Extracto
Los miembros de la respuesta de crecimiento temprano (EGR) la familia de factores de transcripción desempeñar diversas funciones en respuesta a muchos estímulos celulares, incluyendo el crecimiento, el estrés y la inflamación. EGR3 ha ido relativamente poco estudiada, pero en este caso a través del uso de las especificaciones (socios estratégicos para la Evaluación de Predictive Firmas de cáncer de próstata) toda Affymetrix base de datos de expresión de genes del genoma que informar que EGR3 ARNm es significativamente sobreexpresado en el cáncer de próstata en comparación con el tejido normal de la próstata (5 veces). Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org), una base de datos de microarrays de tejidos marcadas con anticuerpos contra más de 11.000 proteínas humanas, se utilizó para cuantificar la expresión de la proteína Egr3 en pacientes de próstata y cáncer de próstata normales. De acuerdo con los datos de características, se encontró que la proteína Egr3 es significativamente mayor en el cáncer de próstata. La base de datos SPECS tiene el beneficio de una extensa seguimiento clínico de los pacientes con cáncer de próstata. Análisis de la expresión Egr3 mRNA en relación con el estado de la recaída revela que la expresión de Egr3 mRNA se incrementa en las células tumorales de muestras no recaída (n = 63) en comparación con las células normales de la próstata, pero es significativamente menor en las muestras de recaída (n = 38) en comparación que no recaída. Las observaciones fueron confirmadas mediante un conjunto de datos independientes. Se determinó una lista de genes que correlacionan con este patrón de expresión única. Estos genes correlacionados-Egr3 se enriquecieron con Egr sitios en sus promotores de unión. La lista de genes contiene genes inflamatorios, como la IL-6, IL-8, IL1β y COX-2, que tienen amplias conexiones con el cáncer de próstata
Visto:. Pio R, Jia Z, Baron VT, Mercola D, UCI NCI SPECS consorcio de los socios estratégicos para la Evaluación de cáncer de Firmas, cáncer de próstata de respuesta (2013) Crecimiento temprano 3 (Egr3) es altamente sobreexpresado en no recurrente del cáncer de próstata, pero no en el cáncer de próstata recurrente. PLoS ONE 8 (1): e54096. doi: 10.1371 /journal.pone.0054096
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 13 de diciembre de 2011; Aceptado: December 10, 2012; Publicado: 14 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Pio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de la USPHS otorga U01 CA1148102 (consorcio NIH /NCI SPECS) y U01 CA152738 (NIH /NCI EDRN), y por la Universidad de California del Premio desarrollo de la carrera Facultad Irvine (al Dr. Z. Jia). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. D. Mercola es un accionista de Proveri Inc. de San Diego, un comienzo de la biotecnología pruebas relacionadas empresa -hasta el desarrollo de cáncer de próstata. El Dr. Baron es un consultor para PellFiCure Pharmaceuticals, Inc., una empresa de nueva creación el desarrollo de una terapia de combinación para el cáncer de próstata. No hay productos comercializados que declarar. Una solicitud de patente pendiente es: Michael McClelland, Yipeng Wang, Daniel Mercola: Materiales y métodos para la determinación de diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata. 09 2011: US 20110236903. Proveri está desarrollando una prueba de diagnóstico de cáncer de próstata inmunohistoquímica multiplex basado en el material de la pendiente de patente. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Todos los datos de la matriz de tejido humano citadas en este manuscrito se encuentra disponible al público como se indica en el texto.
Introducción
La respuesta de crecimiento temprano (EGR) factores de transcripción han sido durante mucho tiempo implicado en múltiples importantes procesos celulares con el cáncer, incluyendo la apoptosis, la diferenciación, la proliferación, la inhibición del crecimiento, y la inflamación [1] - [5]. factores de EGR de transcripción se induce rápida y transitoriamente en respuesta a diversos estímulos, tales como factores de crecimiento, citoquinas, ésteres de forbol (TPA) y la radiación ionizante, y regulan una gran variedad de genes en respuesta a estos estímulos [1], [6] - [ ,,,0],8]. La familia de EGR se compone de Egr1, Egr2, Egr3, y Egr4 [9] y todos los miembros de la familia se unen al elemento de ADN misma respuesta EGR (ERE), GCGG /TGGGCG, a través de tres dominios conservados de unión a ADN de dedo de zinc [10].
