortezomib induce la autofagia en el CHC a través de una vía de 4EBP1 CIP2A-PP2A-Akt.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
El bortezomib (Velcade) fue proporcionado amablemente por Millennium Pharmaceuticals. Para
in vitro
estudios, el bortezomib a diversas concentraciones se disolvió en DMSO y después se añadió a las células en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 5% de suero bovino fetal (FBS). La concentración final de DMSO fue 0,1% después de la adición al medio. Calyculin y 3-metiladenina (3-MA) fueron adquiridos de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Los anticuerpos para inmunotransferencia tales como anti-Akt1, se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (San Diego, CA). Otros anticuerpos tales como anti-LC3, -P-Akt (Ser473), -4EBP1, -P-4EBP1, -P-mTOR, -mTOR, -P-S6K, -S6K, anti-S6, S6--P, - NF-kB, -IκB-α, -ATG3, -ATG5, -ATG7, y -Beclin 1 eran de Señalización celular (Danvers, MA).
cultivo de células y Western blot
las líneas celulares SK-HEP1 y Hep 3B se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). La línea celular HCC Huh-7 se obtuvo de la investigación de la ciencia Banco de Recursos de Salud (Osaka, Japón; JCRB0403). Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml, penicilina G, 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina, y 25 mg /ml de anfotericina B en un incubador humidificado 37 ° y una atmósfera de 5% de CO
2 en el aire. Se realizó un análisis de transferencia de Western como se informó anteriormente
Análisis de autofagia
autofagia inducida por fármacos se evaluó mediante varios ensayos que incluyen:. (1) Western blot de la proteína 1 de la cadena ligera asociada a los microtúbulos 3 ( LC3-II) como se describe anteriormente; (2) La inmunofluorescencia de LC3-II. Brevemente, las células Huh7 se sembraron en una placa de 6 cm. Después de ser lavado con PBS, las células fueron tratadas con 800 nM bortezomib durante 16 horas, y se fijaron con helado de 4% de paraformaldehído. Las células fijadas fueron incubadas posteriormente con el anticuerpo de conejo primario anti-LC3II (1:200,#3868, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), en solución de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente y se después se tiñeron con IgG anti-conejo (H + L), F (ab ') 2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugado,#4412, Cell Signaling) y DAPI. Las células se examinan bajo un microscopio de fluorescencia LEICA DM2500; (3) La citometría de flujo análisis de LC3-II. Brevemente, Huh7 y Hep3B se sembraron en una placa de 6 cm. Después de ser lavado con PBS, las células fueron tratadas con 800 nM bortezomib durante 16 y 24 horas, se fijaron con helado de 4% de paraformaldehído, y luego tratados con helado de 100% de metanol. Las células fijadas fueron incubadas posteriormente con el anticuerpo de conejo primario anti-LC3II (1:100,#3868, Cell Signaling) en solución de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego teñidas con anti IgG de conejo (H + L), F (ab ') 2 Fragmento (Alexa Fluor ® 488 Conjugado,#4412).
Inmunofluorescencia de LC3-GFP y acridina naranja
células Huh7, que se cultiva en cubreobjetos, se transfectaron con el plásmido EGFP-LC3, seguido de 400 nM tratamiento bortezomib durante 24 horas. Después, las células se lavaron rápidamente con PBS y se fijaron a temperatura ambiente durante 15 minutos con paraformaldehído al 4%. Después de ser lavado con PBS dos veces, las células se bloquearon con 1% de albúmina de suero bovino en TTBS y luego montadas. Se observó que la distribución subcelular de EGFP-LC3 bajo un microscopio de fluorescencia (Leica DM2500). Para la tinción con naranja de acridina, las células SK HEP1 se sembraron en una placa de 6 cm. Después de ser lavado con PBS, las células fueron tratadas con 800 nM bortezomib durante 16 horas, se fijaron con helado de 4% de paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego teñidas con naranja de acridina (5 mg /ml) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se examinan bajo un microscopio de fluorescencia LEICA DM2500
células de HCC con CIP2A constitutivamente activa
CIP2A ADNc (KIAA1524) se adquirió de Origene (RC219918; Rockville, MD).. En pocas palabras, después de la transfección, las células se incubaron en presencia de G418 (0,78 mg /ml). Después de 8 semanas de selección, las colonias supervivientes, es decir, las derivadas de células transfectadas de forma estable, se seleccionaron e individualmente amplificado. HCC células con expresión estable de CIP2A-myc fueron tratados con medicamentos, se recogieron y procesaron para análisis de transferencia Western.
