Extracto
reordenamientos del gen ERG se encuentran en aproximadamente la mitad de todos los cánceres de próstata. Análisis funcional no explican totalmente la presión selectiva causando ERG reordenación durante el desarrollo del cáncer de próstata. Para identificar los cambios transcripcionales en el cáncer de próstata, incluyendo tumores con reordenamientos del gen ERG, se realizó un meta-análisis de datos de expresión de genes que aparecen seguidos de validaciones en el ARNm y los niveles de proteína, así como primeras investigaciones funcionales. Se incluyeron ocho estudios de expresión (n = 561) en los tejidos de la próstata humana en el meta-análisis. cambios transcripcionales entre el cáncer de próstata y la próstata no cancerosas, así como ERG reordenamiento-positivos (ERG +) y el cáncer de próstata ERG reordenamiento-negativo (ERG-), se analizaron. Los resultados detallados se puede acceder a través de una base de datos en línea. Hemos validado nuestro meta-análisis utilizando datos de nuestro propio estudio de microarrays independiente (n = 57). 84% y el 49% (pliegue de cambio & gt; 2 y & gt; 1,5, respectivamente) de todos los cambios transcripcionales entre ERG + y el cáncer de próstata ERG- determinados por meta-análisis se verificaron en el estudio de validación. Objetivos seleccionados fueron confirmados por inmunohistoquímica: NPY y PLA2G7 (reguladas en ERG + cánceres), y AZGP1 y TFF3 (regulados hacia abajo en los cánceres ERG +). Las primeras investigaciones funcionales para uno de los más prominentes genes de transposición asociada ERG - neuropéptido Y (NPY) - reveló aumento de la captación de glucosa
in vitro
indicando el posible papel de NPY en la regulación del metabolismo celular. En resumen, hemos encontrado robustos transcripcional cambios de población independiente en el cáncer de próstata y los primeros signos de reordenamientos ERG que inducen cambios metabólicos en las células del cáncer mediante la activación de las principales moléculas de señalización como NPY metabólica. Nuestro estudio indica que los cambios metabólicos posiblemente contribuyen a la presión selectiva que favorece reordenamientos ERG en el cáncer de próstata
Visto:. Massoner P, Kugler KG, Unterberger K, R Kuner, Mueller LAJ, Fälth M, et al. (2013) Caracterización de transcripción cambios en ERG Reordenamiento positivos de cáncer de próstata Identifica el Reglamento de la metabólico sensores tales como el neuropéptido Y. PLoS ONE 8 (2): e55207. doi: 10.1371 /journal.pone.0055207
Editor: Hari Koul, Universidad de Colorado, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Agosto, 2012; Aceptado 27 de diciembre de 2012; Publicado: 4 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Massoner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el apoyo financiero del Centro Comet Oncotyrol (Proyecto 3.1), la Provincia Autónoma de Bolzano, Tirol del Sur, (Grant 37 /40.3), el austriaco Ciencia Fondo FMF (Grant J3201), y el Fondo de Investigación del Tirol. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: después de discutir con Oncotyrol , Centro para la Medicina personalizada del cáncer GmbH, los autores le gustaría revelar la siguiente: por la noche, KU y HK llevaron a cabo este trabajo como empleados /asociados de Oncotyrol GmbH. El trabajo de este proyecto fue co-financiado por Oncotyrol GmbH en el contexto del programa de financiación COMET austríaco. Oncotyrol GmbH no tiene intención de presentar una patente o comercialmente perseguir los resultados contenidos en este manuscrito. En consecuencia, ningún interés en competencia podría ser identificado en el contexto de los trabajos descritos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Cerca de la mitad de todos los cánceres de próstata protege a un reordenamiento del gen [1]. Este último está formado por fusión de 5 'elementos reguladores de un gen regulado por andrógenos a la región de codificación de un miembro de la familia de genes E veintiséis (ETS) de factores de transcripción.