Egr1 es el miembro mejor estudiado de la familia de factores de transcripción. Numerosos estudios han detallado sus funciones supresoras de tumores y en consecuencia su regulación a la baja de mama, pulmón y cánceres gliales [11] - [13]. Curiosamente, Egr1 se ha demostrado que actúa como un oncogén en el cáncer de próstata. Múltiples investigadores han informado de la sobre-expresión de Egr1 mRNA y proteína en el cáncer de próstata [14] - [15]. Los modelos de ratón TRAMP y CR2-T-Ag de cáncer de próstata se utilizaron para examinar más a fondo el papel funcional de Egr1 en la iniciación y progresión de la enfermedad. Egr1 ratones nulos que se cruzaron con uno u otro modelo de cáncer mostraron retraso en la progresión de la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) para el carcinoma invasivo [16].
A pesar de las funciones bien caracterizados de Egr1, se sabe mucho menos acerca de la otra transcripción factores de la familia de EGR como Egr3. Varios estudios de detalle la función de Egr3 en el desarrollo neural, específicamente el desarrollo del huso muscular, la diferenciación de las neuronas simpático, y la respuesta al estrés ambiental (sonido, manejo y situaciones nuevas) [17] - [20]. los ratones deficientes en EGR3 exhiben disautonomía simpático y ataxia sensoriales severos [17], [20], mientras que los ratones deficientes en Egr1 presentan ningún problema de comportamiento o de desarrollo aparente [21]. ratones knockout EGR3 aún no se han utilizado para estudiar el papel del factor de transcripción en el cáncer, sin embargo informes recientes han utilizado modelos de cultivo celular y los datos de expresión de genes para estudiar la función Egr3 en varias áreas importantes para el cáncer. Por lo tanto, Egr3 está regulado por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) [22], [23], y desmontables de Egr3 en estas células da como resultado en una reducción de la proliferación inducida por VEGF, la migración y tubulogenesis [23]. Además de su papel en la angiogénesis, varios informes han investigado el papel de Egr3 en cáncer de mama, donde se encontró que era un gen sensible a estrógenos cuyo inmunorreactividad está asociado positivamente con los receptores de estrógenos α de estado (ER), los ganglios linfáticos, y metástasis a distancia [24], [25].
Aún queda mucho trabajo por hacer, sin embargo, en desentrañar el papel de Egr3 en otros tipos de cáncer. Sobre la base de nuestro conocimiento de Egr1 y las características de unión de ADN común de todos los factores de transcripción EGR, que postula que Egr3 realmente juega un papel, ya sea en la formación o progresión del cáncer de próstata. Aquí se presenta la sobre-expresión de Egr3 ARNm y proteínas en el cáncer de próstata en comparación con el tejido normal de la próstata. Además de estudiar la sobreexpresión de Egr3, también utilizamos las extensas expresión génica de próstata conjuntos de datos de la Universidad de programa de California-Irvine SPECS para examinar el patrón de expresión de Egr3 en pacientes con cáncer de próstata con el estado de la recaída conocida, y encontró que la expresión Egr3 en las células tumorales es menor en los tumores que recaída en comparación con los tumores que no sufren una recaída. Este patrón de expresión: mRNA bajo Egr3 en la próstata normal en comparación con la alta expresión en el cáncer, y la distinción entre la recaída y no recaída, se confirmó con el cáncer de próstata de la expresión génica conjunto de datos independiente de la Universidad de Pittsburg [26] - [28]
Uso de la proteína humana Atlas, que también detallan un único método in silico para la investigación de la expresión excesiva de proteínas Egr3 en el cáncer de próstata. Los resultados combinados indican que Egr3 es un biomarcador de cáncer de próstata pobre resultado. Por otra parte, un grupo de genes altamente correlacionados exhibe un patrón de expresión similar, y los miembros de este grupo son candidatos Egr3 de los genes regulados.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido de próstata