xenoinjerto el crecimiento del tumor
Varón NCr ratones desnudos atímicos (5-7 semanas de edad) se obtuvieron del Laboratorio Nacional Center Animal (Taipei, Taiwan). Los animales fueron alojados en grupos y se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Se les dio acceso a los alimentos y el agua esterilizada
ad libitum
. Todos los procedimientos experimentales que utilizan estos ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad Nacional de Taiwán (Permiso Número: 20080205) Laboratorio Institucional. Cada ratón se inoculó s.c. en el flanco dorsal con 1 × 10
6 Huh-7 células suspendidas en 0,1 ml de medio libre de suero que contiene 50% de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Cuando los tumores alcanzaron 200 a 300 mm
3, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de bortezomib (1 mg /kg de peso corporal) o ΔBtz (1 mg /kg de peso corporal) dos veces por semana durante la duración del tratamiento. Los controles recibieron vehículo.
son reportados El análisis estadístico
El crecimiento del tumor puntos de datos como volumen tumoral media ± SE. Las comparaciones de los valores medios se realizaron con las muestras independientes
t
prueba en SPSS para Windows 11.5 (SPSS, Inc., Chicago, IL).
Resultados
induce Bortezomib autofagia en el CHC
Para investigar el efecto de bortezomib en la autofagia en el CHC, lo primero que examinó la expresión de la proteína asociada a los microtúbulos 1 luz de la cadena 3 (LC3-II), un conjugado LC3-fosfatidiletanolamina, es decir un sello distintivo de la autofagia. Como se muestra en la Fig. 1A, bortezomib inducida autofagia de una manera dependiente de la concentración a partir de una concentración de 200 nM en Huh-7, células SK-HEP1 y Hep 3B, como se evidencia por el aumento de LC3-II. Además, se realizó un análisis en función del tiempo de la autofagia inducida por bortezomib. Nuestros datos muestran que bortezomib upregulated la expresión de LC3-II de una manera dependiente del tiempo (Fig. 1B). A continuación, se detectó la expresión de LC3-II mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 1C
izquierdo, bortezomib aumentó los niveles de LC3-II significativamente después del tratamiento con bortezomib de 24 horas. Por otra parte, la autofagia inducida por bortezomib también fue confirmada por LC3-II tinción de inmunofluorescencia (Fig. 1C
derecha). El efecto estimulador de bortezomib en la autofagia se confirmó por un aumento en los puntos GFP-LC3 en las células tratadas con el fármaco, como se examinó mediante ensayo de GFP-LC3 (Fig. 1D
top
), y también por una aumento de la tinción con naranja de acridina para orgánulos vesiculares ácidos (Fig. 1D
parte inferior). Estos datos indican que el bortezomib se activa de manera significativa la autofagia en el CHC.
A, efectos dependientes de la dosis de bortezomib autofagia inducida. células de HCC fueron tratados con bortezomib a las concentraciones indicadas durante 24 horas. Los lisados celulares se prepararon para inmunotransferencia de la proteína 1 de la cadena ligera asociada a los microtúbulos 3 (LC3). B, los efectos dependientes del tiempo de la autofagia inducida por bortezomib. Las células se expusieron al bortezomib a las concentraciones indicadas durante 24 o 48 horas. C, efectos de bortezomib en LC3-II.
Izquierda, España análisis de tinción LC3-II por citometría de flujo. Las células se trataron con bortezomib a 800 nM durante 16 ó 24 horas.
Derecho, España análisis de inmunofluorescencia LC3-II. células Hep 3B se trataron con bortezomib a 800 nM durante 24 horas. D,
top, España LC3-GFP tinción.
Inferior,
tinción con naranja de acridina.