ETS
reordenamientos resultan en andrógenos impulsada por la sobre expresión de factores de transcripción ETS [1]. La transposición ETS más común es la translocación de la transmembrana serina proteasa regulada por andrógenos 2 (
TMPRSS2
) de genes, con el virus de la eritroblastosis v-ets E26 gen homólogo de oncogén (
ERG
) factor de transcripción que representa aproximadamente el 85% de todos los cánceres de próstata ETS de reordenamiento-positivas [2] - [4]. ERG reordenamiento es un evento temprano en la génesis del cáncer de próstata. Que ya está presente en el cáncer de próstata de bajo grado locales [5], [6] y persiste en tipos metastásicos y resistentes a la castración (CRPC) [1], [4], [7]. La aparición temprana y la alta frecuencia de reordenamientos ERG indican el beneficio selectiva de las células de reordenamiento-positivo en el cáncer de próstata.
Análisis funcionales realizados hasta ahora no han proporcionado una explicación exhaustiva de la presión selectiva forzando ERG reordenamiento en las primeras etapas de cáncer de próstata. ERG reordenamiento resultados en ERG sobreexpresión [1]. Se informó que el último para promover la migración de células de cáncer y la invasión, así como desdiferenciación celular y la transformación [8] - [11]. El papel de la reordenación del ETS en la progresión del cáncer de próstata Tampoco se ha aclarado. Mientras que algunos estudios indican una asociación entre el cáncer de reordenamiento-positivos, los tumores más agresivos y un mal pronóstico (es decir, [12] - [14]), otros informan de tal asociación (es decir, [15] - [17]); algunos incluso informan de un pronóstico favorable (es decir, [18], [19]). Obviamente necesitamos más información acerca de los cánceres de próstata de reordenamiento positivo ETS con el fin de entender la biología del cáncer de próstata
.
Una gran cantidad de datos de expresión génica se ha publicado desde el procedimiento de análisis de expresión mediante microarrays se estableció más de hace una década [20]. Estos estudios han informado de una variedad de alteraciones en la expresión de genes asociados con diversas enfermedades, incluyendo el cáncer de próstata. Validación de la gran cantidad de datos obtenidos a partir de experimentos de expresión génica es un reto. Sólo un pequeño número de los candidatos identificados han sido validados funcionalmente. Estos datos están lejos de ser exhaustiva y todavía contienen una gran cantidad de información de la explotación a la espera. El meta-análisis de los análisis de permisos combinados de los estudios individuales, están menos influidos por los resultados locales, y permitir la reducción de los datos para lograr resultados sólidos.
Se presenta un meta-análisis de datos de expresión génica publicadas con el fin de identificar transcripcional los cambios en el cáncer de próstata. Nuestro enfoque incluye la comparación de cáncer de próstata en comparación con el tejido prostático benigno, y ERG reordenamiento-positivo (ERG +) para los cánceres de próstata ERG reordenamiento-negativo (ERG-). Hemos validado los resultados de nuestro meta-análisis utilizando datos de un estudio de microarrays independiente y confirmó los objetivos seleccionados por inmunohistoquímica. También se realizó investigaciones funcionales preliminares para uno de los genes regulados más prominentes, a saber, el neuropéptido Y (NPY). Nuestros resultados indican que el ERG-reordenamientos posiblemente inducen cambios metabólicos en las células del cáncer mediante la activación de las principales moléculas de señalización metabólicas tales como NPY.
Materiales y Métodos
Cohortes de ejemplo
Las muestras de tejido usado para el meta-análisis se describe en otro lugar (estudios y referencias en la Tabla 1). Las muestras de tejido para el estudio de la expresión de validación y estudios inmunohistoquímicos fueron seleccionados del banco biológico del cáncer de próstata Innsbruck. Este biobanco se estableció en el curso del programa de detección precoz del Tirol para el cáncer de próstata en el Departamento de Urología de la Universidad de Medicina de Innsbruck [21]. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los pacientes y se documenta en la base de datos del Hospital de la Universidad de Innsbruck, de acuerdo con las disposiciones legales y los requisitos del comité de ética de la Universidad Médica de Innsbruck. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Médica de Innsbruck (Estudio no. 3174 AM, la enmienda 2). Cohortes analizadas aquí fueron los siguientes: a) estudio de validación El análisis de expresión; 57 tejidos de cáncer de próstata; GSC 5 n = 1, GSC 6 n = 5, 7 GSC n = 36, GSC 8 n = 3, 9 GSC n = 11, GSC 10 n = 1; edad de los pacientes, con una media ± desviación estándar (SD), 61,7 ± 6,9 años, el suero de los pacientes de próstata nivel de antígeno específico (PSA), 7,4 ± 5,0 ng /ml. b) El estudio inmunohistoquímico; 93 tejidos de cáncer de próstata, GSC 5 n = 19, GSC 6 n = 22, GSC 7 n = 32, GSC 8 n = 10, GSC 9 n = 10; edad de los pacientes, con una media ± desviación estándar (SD), 60,6 ± 6,4 años, nivel de PSA, 6,6 ± 5,4 ng /ml.