muestras de próstata fueron adquiridos por el consentimiento informado de acuerdo con la Universidad de California, Irvine Junta de Revisión Institucional (IRB): aprobado protocolos y HIPAA. adquisición de tejido era parte del programa NCI-SPECS de la Universidad de California, Irvine. tejidos de cáncer de próstata se recogieron en el momento de la prostatectomía, revisados por un patólogo, y se congelaron en nitrógeno líquido. hojas de seguimiento de tejido se mantuvieron para registrar el tiempo transcurrido desde la cirugía hasta la congelación (promedio 2,8 horas). muestras normales de la próstata eran o snap-congelado en nitrógeno líquido de biopsias frescas o congeladas instantáneamente después de la recogida del programa autopsia rápida en Sun Health Research Institute (Sun City, AZ), un miembro del consorcio Espec. Los datos consisten en 19 muestras normales de la próstata a partir de 13 individuos (12 de biopsia normal y 7 de rápida autopsia) y 108 muestras de cáncer de próstata a partir de 84 individuos (Tabla 1). Resultados parámetros y datos clínicos relevantes, incluyendo una extensa historia se acumularon durante un período de 11 años y se mantienen en la base de datos relacionales SPECS con un diccionario de datos de más de 250 artículos. El parámetro de resultado "recaída" se refiere a la recaída bioquímica, el aumento de los niveles de PSA por encima de 0,2 ng /ml tras un PSA después de la operación antes de que estaba por debajo del umbral de la prueba. No recaída significa que ninguna recaída bioquímica fue observado en el paciente durante el marco de tiempo de seguimiento clínico. Tenga en cuenta que todas las muestras de tumores se recogieron en el momento de la prostatectomía, por lo que se determinó el estado de la recaída después de que las muestras ya se recogieron. Los valores clínicas y demográficas relevantes se resumen en la Tabla 1.
Affymetrix Gene Expression Arrays y Análisis Estadístico
ARN de las muestras de tejido de la próstata fueron analizados utilizando Affymetrix arrays de expresión génica. El ARN se preparó a partir del tejido fresco congelado seccionando bloques de tejido con un criostato y purificación de RNA total directamente de las secciones congeladas acumulados. ARN purificado se hibrida con cualquiera de Affymetrix U133 Plus2.0 o genes U133A arrays de expresión, y las matrices se procesaron según el protocolo de Affymetrix. Los datos de intensidad se utiliza aquí es disponible de fuentes públicas (GEO GSE17951 y Geo GSE8218, respectivamente).
valores de intensidad normalizada de Affymetrix se utilizaron para comparar Egr3 (Affymetrix 206115_at ID sonda) expresión en muestras enteras de próstata normal y de próstata el tejido de cáncer. Los valores normalizados para los dos tipos de muestras se compararon mediante la prueba t de un estudiante. El análisis LIMMA (Modelos lineales para datos de microarrays) de Bioconductor se llevó a cabo en el entorno R para detectar los genes expresados diferencialmente [29].
Con el fin de analizar la especificidad de tipo celular de expresión de los genes que correlacionan Egr3 y, hemos utilizado una regresión lineal múltiple (MLR) modelo para describir la relación entre la composición nivel de expresión de genes y tipo celular observada Affymetrix para cuatro tipos de células en los casos en recaída y no recayeron: (1) en la que es la intersección, es el porcentaje de tipo de célula j como se determinó por un panel de patólogos, es el coeficiente de contribución del tipo de célula, es la desviación o cambio de tipo de célula cuando las recaídas de la enfermedad. es la variable de indicador para el estado de recaída. si el sujeto sufre una recaída y, de lo contrario. es el error aleatorio con distribución asumida. Este modelo de MLR se utilizó para ajustar los datos para estimar los coeficientes de expresión, y, cuando es el coeficiente de la expresión específica del tipo celular y γ es la diferencia en la expresión específica de tipo celular entre los casos de recaída y no recaída. Por lo tanto,
β
j mide la expresión de un gen por tipo celda j de los casos no una recaída y
γ
j es el cambio en
β
j en las recidivas. Para MLR, β
0 es la media de la expresión de todos los genes para todos los tipos de células y el estado de resultado (RS). Por lo tanto β
coeficientes j & lt; 0 indican que la expresión del gen j en un tipo celular dado es menor que la media β
0, mientras que β
coeficientes j & gt; 0 indican aumento de la expresión en comparación con ß
0. Del mismo modo, γ
j & lt; 0 indica que la expresión del gen j se reduce en el cáncer de próstata recidivante en comparación con el cáncer no recaída de próstata mientras que γ
j & gt; 0 indica que la expresión del gen j se incrementa en el cáncer de próstata recidivante en comparación con las enfermedades no recaída. La importancia de γ
j se determinó mediante la prueba t, basado en el error σ
j de γ
j. La precisión de los coeficientes de aportación expresión tipo de células específicas, β, se ha validado [30].