La inhibición de la vía de señalización Akt-CIP2A-4EBP1 se asocia con la autofagia inducida por bortezomib en el CHC
Nuestro trabajo previo que identificó inhibición de la CIP2A es el principal determinante de la apoptosis inducida por bortezomib en células de HCC. Para explorar más a fondo el mecanismo por el cual la autofagia inducida por bortezomib en el CHC, el próximo examinó si CIP2A juega un papel en la autofagia inducida por bortezomib en el CHC. Como se muestra en la Fig. 2A y B, bortezomib downregulated los niveles de proteína de CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 y la autofagia inducida en todas las líneas celulares de HCC, incluyendo Huh-7, Sk-HEP1 y Hep3B, de una manera dependiente de la concentración y tiempo-. Por otra parte, el bortezomib no alteró significativamente los niveles de expresión de otras proteínas relacionadas con la autofagia incluyendo ATG7, ATG5, Beclin 1, ATG3, P-S6K, y S6K (Fig. 2C). Estos resultados sugieren que la inhibición de CIP2A-Akt-4EBP1 se asocia con la autofagia bortezomib inducida en células de HCC.
A, el análisis dependiente de la dosis de CIP2A, Akt y 4EBP1 en células de HCC. Las células se expusieron al bortezomib a las concentraciones indicadas durante 24 horas. B, el análisis dependiente del tiempo de CIP2A, Akt y 4EBP1 en células de HCC. Las células se expusieron al bortezomib a las concentraciones indicadas durante 24 o 48 horas. C, el análisis dependiente de la dosis de las proteínas relacionadas con la autofagia. Las células fueron expuestas al bortezomib a las concentraciones indicadas durante 24 horas.
validación de dianas de CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1
Para validar el papel de CIP2A en la mediación del efecto de bortezomib en la autofagia en el CHC, overexpressed CIP2A en el CHC. Se encontró que la expresión ectópica de CIP2A células de la autofagia bortezomib inducida protegida en células Hep 3B Huh-7 y, lo que indica que CIP2A juega un papel clave en la mediación del efecto autophagic de bortezomib en células de HCC (Fig. 3A). Además, la adición de Calyculin, un inhibidor de PP2A, reducción del efecto de bortezomib en CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 y la autofagia en Huh-7 (Fig. 3B
la izquierda). sobreexpresión de Akt1 abolió bortezomib autofagia inducida significativamente (Fig. 3B
medio). La expresión ectópica de 4EBP1 también redujo el efecto de bortezomib en la autofagia en Huh-7. Estos datos indican que la vía de señalización CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 juega un papel clave en la mediación de efecto de bortezomib en la autofagia en HCC. Además, se examinó el efecto de una combinación de bortezomib y rapamicina, un inhibidor de mTOR, en la autofagia. Nuestros datos muestran co-tratamiento con rapamicina y bortezomib aumento de la autofagia significativamente (Fig. 3C
la izquierda). Por otra parte, 3-MA, un inhibidor de la autofagia, invirtió el efecto de la autofagia de bortezomib en células Huh-7 (Fig. 3C
derecha). En particular, hemos realizado todos los experimentos anteriormente (Figura 3) en cada uno de las líneas celulares de HCC y hemos encontrado que no había ninguna diferencia significativa entre estas líneas celulares en relación con el efecto de bortezomib en los objetivos validados. Sólo algunos de los datos representativos se han mostrado aquí.
A, la expresión ectópica de CIP2A-myc suprime efectos de bortezomib en la autofagia en células Hep 3B Huh-7 y. Las células fueron transfectadas con CIP2A-myc y se seleccionaron durante 8 semanas por G-418. Análisis de la autofagia se realizó por transferencia de Western (WB), después las células se expusieron secuencialmente a DMSO o bortezomib (200 nM o 400 nM o 800 nM) durante 24 horas. B,
izquierdo, España co-tratamiento con Calyculin, un inhibidor de PP2A, revierte el efecto de bortezomib en CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 y la autofagia. Las células se trataron con caliculina A (1 mM) o bortezomib (800 nM) durante 24 horas.
Oriente, la expresión ectópica de
Akt1 reduce los efectos de bortezomib en la autofagia en las células Huh-7.
Derecho,
expresión ectópica de 4EBP1 reduce los efectos de bortezomib en la autofagia en las células Huh-7. C,
izquierdo, España co-tratamiento con rapamicina, un inhibidor de mTOR, mejorado la autofagia inducida por bortezomib en células Huh-7. Las células fueron tratadas con rapamicina (100 nM) y /o bortezomib (400 nM) durante 24 horas.
Derecho, España Co-tratamiento con el inhibidor de la autofagia 3-metiladenina (3-MA) redujo la autofagia inducida por bortezomib. células Huh7 fueron tratados con bortezomib (800 nM) y /o 3-MA (1 mM) durante 16 horas.