El metanálisis
Se seleccionaron ocho estudios de expresión, que comprende 561 tejidos de próstata humanos, para el meta-análisis (Tabla 1, Figura S1). Estos se enumeran en la expresión de genes de Omnibus bases de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [22], Array Express (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) [23] y Oncomine (http://www.oncomine.org) [24]. Todos los estudios se realizaron utilizando la tecnología de microarrays de Affymetrix.
Para el análisis de integración de datos de microarrays, los datos brutos, como se almacena en archivos CEL, se normalizó utilizando el algoritmo gcRMA [25], [26]. Para obtener información detallada acerca de pre-procesamiento de datos específicos del estudio, véanse los métodos complementarios. Para realizar una comparación de un estudio cruzado de los niveles de expresión génica, identificadores sonda conjunto de genes específicos de la plataforma fueron asignadas a un espacio de nombres común, tal como se describe anteriormente [27], [28]. Aquí figuran los nombres específicos de la plataforma fueron asignadas a los identificadores de genes Entrez utilizando las actuales asignaciones probeset /Entrez de BioMart por medio del paquete BioMart [29]. Siempre que sea más de una sonda-set fue asignada a un identificador de genes Entrez, se utilizó la sonda de conjunto con la más alta varianza para el análisis. Para identificar los genes regulados diferencialmente se utilizó un enfoque de dos pasos. En primer lugar, hemos derivado p-valores combinados a través de los estudios que utilizan inversa ji cuadrado método de Fisher [30]. A continuación, calculados (ponderadas) de plegado cambios. En un estudio previo, los autores utilizaron una permutación de prueba para evaluar la significación [27]. Nosotros, por otra parte, derivado de la información de una distribución chi cuadrado como se sugiere en [31]. Ver los medios suplementarios para detalles acerca de los valores de p y cálculos veces de cambio. Funcional anotación de la agrupación de los resultados del meta-análisis se realizó utilizando la base de datos DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) [32].
Expresión de validación Análisis
Un independiente se utilizaron los datos de microarrays establecidos (GSE32571) previamente generados por los coautores para la validación de la firma gen asociado a ERG. Para el presente análisis, los tejidos de cáncer de próstata (n = 57) fueron asignados a los grupos ERG + y ERG- utilizando un fluorescente ruptura de separación, en ensayo de hibridación in situ (FISH), como se describe anteriormente [33]. Las muestras de tejido se aislaron por macrodissection de cryosections 10-M. El ARN total se aisló con el Kit de EZ1 RNA Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante, comprueba la calidad utilizando el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), y se cuantificó. El ARN total se preparó para la hibridación en arrays Illumina humano Sentrix-12 BeadChip (iluminación) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Illumina microarrays de datos fueron procesados mediante la tubería de código abierto "Lumi" [34]. Después de la normalización cuantil, la expresión diferencial de genes se determinó usando el paquete R "LIMMA" [35]. Métodos detallados y los datos clínicos del estudio de validación de expresión se describen en otra parte [36]
La inmunohistoquímica
Diapositivas de tejido (n = 10) y microarrays de tejidos (TMA;. n = 92; 0,6 mm de diámetro ) que contiene cáncer (n = 3) y benigna (n = 1) de núcleos de tejido de la próstata de pacientes con cáncer de próstata se utilizaron para el análisis inmunohistoquímico. Todas las muestras de tejido se tiñeron para ERG. Nueve muestras fueron excluidos debido a su pequeña cantidad de tejido tumoral. 24 tejidos mostraron muy débiles o heterogéneos tinción ERG, mientras que 69 tejidos con intermedio de tinción ERG fuerte o negativos fueron asignados a los grupos ERG + y ERG-, respectivamente. 