Human Protein Atlas
imágenes de inmunohistoquímica fueron descargados de la proteína humana a disposición del público Atlas (HPA) ( http://www.proteinatlas.org). HPA versión 8.0 es una base de datos de imágenes de microarrays de tejidos (TMA) marcadas con anticuerpos contra 11.250 proteínas humanas [31]. Los microarrays de tejidos consisten en secciones de 46 tejidos humanos normales y 20 tipos diferentes de cáncer humano. Hay un máximo de 24 imágenes de cáncer de próstata (de 12 pacientes) y 3 imágenes normales de la próstata (de 3 donantes) por anticuerpo, aunque el número de imagen puede variar dependiendo del anticuerpo analizado. Las imágenes fueron analizadas HPA secciones marcadas de próstata, ya sea con EGR3 (HPA006206), PSMA anticuerpos (CAB001451, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania), o PRLH (HPA014768).
Intensidad de marcado
Las imágenes HPA se analizaron y se cuantificó con el software Aperio ImageScope (Vista, CA) (figuras S1 y S2). El Pixel Count positiva Algoritmo de la versión 9.1 se utilizó para cuantificar la cantidad de unión de anticuerpos y para obtener imágenes pseudocoloreada TMA. Con el fin de cuantificar el etiquetado de las estructuras particulares tales como estroma o acinos tumor, se utilizaron los valores de umbral de intensidad determinado por el software Aperio, de acuerdo con las sugerencias del fabricante.
intensidad de los píxeles se define como una medida de la luminosidad de el píxel, o la cantidad de luz transmitida a través de la diapositiva. Cuanto menor sea el valor de la intensidad es, más oscura será la coloración se debe al aumento de la absorbancia A = -log I
obs /I
ref intensidad de la luz, donde I
obs indica transmite y I
ref es el intensidad de luz incidente. umbrales de intensidad se fijaron en 220, 175, 100, y -1 para el débil, medio, fuerte, y los píxeles "negativas", respectivamente. Pseudocolors de azul, amarillo, naranja y rojo se aplicaron a la negativa, débil, medio y fuerte tejido píxeles, respectivamente.
próstata normal y el cáncer de próstata se analizaron con el algoritmo de recuento de píxeles positivo. Para comparar la densidad de tinción en los tejidos normales y cáncer de próstata, se utilizó el NSR (número de pixeles fuerte relación positiva). El número de píxeles positivos fuertemente marcadas se divide por el número total de píxeles positivos para normalizar cada muestra a la zona en cuestión, proporcionando de este modo la intensidad de etiquetado de un tipo de célula seleccionado por unidad de área de tejido.
El pixel positivo algoritmo de recuento también se utilizó para comparar la expresión de proteínas en los componentes del estroma y epiteliales del tejido de la próstata. Una herramienta de la pluma del ratón guiada se utilizó para delinear estroma 10 y 10 zonas de la glándula por sección TMA. Las 10 zonas de muestreo se seleccionaron al azar siempre que sea posible, dentro de las limitaciones de tamaño y composición del tejido
Las limitaciones de tamaño del tejido:. Se fueron evitados del área total del tejido a sólo 1 mm de diámetro, y los bordes de cada sección de tejido debido a la tinción en estas zonas tienden a ser afectadas por el tratamiento del TMA. Además, usamos áreas de muestreo que no se tocan entre sí
Las restricciones en la composición del tejido:. Algunas secciones de tejido contienen muchas glándulas, y cuando este fue el caso de las áreas de muestreo se eligieron al azar. Otras secciones contenían mucho menos áreas de la glándula, lo que reduce nuestra elección de las glándulas que estaban presentes. Las secciones del estroma, por otro lado, fueron elegidos al azar ya que las secciones de tejido tenían numerosas áreas del estroma.