El efecto de bortezomib en la autofagia y CIP2A es independiente de la proteasoma
para examinar si el efecto de bortezomib en la autofagia y CIP2A está relacionada con su actividad de inhibición del proteasoma, se sintetizó un derivado de bortezomib (ΔBtz), que es similar al bortezomib estructuralmente excepto que carece de un grupo funcional de ácido borónico, un contribuyente fundamental para la actividad del proteasoma (Fig. 4A
la izquierda). En comparación con bortezomib, ΔBtz tuvo poco efecto sobre la inhibición del proteosoma (Fig. 4A
medio) o en la inhibición de NF-kB (Fig. 4A
derecha). NF-kB es un objetivo inhibidor del proteasoma conocida. Curiosamente, ΔBtz mostró efectos significativos sobre CIP2A, P-Akt, y P-4EBP1 de una manera concentración-dependiente del tiempo y en el CHC similares a bortezomib (figura 4B
dejado Hotel & amp;.
medio
). Co-tratamiento con el inhibidor de la autofagia 3-MA reduce el efecto de la autofagia ΔBtz (Fig. 4B
derecha). ΔBtz aumentó la expresión de LC3-II (Fig. 4C
la izquierda), y también aumentó la tinción con naranja de acridina para orgánulos vesiculares ácidos (Fig. 4C
media). El uso de una técnica de microscopía electrónica, se mostró que el número de vacuolas autofágicas ser aumentado notablemente en las células Sk-HEP1 tratados con bortezomib 800 nM o ΔBtz, pero no en el control (Fig. 4C
derecho
). Por otra parte, hemos examinado los efectos de otros inhibidores del proteasoma MG132 y lactacistina, en la autofagia y CIP2A. Nuestros datos muestran que ni MG132 ni lactacystin tuvieron efectos significativos sobre la autofagia o CIP2A (Fig. 4D
la izquierda). Sin embargo, como era de esperar, estos dos inhibidores del proteasoma exhiben una actividad significativa inhibición del proteosoma (Fig. 4D
derecha). Estos datos indican que el efecto de bortezomib en la autofagia es independiente del proteasoma.
A,
izquierda, España estructuras químicas de bortezomib y ΔBtz.
Medio de búsqueda efectos de bortezomib y ΔBtz en la inhibición del proteasoma.
Derecho,
efectos de bortezomib y ΔBtz de NF-kB. B,
izquierdo,
efectos dependientes de la dosis de ΔBtz en CIP2A, Akt y LC-3.
Medio de búsqueda efectos dependientes del tiempo de ΔBtz en CIP2A, Akt y LC-3.
Derecho, España Co-tratamiento con el inhibidor de la autofagia 3-MA reduce la autofagia inducida por ΔBtz. C,
la izquierda, efectos de ΔBtz en LC3-II inmunofluorescencia.
Medio
, efectos de ΔBtz de tinción con naranja de acridina.
Las células fueron cosechadas Derecha, España SK-HEP1 tratados con bortezomib (800 nm) o ΔBtz (800 nM) o vehículo, fijado e incluido en la resina de espuela. Setenta nanómetros secciones delgadas fueron cortadas y se examinaron en 120 Kv con un microscopio electrónico de transmisión JEM-1400. Las flechas indican vacuolas autofágicas. D, a otros inhibidores del proteasoma no induce la autofagia en el CHC.
izquierda, efectos de MG-132 y lactacistina en CIP2A y LC-3.
Derecho
, efectos de bortezomib, MG-132 y lactacistina en la inhibición del proteasoma.
Efecto de bortezomib y ΔBtz en xenoinjertos de tumores HCC
Para confirmar si el efecto de bortezomib en la autofagia tiene implicaciones clínicas potencialmente relevantes, se evaluó la
in vivo
efecto de bortezomib en xenoinjertos de tumores de HCC. los ratones portadores de tumores se trataron con vehículo o bortezomib o ΔBtz. Ambos fármacos se inyectaron por vía intraperitoneal a 1,0 mg /kg dos veces a la semana durante 2 semanas. Todos los animales toleraron el tratamientos bien sin signos observables de toxicidad y tenía pesos corporales estables durante todo el curso del estudio. Sin alteraciones patológicas brutos se observaron en la necropsia. Nuestros datos indican que el bortezomib y ΔBtz mostraron efectos similares sobre Huh-7 el crecimiento del tumor. El tamaño del tumor se redujo significativamente después de dos semanas de tratamiento. Para correlacionar la respuesta biológica con el mecanismo de acción identificados
in vitro
, se examinó el efecto de bortezomib en la autofagia en los tumores de HCC. Como se muestra en la Fig. 5B y 5C, el tratamiento de ΔBtz disminuyeron los niveles de proteína de CIP2A y P-Akt y LC3 significativamente inducida en células Huh-7 similares a bortezomib. Estos datos muestran que ΔBtz tuvo efectos antitumorales significativos
in vivo
y, sobre todo, sugieren que el bortezomib induce la autofagia en el CHC a través de un mecanismo independiente del proteasoma
.