61 muestras de tejido se utilizan para la comparación inmunohistoquímica de ERG + y ERG-. la recuperación de antígenos e inmunohistoquímica se realizaron utilizando un sistema de guías-tinción automatizado Descubrimiento XT (Ventana Medical Systems). Todos los anticuerpos diana fueron probados en un microarray de tejido de ensayo que contiene diferentes muestras de tejido humano. La tinción inmunohistoquímica fue evaluado por un uropathologist experimentado (G.S.). Se establecieron las condiciones óptimas para la recuperación de antígenos todos los anticuerpos diana. anticuerpos diana, proveedores, números de artículo, y las concentraciones usadas fueron las siguientes: anti-AZGP1, Sigma, HPA-012582, 01:50; anti-ERG, Epitomics, EPR3864, 1:100; anti-GPR116, imgenex, IMG-71635, 1:100; anti-neuropéptido Y, Abcam, ab30914, 1:200; anti-PLA2g7, Sigma, HPA-0.035.915, 1:400; anti-HPGD, Atlas, HPA004919, 1:75; anti-TFF3, Strategic Diagnostics, 29940002, 1:5000. la recuperación de antígeno para todos los anticuerpos se llevó a cabo por el tratamiento previo con calor a 98 ° C durante 1 hora en CC1, un tampón basado en Tris con un pH ligeramente básico. anticuerpos diana se incubaron durante 1 hora a 37 ° C, seguido por la detección iView DAB (diaminobenzidina visualización, Ventana Medical Systems) y la contratinción de hematoxilina. Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio Axio Imager M1 (Zeiss) y el software TissueFAXS (TissueGnostics). análisis inmunohistoquímico cuantitativo se realizó usando el software HistoQuest análisis inmunohistoquímica (TissueGnostics), que es una herramienta basada en células intensidad de la tinción de análisis que emplea un marcador de identificación celular nuclear (en este caso hematoxilina), seguido por análisis cuantitativo de un marcador dado etiquetados en un diferente el color (en este caso tinción citoplasmática con diaminobencidina, DAB, marrón).
experimentos de cultivo celular
DU145, DUCaP, LNCaP, PC3 y VCAP son derivados de las metástasis del cáncer de próstata. Estos se adquirieron de ATCC y se cultivaron según las recomendaciones de la ATCC. EP156T y RWPE-1 se inmortalizan las células epiteliales prostáticas benignas, mientras que la CAF y PM151T son células estromales de próstata [37] - [39]. células benignas y del estroma se cultivaron como se describe anteriormente [37] - [39]. La identidad de líneas celulares de cáncer fue confirmada por los métodos de toma de huellas dactilares de ADN forenses que emplean el kit de amplificación de AmpFlSTR® SGM Plus® PCR (Applied Biosystems).
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos, suero de hambre, y se trataron con 25 nM NPY recombinante /24 h (Sigma) durante un periodo total de 48 horas. el número de células totales se determinaron utilizando el contador de células CASY y sistema de análisis (Sistema Schärfe). Los niveles de glucosa se midieron en sobrenadantes de cultivo celular utilizando el sistema de monitoreo de glucosa en la célula gluc (Thermo Fisher Scientific). qPCR y inmunoblot se realizaron como se describe anteriormente [40]
Estadísticas
Los cálculos estadísticos para el metanálisis y el análisis de la expresión de validación se realizaron utilizando el R (http:. //www.r-project .org), paquetes de Bioconductor base de datos de bioinformática de código abierto [41] y las funciones de la señora [42].
Los cálculos estadísticos para inmunohistoquímica y de cultivo celular experimentos se realizaron con SPSS para Windows 18. Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para investigar la distribución normal de los conjuntos de datos. No se distribuye normalmente con los datos y los datos de Gauss (normal) de distribución se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney U-test y T de Student, respectivamente, con el fin de calcular la significación de las diferencias entre los grupos. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Las barras de error en los histogramas representan la desviación estándar (DE) de un mínimo de tres experimentos independientes.