Una instantánea fue tomada de cada muestra elegida al azar y se utilizó para verificar que las muestras utilizadas para el análisis fueron representativa de toda la sección.
los resultados se promediaron y se utilizaron para la determinación de diferencias significativas en comparación con el tejido normal de la próstata.
los genes correlacionados-Egr3
Coeficiente de correlación de Pearson (R ) y la probabilidad y la pendiente asociada se calcularon en el entorno R para la correlación de expresión de cada gen en la plataforma Affymetrix con la expresión de Egr3. Los genes con
p
valora ≤0.001 basado en el análisis de correlación de Pearson y un coeficiente de correlación de Pearson ≥0.45 fueron seleccionados como la definición de genes correlacionados-Egr3. genes EGR3 correlacionados para el conjunto de datos principal SPECS Affymetrix U133 Plus2.0 (127 muestras de próstata) utilizados en este estudio, y los genes de un conjunto de datos de expresión génica SPECS adicional (136 muestras de próstata), basado en la plataforma Affymetrix U133A Egr3-correlacionados, se calcularon . El genes entre los conjuntos de datos que cumplen los valores límite de significación se tomaron como la lista definitiva de genes correlacionados-Egr3 superpuestas. La pendiente de la recta de regresión también se utilizó para caracterizar la adherencia de cada correlación con la expresión Egr3 y se informa en la Tabla S1.
simulación estadística
Varias simulaciones se llevaron a cabo con el fin de evaluar al azar ocurrencia. En general, la frecuencia de ocurrencia de los conjuntos de sonda candidato en una clase se comparó con la frecuencia de ocurrencia por selección aleatoria de un número igual de conjuntos de sonda del resto de la matriz, es decir, de todos los conjuntos de sonda con exclusión de los conjuntos de sonda candidatos usando el R programa. La selección aleatoria se repite 10.000 veces y la frecuencia de ocurrencia aleatoria promedio en comparación con la frecuencia observada de la sonda fija candidatos se utilizó para establecer la probabilidad de ocurrencia aleatoria.
factor de transcripción sitio de unión y análisis de genes red
Genomatix (Múnich, Alemania) MatInspector software se utilizó para determinar el factor de transcripción sitios de regiones promotoras 1500 bases antes de 1000 bases aguas abajo del sitio de inicio de transcripción (TSS) de unión. El factor de transcripción sitios (matrices de peso) de la biblioteca y los elementos básicos promotor general de vertebrados de unión (0,75 /Optimizado) grupo matriz se utilizaron para calcular los sitios de unión para cada promotor. Basado en el modelo de fondo MatInspector las apariciones de V $ EGRF (Transfac anotación del vertebrado miembros de la familia Egr Egr1, Egr2, Egr3, CKROX, y WT) sitios de unión, una simulación 10.000 × se llevó a cabo en el entorno R para comparar el porcentaje de fondo (62,7%) de V $ EGRF sitios de unión como se determina por MatInspector al porcentaje observado (99%).
p-valor =
el número de veces que la espera fue mayor que el observado /10.000 usando Genomatix. La simulación
p-valor
proporciona una estimación de falso descubrimiento.
MetaCore (Thomson Reuters, Nueva York, NY) software de análisis de vías, se utilizó para analizar las conexiones entre genes correlacionados-Egr3. análisis de enriquecimiento factor de transcripción y análisis de enriquecimiento función de las proteínas se calcularon mediante MetaCore utilizando una tasa de falso descubrimiento (FDR), de 0,05 y un modelo de fondo reportados proteína-proteína o proteína-ADN interacciones. Todos los
p-valores reportados
para el análisis MetaCore vienen directamente de los cálculos de MetaCore basado en una distribución hipergeométrica. El programa de la ontología de genes basado en la web DAVID [32], [33] (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) también se utiliza para analizar las conexiones funcionales entre genes correlacionados-Egr3.
