Extracto
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y factor de crecimiento vascular endotelial receptor 2 (VEGFR2) han surgido como dos objetivos clínicos eficaces para el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). En el presente estudio, se encontró que delfinidina, una antocianidina, presentes en frutas y verduras pigmentadas, es un potente inhibidor de EGFR y VEGFR2 en las células NSCLC que sobreexpresan EGFR /VEGFR2. El uso de estas células, se determinó a continuación los efectos de delfinidina en el crecimiento celular y la apoptosis
in vitro Opiniones y en el crecimiento del tumor y la angiogénesis
in vivo
. tratamiento delfinidina (5-60 mM) de células de NSCLC inhibe la activación de PI3K, y la fosforilación de AKT y MAPK. Además, el tratamiento de células de NSCLC con delfinidina como resultado la inhibición del crecimiento celular sin tener efectos tóxicos significativos sobre las células epiteliales bronquiales humanas normales. Específicamente, el tratamiento de NCI-H441 y SK-MES-1 células con delphindin (5-60 mM) dio lugar a (i) la escisión de la proteína PARP, (ii) la activación de la caspasa-3 y -9, (iii) regulación a la baja de la lucha contra proteínas -apoptotic (Bcl2, Bcl-xL y Mcl-1), (iv) la regulación al alza de las proteínas pro-apoptóticos (Bax y Bak), y (v) disminución de la expresión de PCNA y la ciclina D1. Además, en ratones desnudos atímicos implantados subcutáneamente con células de NSCLC humanos, delfinidina tratamiento causó una (i) una inhibición significativa del crecimiento del tumor, (ii) disminución de la expresión de marcadores de la proliferación celular (Ki67 y PCNA) y angiogénesis (CD31 y VEGF) y (iii) la inducción de apoptosis, en comparación con los ratones de control. Basándose en estas observaciones, se sugiere que la delfinidina, solo o como adyuvante a las terapias actuales, podría ser utilizado para la gestión de NSCLC, especialmente aquellos que sobreexpresan EGFR y VEGFR2
Visto:. Pal HC, Sharma S, Strickland LR, Agarwal J, Athar M, Elmets CA, et al. (2013) delfinidina reduce la proliferación celular e induce la apoptosis de no microcítico de pulmón de células de cáncer de Orientación de EGFR /VEGFR2 vías de señalización. PLoS ONE 8 (10): e77270. doi: 10.1371 /journal.pone.0077270
Editor: Xianglin Shi, Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Agosto 2013; Aceptado: 9 de septiembre de 2013; Publicado: 4 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Pal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención AT004966 y el Programa Nacional de Desarrollo de Grant Centro de cáncer Cancer Institute CA13148-39 UAB Integral Juvenil Facultad. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es un problema de salud importante en los Estados Unidos que representa aproximadamente el 28% de todas las muertes relacionadas con el cáncer. Por otra parte, se ha proyectado un total de 228,190 nuevos casos de cáncer y 159,480 muertes por cáncer de pulmón que se producen en los Estados Unidos en 2013 [1]. Las dos formas principales de cáncer de pulmón son el cáncer de células pequeñas de pulmón (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que comprenden aproximadamente 15 y 85% de todos los casos, respectivamente. El cáncer de pulmón ha demostrado ser difícil de controlar con los enfoques terapéuticos y quirúrgicos convencionales conducen a un mal pronóstico. Indicativo de este mal pronóstico, la tasa de supervivencia global a los 5 años es sólo del 15% para el NSCLC [2,3]. Claramente, la investigación de las opciones de tratamiento alternativas para el NSCLC está justificada, y se espera que den paso a la mitigación de este peso de la mortalidad.
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR /HER1 /ErbB1) es un tipo 1 transmembrana tirosina quinasa del receptor (RTK) de la familia ErbB. Se compone de un dominio de unión extracelular y un dominio intracelular que contiene actividad tirosina quinasa [4]. Está bien establecido que el EGFR está sobreexpresado en aproximadamente el 95% de todos los tumores sólidos [5,6]. Además, es conocido por ser un conductor oncogénico crítico que surge en más de 60% de los casos de NSCLC [7] y aproximadamente el 30% de los cánceres de mama [8]. Además, se ha reportado el crecimiento endotelial vascular del receptor del factor 2 (VEGFR2) que se sobreexpresa en varios tumores, incluyendo cáncer de pulmón [9]. Por otra parte, la sobreexpresión de EGFR y VEGFR2 se asocia con la quimiorresistencia y se correlaciona con un mal pronóstico [10,11]. la activación aberrante de EGFR y VEGFR2 desencadena la fosforilación de una multitud de proteínas, incluyendo las vías PI3K /Akt y MAPK que están implicados en la supervivencia celular, la apoptosis y la angiogénesis [12,13]. Debido al potencial de diafonía y un papel bien establecido en el crecimiento del tumor y la angiogénesis, la inhibición de EGFR y la señalización de VEGFR2 puede mejorar el resultado clínico de pacientes con NSCLC avanzado. Diferentes enfoques se han adoptado para bloquear simultáneamente EGFR y la señalización de VEGFR2. Las combinaciones de dos inhibidores específicos y agentes individuales que se dirigen a estos receptores han sido utilizados; sin embargo, su uso en pacientes con toxicidades inaceptables reunió.