Resultados
Meta-análisis sobre Publicada datos de expresión génica para el cáncer de próstata
para investigar los cambios en la expresión génica en el cáncer de próstata humano, se realizó un meta-análisis de datos de expresión génica publicados. Ocho estudios de microarrays independientes fueron incluidos en el meta-análisis, que consistía en 561 muestras de tejido de la próstata (Tabla 1). Se investigaron los siguientes dos cuestiones: a) comparación de la expresión génica en los tejidos de cáncer de próstata y tejidos de próstata benignos; y b) Comparación de la expresión génica en ERG reordenamiento-positivo (ERG +) y reordenamiento ERG-negativo (ERG-) cánceres de próstata (plan de estudio en la Figura 1).
El metanálisis se realizó en ocho expresión de genes independientes estudios que se centran los tejidos de la próstata humana. Se utilizaron dos tipos de análisis comparativos. Los genes que muestran tejidos de cáncer de próstata y ERG + ERG- regulados diferencialmente se validaron utilizando un análisis independiente de la expresión génica (primera validación) y tinción inmunohistoquímica (segunda validación; sólo para determinados genes).
Los resultados de nuestro meta -análisis se muestran en las figuras 2A-B, y listados en la Tabla S1 a-B. Los resultados del meta-análisis y los estudios individuales también se pueden ver en línea en http://prostatedb.eigenlab.net/. Además del método de Chi-cuadrado menos conservador, que se aplicó para derivar un resumen p-valor [31], la base de datos también enumera un resumen p-valor más conservador obtenidas por un enfoque de permutación [27].
genes regulados diferencialmente en el cáncer de próstata y tejido de la próstata benigna (a, C), y ERG + y tejido de cáncer de próstata ERG- (B, D). A-B) parcelas volcán. Diferencialmente regulados los genes se destacó cuando al menos 2 veces abajo (verde) o hasta reguladas (rojo), y tenía un p-valor ajustado menor que 0,1. C-D) Diagrama gráfico de los ocho grupos funcionales de alta clasificación determinada por la agrupación anotación funcional, utilizando la base de datos DAVID. El tamaño de los grupos se correlaciona con el número de proteínas identificadas asociados con la anotación funcional (factor de cambio & gt; 1,5). Cuando las proteínas están presentes en más de un grupo, los grupos están conectados por líneas. El grosor de las líneas de conexión refleja el número de proteínas presentes en ambos grupos conectados. Los datos relativos a 561 muestras de tejido fueron utilizados para el meta-análisis. Tejidos de cáncer de próstata
En primer lugar, en comparación con los tejidos de la próstata benigna. Con respecto a los genes, que eran al menos 1,5 veces regulado y reveló un ajustado valor de p & lt; 0,1, se encontró que 280 genes fueron reguladas (46 de ellos más de 2 veces), mientras que 275 genes se redujeron reguladas (36 a más de 2 veces) en los tejidos de cáncer de próstata en comparación con tejidos de la próstata benigna (Figura 2A, Tabla S1A). anotación funcional reveló que los genes regulados diferencialmente (pliegue de cambio & gt; 1,5) código de moléculas (trans-membrana y proteínas de señalización extracelular), proteínas estructurales (de adhesión celular citoesqueleto y proteínas) y las proteínas implicadas en la proteolisis y la cicatrización de heridas de señalización (Figura 2C) . Las proteínas que se sabe están asociados con el cáncer de próstata (por ejemplo AMACR [43], AGR2 [44], CRISP3 [45], HPN [46], Hoxc6 [47], OR51E2 [48]), así como las proteínas no asociados con el cáncer de próstata tanto el momento (ejemplos PPM1H, SLC4A4, CaMKK2) se identificaron en el meta-análisis.