externo validación del conjunto de datos
el conjunto de datos GEO a disposición del público GDS2545 fue utilizado como una validación externa de Egr3 y genes correlacionados-Egr3 identificadas en el conjunto de datos Espec. GDS2545 consiste en 18 muestras de próstata normal de los donantes, las 63 muestras de próstata normal adyacente al tumor, 65 muestras de cáncer de próstata primario, y 25 muestras de cáncer de próstata metastásico. Todas las muestras se hibridaron en matrices U95A Affymetrix. Chandran et al. [27] y Yu et al. [26] informe de los valores de expresión Affymetrix EGR3 en información complementaria y en las tablas de valores de expresión génica. análisis de genes Egr3 correlacionados se llevó a cabo usando este conjunto de datos. La parte superior 150 Egr3 correlacionados-sonda fija, a juzgar por la correlación de Pearson
p-valor
consta de 121 genes únicos, que se compararon con los 80 genes EGR3 correlacionados únicos identificados en las especificaciones conjunto de datos produciendo un solapamiento de 43 único genes. Una simulación 10.000 × se llevó a cabo en el entorno R para determinar la probabilidad de que esto ocurra por casualidad superposición (
p = 0,0001
).
Cell Cultura y cáncer de próstata humano
M12 las células se mantuvieron en medio RPMI libre de suero suplementado con L-glutamina, 10 ng /factor de crecimiento epidérmico ml, 0,1 M dexametasona, 5 mg /ml de insulina, 5 mg /ml de transferrina, 5 ng /selenio ml, 0,05 mg /ml de gentamicina y 2,5 mg /ml de anfotericina B, como se describe en [34].
Desmontables estable de Egr3 Expresión en células M12
células M12 se sembraron el día antes de la transfección a una densidad de 750.000 células /pocillo en placas de 6 pocillos, en medio de crecimiento libre de antibiótico que contienen 2% de suero bovino fetal. Las células fueron transfectadas con 3 g shRNA plásmido scramble (shSCR) o plásmido shEgr3 (SA Biosciences, Valencia CA) con 6 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) según las instrucciones del fabricante. se añadió puromicina (1 mg /ml) tres días más tarde para la selección de células transfectadas. clones de células individuales fueron aislados utilizando métodos estándar. células transfectadas de manera estable (shSCR-M12 y shEgr3-M12) fueron entonces mantenidos en medio de crecimiento M12 suplementado con puromicina.
análisis de transferencia Western
Las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y se lisaron en RIPA tampón en presencia de inhibidores de la proteasa. El lisado se sometió a ultrasonidos brevemente y se aclaró por centrifugación a 13.200 rpm a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó a través de ensayo de proteínas BioRad. Las proteínas se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE seguido de transferencia a una membrana de PVDF. Las membranas se bloquearon en 5% de leche (w /v) en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 0,5% (TBST) durante 2 horas. anticuerpo Egr3 (sc-191 Santa-Cruz Technology, Santa Cruz CA) se incubó durante la noche a 4 ° C, seguido de 3 lavados en TBST. Las membranas se incubaron con anticuerpos conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Después de 3 lavados en TBST, las membranas se incubaron con HyGlo-HRP kit de quimioluminiscencia (Denville Scientific, Metuchen NJ). Las membranas fueron despojados y se volvieron a sondar con anticuerpos anti-actina (Santa Cruz).
RT-PCR cuantitativa
El ARN total fue extraído de células shSCR-M12 (control de mezcla aleatoria) o shEgr3-M12 usando el kit RNeasy Plus (Qiagen, Valencia CA) según las instrucciones, y se resuspendió en agua. La integridad del ARN se evaluó por electroforesis en gel de agarosa formaldehído. Una RNA g fue convertido a cDNA utilizando la Quanta qScript cDNA Super-mix (5 min a 25 ° C; 30 min a 42 ° C; 5 min a 85 ° C) en un termociclador. QPCR en tiempo real se realizó en el ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, CA) utilizando los parámetros estándar. Cada muestra se llevó a cabo en cuatro réplicas con análisis de la curva de disociación. Las diferencias en los niveles de ARNm se analizaron mediante el método -ΔΔCT 2
. GAPDH se utilizó para normalizar las muestras. Primer secuencias se proporcionan en la figura S4.