A, curvas de crecimiento tumoral de Eh -7. Puntos, media (n = 6); bares, SE. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01. B, análisis de transferencia Western de CIP2A, P-Akt, Akt1 y LC-3 en Huh-7 tumores. C, inmunotransferencias fueron escaneados por un sistema de imagen UVP BioSpectrum AC y se cuantificó usando software VisionWork LS para determinar la relación entre el nivel de CIP2A a la actina.
Columnas
, media;
bares, SD (n = 3, *
P Hotel & lt; 0,05). D, resumen del modo de acción de bortezomib.
Discusión
Este estudio revela un nuevo mecanismo por el cual el bortezomib induce la autofagia en las células de HCC (es decir, la CIP2A-PP2A-Akt -4EBP1 vía), y aumenta la comprensión de proteínas oncogénicas tales como la Ras, Akt y ERK que regulan la autofagia [6], [41]. Curiosamente, mediante el uso de la ΔBtz compuesto que se asemeja mucho a bortezomib en su estructura química, pero carece de la capacidad inhibitoria significativa proteasoma, hemos demostrado que esta regulación CIP2A dependiente de la autofagia inducida por bortezomib no depende necesariamente de la inhibición del proteasoma. Bortezomib se presume para inhibir la partícula de núcleo del proteasoma 20S por la formación de un ácido borónico tetraédrico intermedio estable con el residuo de treonina N-terminal de los activos beta subunidades de la partícula de núcleo 20S [7]. Basándose en la importancia de la función ácido borónico en el bloqueo de la proteasoma, reemplazamos bortezomib con ΔBtz que difiere de bortezomib en su grupo boronato (Figura 4A). ΔBtz de hecho mostró poca inhibición del proteasoma, pero no obstante suscitó la autofagia CIP2A dependiente de una manera similar a bortezomib (Figura 4). Esta inhibición del proteasoma CIP2A-independiente y la autofagia mediada por el bortezomib fue apoyado además por el hallazgo de que otros inhibidores del proteasoma (MG132 y lactacistina), no afectó significativamente la autofagia y CIP2A (Fig. 4D
la izquierda) a pesar de mostrar proteasoma significativa actividad de inhibición (Fig. 4D
derecha). Estos datos indican claramente que el efecto de bortezomib en la autofagia puede ser independiente de la inhibición del proteasoma. En particular, la respuesta de cada línea celular a la inducción de LC3-I /LC3II por bortezomib fue diferente (Fig. 1A) y no era idéntico a los cambios de acuerdo en CIP2A y P-Akt (Fig. 2A). Una posible explicación es que estas diferencias pueden estar asociados con fondos genéticos distintos entre las líneas celulares. Sin embargo, todavía es posible que nuevos objetivos o vías (excepto vía CIP2A /Akt) también podrían desempeñar un papel en la mediación del efecto de bortezomib en la autofagia.