a continuación, comparó ERG + y tejidos de cáncer de próstata ERG-. No hubo información disponible sobre la condición reordenamiento ERG de las muestras de cáncer de próstata utilizadas en los estudios del meta-análisis. ERG reordenamiento resultados en ERG se observa un exceso de expresión y en aproximadamente el 50% de todos los tejidos de cáncer de próstata [1], [3]. Dividimos a todas las muestras de cáncer de próstata de los estudios incluidos en el meta-análisis en tres grupos, en función de su nivel de expresión ERG: muestras de sobreexpresión ERG-positivas, las muestras intermedias ERG, y muestras de sobreexpresión-ERG negativo (Figura S2). Cada grupo constaba de un tercio de todas las muestras de un estudio. muestras ERG sobreexpresión-positivas se supone que el ERG reordenamiento-positivo y asignado a la categoría ERG +, mientras que las muestras ERG sobreexpresión-negativas se supone que el ERG reordenamiento-negativas y se les asigna la categoría ERG-. Las muestras asignadas al grupo intermedio ERG fueron excluidos del análisis para garantizar una comparación precisa de ERG + y las muestras de cáncer de próstata ERG-. El uso de la expresión ERG como un sustituto para el gen de reordenamiento-estado se ha descrito anteriormente [49] y se verificó en nuestro propio estudio de microarrays como se describe a continuación. El meta-análisis comparativo reveló 109 hasta reguladas y 58 genes regulados (pliegue de cambio & gt; 1,5; ajustado valor de p & lt; 0,1; 36 genes fueron más de 2 veces regulada) en ERG + en comparación con ERG- de próstata cáncer (Figura 2B, Tabla S1 B). Diferencialmente regulados los genes estaban relacionados con los grupos funcionales de señalización (péptidos extracelulares de señalización y señalización hormonal), la adhesión (adhesión celular y proteínas de la matriz extracelular), y la respuesta de defensa (la curación de heridas y la respuesta inflamatoria; Figura 2D).
Nuestro meta-análisis reveló cambios en la expresión génica en varios subgrupos durante el desarrollo del cáncer de próstata. Un número de estudios que comprenden cohortes independientes de pacientes se incluyeron en el análisis. Por lo tanto, las alteraciones identificadas en la expresión génica expresan efectos generales de población independientes relacionados con el cáncer de próstata.
Meta-análisis de validación de Análisis de Expresión Independiente
A continuación, validó los resultados de nuestro meta-análisis. Nos centramos en la comparación de ERG + y los cánceres de próstata ERG- porque estos subtipos se describieron recientemente y no han sido ampliamente investigados hasta el momento. Para la validación de los meta-análisis se utilizaron los datos de un estudio independiente realizado expresión en una plataforma de expresión alternativo (iluminación). El estudio de validación se diferencia de los estudios de meta-análisis en los siguientes aspectos: a) cohorte independiente de pacientes (n = 57) seleccionado del banco biológico del cáncer de próstata Innsbruck; b) La tecnología de la expresión génica alternativa (estudio de validación, las matrices Illumina BeadChip, estudios de meta-análisis, microarrays de Affymetrix GeneChip); y c) ERG + y ERG- asignación de grupo (Figura 3A). En el meta-análisis, ERG + y tejidos ERG- fueron asignados de acuerdo a los niveles de expresión del ERG. En el estudio de validación del reordenamiento de estado del ERG se determinó mediante hibridación in situ fluorescente utilizando un ensayo de ruptura entre sí como se describe anteriormente [33] (Figura S3 A).
84% de todos los genes que se encuentran regulados diferencialmente en tejidos ERG + y ERG- (pliegue de cambio & gt; 2) se verificaron mediante un estudio de la expresión independiente. A) Características del estudio. los niveles de expresión B) en el tejido ERG ERG reordenamiento-positivos y negativos del estudio de validación. reordenamientos ERG fueron determinados por hibridación in situ fluorescente. C) genes regulados diferencialmente en ERG + y tejidos ERG-. D) Validado genes regulados en el meta-análisis y el estudio de validación. P-valor corregido BH; p-valor combinado de Fisher, Benjamini-Hochberg corregida.