reportero de ensayo
El promotor de IL-8 humana (bases -262 a -55) clonado en el plásmido de luciferasa pGL3 y el control PRL-SV40 plásmido Renilla luciferasa eran una especie de regalo del Dr. Carlotta Glackin (City of Hope, Los Ángeles, CA) y se han descrito en Li et al. [35]. El plásmido pGL3-IL6 luciferasa que contiene el promotor de IL-6 fue un regalo del Dr. Steve Cole (UCLA, CA) y se ha descrito en Eickelberg et al. [36]. Las células shSCR-M12 y células shEgr3-M12 se sembraron a una densidad de 20.000 células /pocillo en una placa blanca de 96 pocillos el día antes de la transfección, y se cultivaron en, medio de crecimiento libre de antibióticos libre de rojo fenol. Las células fueron transfectadas con plásmidos pGL3-IL8 IL6-pGL3 o y el plásmido de luciferasa de Renilla (para normalizar para la eficacia de transfección de los números y de células). FuGene reactivo de transfección (Promega, Madison, WI) se usó según las instrucciones del fabricante con 160 ng de plásmido pGL3, 40 plásmido pRL ng y 0,6 FuGene l. Dos días más tarde, se añadió Dual-Glo Luciferase reactivo (Promega) al medio de crecimiento (1:01 vol /vol) y se incubó durante 10 min RT. Las placas se leyeron usando un luminómetro Dynatech ML-3000. La reacción se inactivó mediante la adición de la Dual-Glo Stop & amp; reactivo Glo, que también inicia la reacción de luciferasa de Renilla, durante 10 minutos a RT antes de leer. La relación de la luciérnaga de Renilla luminiscencia se calcula para cada pocillo.
Resultados
célula de tipo específico de ARN Expresión de Egr3 es mayor en el cáncer de próstata
Se analizó todo el genoma Affymetrix los datos de expresión de tejido normal y canceroso de la próstata para determinar si Egr3 se expresa diferencialmente. Los datos de expresión de genes Affymetrix U133 Plus2.0 consta de 19 muestras normales de próstata (obtenidos a partir de 13 donantes) y 108 muestras de tumor de próstata (obtenidos a partir de pacientes con cáncer de próstata 84; varias muestras de los mismos pacientes estaban presentes en el conjunto de datos de expresión génica). información demográfica del paciente para los pacientes de cáncer 84 y los 13 donantes de tejidos normales se resume en la Tabla 1. El análisis de los datos de expresión normalizada de las muestras de próstata reveló que 127 Egr3 (sonda conjunto 206115_at) es significativamente sobreexpresado en el cáncer de próstata en comparación a la normalidad tejido de la próstata. Significa la expresión en el cáncer de próstata es 5,35 veces mayor que en el tejido normal de la próstata y la prueba t de estudiante (
p
= 2 × 10
-15) confirmó que esta diferencia es altamente significativa. El análisis de la mediana de los valores de expresión también revela una diferencia significativa en la expresión Egr3 entre muestras normales de próstata y cáncer de próstata (datos no mostrados). Un histograma de expresión Egr3 en todos los pacientes se muestra en la Figura 1. EGR3 valores de expresión se muestran como valores de intensidad de Affymetrix, más que representan en una escala log 2 para mostrar mejor su alcance. Dado que las edades medias de los casos portadores de tumor difieren de la de los casos normales (Tabla 1), la diferencia de expresión Affymetrix para Egr3 se comparó con la lista de los cambios relacionados con la edad previamente determinados de Jia et al. [37] basado en una comparación de los datos de expresión de 15 muestras de biopsia de próstata normales con una edad media de 54 años a los de las 13 muestras de autopsia rápidos con una edad media de 84 años. De los 3400 sonda fija que producen diferencias significativas identificadas en esta comparación, no se incluyeron los conjuntos de sonda para Egr3. Estos resultados indican que el aumento de expresión de Egr3 no está asociado con la diferencia de edad entre los donantes normales y pacientes con cáncer de próstata y se asocia con una o más propiedades específicas a los tejidos de próstata portador de un tumor.