El proteasoma y las vías de autofagia-lisosoma se consideran el dos rutas principales para el despacho eucariota intracelular de proteínas y su vinculación e interacciones han sido los últimos temas de interés [42], [43], [44]. Se considera que estos dos sistemas de degradación celular están funcionalmente acoplados y represión del proteasoma se activa a través de la autofagia inducida por el estrés ER [43], [45]. En este contexto, la activación de las funciones de la autofagia para compensar la degradación alterada de la proteína ubiquitinada inducida por los inhibidores del proteasoma y alivia el estrés ER [14], [45]. En consecuencia, la autofagia puede proteger las células de la toxicidad de los inhibidores del proteasoma. Por otro lado, la inhibición de la autofagia puede comprometer la degradación de sustratos de la ruta de ubiquitina-proteasoma [46]. La evidencia ha demostrado que una combinación de inhibidores de la autofagia y los inhibidores del proteasoma promover la muerte celular a través de tanto la apoptosis y necrosis [14]. Con nuestro modelo de HCC, hemos demostrado que bortezomib inducida autofagia través de un mecanismo independiente proteasoma. Anteriormente se confirmó que bortezomib puede inducir la apoptosis a través de un mecanismo de CIP2A-PP2A-p-Akt, que también se disocia de la inhibición del proteasoma bortezomib por [40]. Hemos demostrado que la autofagia inducida bortezomib en líneas celulares de HCC (es decir, Sk-HEP1, Hep3B y Huh-7) que también son sensibles a la apoptosis inducida por bortezomib. Utilizando el modelo de HCC es evidente que a través de la inhibición de la bortezomib CIP2A provoca tanto la apoptosis y la autofagia, ambos de los cuales son independientes de la inhibición del proteasoma. Por otra parte, la evidencia de que CIP2A juega un papel importante en la mediación de la apoptosis inducida por bortezomib y la autofagia en las células de HCC sugiere que CIP2A puede ser una diana terapéutica potencial nuevo en el CHC y que los compuestos /fármacos que actúan como inhibidores CIP2A pueden tener un potencial terapéutico en el CHC. Si los inhibidores de la autofagia conocidas en la actualidad como bafilomycin A1, 3-MA o chloraquine pueden sinergizar con estos agentes CIP2A inhibidora para matar las células cancerosas órdenes de futuros estudios
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Además de la comprobación de que CIP2A oncogénico media bortezomib inducida por la autofagia, este estudio identificó p-4EBP-1 como participante en la autofagia inducida por bortezomib aguas abajo de p-Akt. El papel de p-4EBP1 fue validado por la expresión ectópica de 4EBP1, lo que resultó en un aumento de la p-4EBP1, y posteriormente se reduce el efecto de bortezomib en la autofagia (Figura 3B). 4EBP-1 es conocido como efector aguas abajo de PI3K /Akt /señalización que, en forma no fosforilada se une fuertemente a eIF4E e inhibe un paso clave en la iniciación de la traducción [47] mTOR, [48]. EIF4E es un factor clave en la iniciación de la traducción dependiente de la cubierta (incluyendo varias oncoproteínas importantes, tales como c-Myc, ciclina D1, el factor 1 inducible por hipoxia, y MCL-1) que controla el crecimiento de células tumorales y la supervivencia. Nuestros datos sugieren que bortezomib downregulated CIP2A-PP2A-p-Akt asociada p-4EBP1. Es posible que la regulación por disminución de p-4EBP1 suprimida traducción eIF4E dependiente promoviendo así la autofagia bortezomib inducida. Esta suposición se apoya en un estudio reciente que muestra que la supresión de la expresión 4EBP1 dio lugar a la re-sensibilización de las células de cáncer de próstata que expresan MYC a la rapamicina autofagia inducida [49]. De hecho, también notamos que el bortezomib también suprimió la expresión de 4EBP-1 en células SK-HEP1, y las células Hep 3B (Figura 2A), que también podrían contribuir a la autofagia inducida por bortezomib. Como alternativa, puede PP2A dephosphorylate directamente eIF4E y contribuir al bortezomib-indujo la autofagia [50]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual p-4EBP1 participa en la activación de la autofagia en el CHC que queda por esclarecer y se necesitan estudios adicionales. A pesar de los resultados actuales, el mecanismo detallado por el cual bortezomib inhibe CIP2A permanece Se necesitan estudios sobre los mecanismos desconocidos y otros. Los posibles mecanismos mediante los cuales bortezomib puede afectar a la transcripción de CIP2A incluyen la regulación del promotor directa o indirecta de CIP2A mRNA, la regulación epigenética de la
CIP2A
gen por la metilación del ADN o la maquinaria micro-ARN, o que afectan a otra como moléculas aún desconocidas que pueden regular la expresión CIP2A
en conclusión, el bortezomib induce la autofagia en las células de HCC a través de un novedoso mecanismo de proteasoma independiente:. CIP2A dependiente de p-1-4EBP regulación a la baja. Este estudio identifica la novela CIP2A oncoproteína como un importante mediador de células de HCC autofagia inducida por bortezomib a CIP2A y sugiere que puede ser una diana terapéutica potencial nuevo en el CHC. Por otra parte, el descubrimiento de compuestos /fármacos que actúan como inhibidores CIP2A puede tener un potencial terapéutico en el tratamiento de HCC.