En primer lugar confirmó que ERG reordenamiento dio lugar a ERG sobre-expresión (Figura 3B, Figura S3 A-C), lo que indica que el ERG + y ERG- grupos fueron asignados correctamente en el meta-análisis, así como el estudio de validación. A continuación, analizó la expresión de los 155 genes (12 genes fueron excluidos debido a que faltan o redundantes sonda fija) identificado como siendo regulados diferencialmente en los tejidos ERG + y ERG- en el meta-análisis (FC & gt; 1,5; p & lt; 0,1). 49% (76/155) de todos los genes que se encuentran regulados diferencialmente en ERG + y el cáncer de próstata ERG- en el meta-análisis se verifica en el estudio de validación. Cuando el análisis de validación se limita a los genes que son regulados por lo menos 2 veces en el meta-análisis, éstos ascendieron a 84% (27/32) (Figura 3C-D, el cuadro S2). Cuando analizamos el estudio de la expresión de validación como un estudio independiente y se investigaron todos los genes en las matrices, éstas aún ascendieron a 20% y el 41% de FC & gt; 1,5 y FC & gt; 2, respectivamente (Tabla S2). La concordancia entre el meta-análisis y el estudio de validación independiente mostró que nuestro meta-análisis genera resultados robustos que eran independientes de la cohorte de ejemplo, la asignación de la muestra, y la tecnología empleada la expresión génica.
El análisis de proteínas mediante inmunohistoquímica
Nuestro estudio se había centrado en los niveles de expresión de ARNm hasta este momento. Luego investigó si las proteínas codificadas por los genes regulados diferencialmente se encuentran en diferentes cantidades en ERG + y tejidos de cáncer de próstata ERG-. Seleccionamos tejidos independientes (no se utiliza para el análisis de la expresión) del banco biológico del cáncer de próstata Innsbruck con el fin de garantizar, además, que nuestra investigación podría revelar alteraciones relacionadas con el cáncer de próstata + ERG generales en lugar de las diferencias específicas para cada paciente.
Para asignar el tejidos a los grupos ERG + y ERG-, se determinaron los niveles de proteína ERG por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo previamente especificado para esta aplicación [50]. ERG inmunohistoquímica permite una clara distinción entre ERG + y tejidos ERG-. De acuerdo con los datos publicados relativos a ERG tejidos +, la intensidad de la tinción de ERG variar de fuerte a débil (Figura S4A) [50]. Algunos tejidos aparecieron heterogénea de ERG. Tanto las células cancerosas ERG-positivas y negativas-ERG estaban presentes en estos tejidos (Figura S4B). controles de tinción se realizaron en a) células benignas de la próstata, que son negativos para ERG (Figura S4C, imagen de la izquierda); b) las células endoteliales y linfocitos, que se tiñen positivo para ERG [50], y que constituyen un control de manchas internas (S4C ejemplo de la figura, imagen de la derecha); y c) las líneas celulares que representan ERG + (VCAP) o cáncer de próstata ERG- (Du145) (Figura S4D). De acuerdo con los informes anteriores, aproximadamente la mitad (en este caso el 60%) de todos los tejidos de la próstata investigados aparecido ERG-positivo (resumen de los casos de cáncer de próstata en la figura 93 S4E) [1], [3]. Para reflejar el meta-análisis, los tejidos con alta a las manchas ERG intermedia se compararon con los tejidos con tinción negativa ERG; Se excluyeron los tejidos teñidos de ERG heterogéneo y baja
Seis genes diana fueron sometidas a la validación de proteínas:.
GPR116
,
NPY
y
PLA2G7
, tres los genes sobreexpresados en ERG + tejidos y
AZGP1, HPGD
y
TFF3
, tres genes regulados en los tejidos de cáncer de próstata + ERG. En cuatro de los genes de la prueba, los niveles de proteína reflejan la regulación de los ARNm: NPY y PLA2G7 fueron hasta reguladas en los tejidos ERG +, mientras que AZGP1 y TFF3 aparecieron las reguladas (Figura 4). TFF3 se ha informado que ser regulados diferencialmente en ERG + tejidos [51]; por lo tanto, sólo 11 muestras se utilizaron para la comparación. De acuerdo con nuestros datos, se informó recientemente PLA2G7 estar relacionada con tumores ERG + [52]. Los niveles de proteína de los genes diana
GPR116 Opiniones y
HPGD
no fueron alterados en la comparación de ERG + y el cáncer de próstata ERG- (datos no mostrados). No está claro si las discrepancias observadas entre el ARNm y los niveles de proteína de estos dos genes reflejan (regulación diferente en ARNm y proteínas) o biológico (el rendimiento del anticuerpo) técnica variaciones.