Affymetrix expresión se representa en una escala lineal en el que el anti-log
2 de valor de expresión Egr3 de cada paciente se traza en el eje y. La línea discontinua en 1292 indica la Egr3 valor de intensidad media de todas las muestras.
Validación a nivel de proteínas con un conjunto de datos externa
Aunque Egr3 está regulado en el ARNm , puede ser el nivel de proteína Egr3 que es importante para la función de Egr3 en el cáncer de próstata. Como complemento de la expresión génica de datos se utilizó un
in silico
enfoque para analizar los niveles de proteína EGR3 en el tejido prostático. Human Protein Atlas (HPA) es un conjunto de datos de microarrays de tejidos de 20 diferentes tipos de cáncer y 46 tejidos normales (http://www.proteinatlas.org). la morfología del tejido y la expresión de proteínas de las pautas de las muestras de los pacientes HPA fueron verificadas por un patólogo certificado por el consejo. HPA proporciona una indicación de la expresión de proteínas en el cáncer en comparación con homólogos de tejido normal. Las imágenes HPA fueron descargados para su posterior análisis cuantitativo. Las imágenes disponibles inmunohistoquímica de tejido prostático para la tinción Egr3 consisten en muestras de cáncer de próstata 20 de 11 pacientes y 3 muestras normales de la próstata a partir de 3 donantes.
Se utilizó el algoritmo de recuento de píxeles positivos Aperio ImageScope para cuantificar la intensidad de la tinción Egr3 ( HPA006206). se aplicaron Pseudocolors como se describe en Métodos y se muestran en la Figura 2. Aunque se utilizaron sólo cuatro niveles de umbral, las imágenes pseudocoloreada ilustran claramente que la intensidad de tinción Egr3 separó la estructuras glandulares de otras características tales como el estroma que contiene epitelio-(Figura 2), lo que indica que el método de umbral simple separa adecuadamente los elementos glandulares de todo lo demás. El estroma era en su mayoría carentes de tinción Egr3. Para las muestras normales y tumorales, el patrón de tinción anti-Egr3 predominante fue uniformemente epitelial. Dentro de las células epiteliales, se observó tinción Egr3 en los compartimentos de membrana cytosol- y débilmente en el núcleo
A-B:. HPA normal de la próstata, los pacientes 2098 y 2472, respectivamente. C-D: muestras de cáncer de próstata, los pacientes HPA 3303 y 3744, respectivamente. Todos los casos de HPA disponibles adicionales se muestran en la información de suplemento. E:. Histograma de fuerte proporción de píxeles positivo (NSR) para pacientes normales y con cáncer de próstata
Aunque se puede esperar que los factores de transcripción para localizar principalmente al núcleo, este patrón de tinción no es única para Egr3 en el Human Protein Atlas. A modo de ejemplo, nos fijamos en la tinción de un bien estudiados factor de transcripción, c-fos. La tinción para c-fos (HPA018531) es sobre todo nuclear, pero también aparece en una localización citoplasmática de la membrana en cuatro de diez tejidos de cáncer de próstata que se tiñeron positivas para c-fos.
También es posible que la localización Egr3 se altera en los estados patológicos, como es el caso para el factor de transcripción y supresor de tumor p53, por ejemplo. De hecho, de tipo salvaje p53 se acumula en el citoplasma de las células tumorales en el cáncer de mama inflamatorio o neuroblastoma, que conduce a su inactivación funcional [38] - [40]. Podría ser interesante, en el futuro, para confirmar la localización /membrana citoplasmática de Egr3 y su relevancia.
Para cuantificar la tinción Egr3 seleccionamos un promedio de 10 regiones de glándulas y estroma 10 en cada muestra. Cada una de las 10 regiones se delineó el uso de un puntero del ratón guiado de manera que sólo se incluyeron las regiones de característica histológica pura como las glándulas y las formaciones tumorales glandulares. El software reconocido luz de la glándula y pseudolumen fiel y excluidos píxeles de estas regiones, siempre y cuando se tuvo cuidado de excluir lumen de escombros. Los valores de intensidad resultantes tinción EGR3 de las 10 áreas de tumor y el estroma se normalizaron por separado.