A) diapositivas consecutivas de tejidos de la próstata de dos pacientes representativos. B) La cuantificación de las muestras de tejido obtenidas de 61 pacientes con cáncer de próstata diferentes utilizando el software de cuantificación HistoQuest inmunohistoquímica. HistoQuest no distingue entre células epiteliales y del estroma. Las diferencias en la intensidad de la tinción en las células epiteliales superan las diferencias que se muestran en el cuadro-manchas. Bar, 100 mM. Estadísticas, Mann-Whitney U-test; *, P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
Expresión asociado-ERG de NPY induce un aumento captación de glucosa en las células del cáncer de próstata
Para obtener nuevos conocimientos sobre el papel del ERG-reordenamientos en el cáncer de próstata , hemos investigado las funciones de los genes regulados diferencialmente en células de cáncer de próstata ERG +. NPY fue seleccionado para el análisis funcional. NPY es un pequeño neuropéptido con que fue descrito como un regulador central de balance de energía en el cuerpo humano (revisado en [53]). Se midió la absorción de glucosa
in vitro para determinar si
NPY induce cambios metabólicos en las células de cáncer de próstata.
Se confirmó la sobreexpresión de NPY en + líneas celulares de cáncer de próstata ERG utilizando qPCR e inmunotransferencia. qPCR niveles de expresión de NPY revelaron más alta expresión de NPY mRNA en las líneas celulares ERG + DUCaP y VCAP en comparación con otras líneas de células de próstata (Figura 5A). proteína NPY era detectable por inmunotransferencia únicamente en DUCaP y VCAP (Figura 5B). Cuando se trataron las células de cáncer de próstata que no expresan NPY endógeno (DU145, LNCaP y PC3) con NPY recombinante (48 h, 25 nM), se observó una mayor captación de glucosa en las células de NPY-tratado que en las células no tratadas (Figura 5C). Este efecto no se observó en las células que expresan NPY endógeno (VCAP, Figura 5C). Para investigar si los tejidos de la próstata humana son potencialmente NPY responden, por fin comparó la expresión de NPY y los receptores de NPY responden NPY1R, NPY5R y NPY2R (afinidad NPY clasificado, [54]) en la próstata con las de otros órganos humanos, mediante el Oncomine base de datos (http://www.oncomine.org) [24]. Encontramos NPY a ser más abundante en el tejido de próstata benigno y canceroso en comparación con los tejidos benignos y cancerosos derivados de otros órganos mientras NPYRs se expresaron en un grado similar en la próstata y otros tejidos (se muestran estudios representativos en la Figura S5). Por lo tanto, varios tejidos podrían ser NPY sensible. La próstata, sin embargo, produce niveles significativos de NPY endógeno. Tomados en conjunto nuestros datos demuestran que ERG-reordenamientos en el cáncer de próstata están asociadas con una variedad de cambios de la transcripción en células de cáncer, incluyendo la expresión de sensores metabólicos como NPY.
NPY se midió mediante qPCR (A) y de inmunotransferencia (B ) en líneas celulares de próstata. la expresión de NPY fue más alta en ERG + DuCAP y las células de cáncer de próstata VCAP. C) la estimulación NPY (48 h, 25 nM) aumentó la captación de glucosa en las células de cáncer de próstata que no expresan NPY endógeno (DU145, LNCaP, PC3). PC, líneas celulares de cáncer de próstata; BP, las líneas celulares de próstata benigna; PS, líneas de células estromales de próstata.
Discusión
Este estudio se realizó para determinar los cambios en la expresión génica en el cáncer de próstata, que se deben a alteraciones generales relacionados con la próstata e independiente del paciente cohortes, variaciones técnicas y la metodología aplicada. Nos centramos en los cambios de la transcripción en el cáncer de próstata ERG reordenamiento-positivo (+ ERG), ya que estos tumores constituyen un subgrupo de menos caracterizada de los cánceres de próstata. Esperábamos los resultados de esta investigación para producir una base de datos accesible al público para las alteraciones de la expresión génica en el cáncer de próstata y proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología de los cánceres de próstata ERG +. Hemos observado, por primera vez, que los reordenamientos ERG están posiblemente asociados con cambios metabólicos en las células de cáncer de próstata.
Nuestra meta-análisis consistió de 561 tejidos derivados de ocho estudios independientes.