Hay una necesidad urgente de desarrollar agente natural terapéutica de objetivos múltiples que bloquea las actividades RTK y aguas abajo de señalización de los receptores EGFR y VEGFR2 para mejorar la eficacia terapéutica y minimizar la toxicidad a la normalidad células huésped. Uno de estos agentes es delfinidina, una antocianidina la dieta se sabe que son muy presentes en muchas frutas pigmentadas (granadas, fresas y uvas oscuras) y verduras (berenjenas, tomates, zanahorias y cebollas rojas) [14]. Posee antioxidante [15], anti-inflamatorias [16,17], antiproliferativos [18] y las actividades contra el cáncer [19]. Además, la delfinidina se ha demostrado que inhiben la vía de señalización del EGFR, así como la invasión de células de cáncer de mama [20]. Sin embargo, la mayor parte de la lucha contra el cáncer y las actividades anti-angiogénicos descritos en la literatura se basan en
in vitro
estudios. El objetivo del presente estudio fue determinar los efectos de delfinidina en el crecimiento celular y la apoptosis
in vitro Opiniones y en el crecimiento del tumor y la angiogénesis
in vivo
en las células NSCLC. Nuestros resultados indican que la delfinidina es un potente inhibidor tanto de EGFR y VEGFR2 en células de NSCLC. Además, delphindin inhibe la activación de PI3K, y la fosforilación de AKT y MAPK. Esto dio lugar a la inhibición del crecimiento celular y la inducción de la apoptosis en células de NSCLC. Además, delphindin tratamiento inhibió el crecimiento de xenoinjertos de NSCLC en los ratones desnudos que se asoció con una disminución en la expresión de marcadores para la proliferación celular y la angiogénesis, así como una inducción de la apoptosis.
Materiales y métodos
Materiales
delfinidina (& gt; 98% de pureza) se adquirió de Extrasynthase (Lyon, Francia). Los anticuerpos monoclonales y policlonales para EGFR y fosfo-EGFR, VEGFR2 y fosfo-VEGFR2, ERK1 /2 (fosfo-p44 /42, Thr
202 /Tyr
204), JNK1 /2 (phospo-p54 /46 , Thr
183 /Tyr
185), p38 (fosfo-p38, Thr
180 /Tyr
204), PI3K, fosfo AKT, Bcl2, Bcl-xL, MCL-1, Bax, Bak, ciclina D1, PARP, caspasa-3 y -9 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos policlonales para VEGF, PCNA y Ki67 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). anticuerpo anti-CD31 de ratón se obtuvo de BD Biosciences (San Jose CA). Anti-ratón o anti-conejo secundaria de rábano conjugada con peroxidasa se obtuvieron de Millipore Corporation (Billerica, MA).
El tratamiento de células
células de NSCLC humano NCI-H441, SK-MES-1 y A549 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). células NCI-H441 se cultivaron en medio RPMI1640 (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), SK-MES-1 en las células se cultivaron en medio EMEM (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), y las células A549 se cultivaron en F de Ham medio -12K (Mediatech Inc., Manassas, VA) suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal y 100 mg /ml de penicilina-estreptomicina. Las células normales del epitelio bronquial humano (NHBE) se obtuvieron de Clonetics Airways células epiteliales Sistemas (Cambrex Bio Science, Walkersville Inc., MD) y se cultivaron en crecimiento epitelial bronquial suplementado con factores de crecimiento (Cambrex Bio Science, Walkersville Inc., MD). Las células se mantuvieron en condiciones estándar de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO
2 en un ambiente húmedo. se utilizó delfinidina (disuelto en DMSO) para el tratamiento de las células. La concentración final de DMSO usada fue 0,1% (v /v) para cada tratamiento. Para los estudios de dosis-dependiente NCl-H441 y SK-MES-1 células fueron tratadas con delfinidina (5-60 mM) durante 3 y 48 horas en medio celular completa. Las células de control se trataron con el vehículo solo. En experimentos adicionales, privaron de suero NCl-H441 y SK-MES-1 células fueron tratadas con delfinidina (5-60 mM) durante 3 horas y después se incubaron con o sin EGF (50 ng /ml; 15 min) o sin y con VEGF (20 ng /ml; 30 min).
Preparación de lisados de células
Después del tratamiento de células con delfinidina, el medio se aspiró y las células se lavaron con PBS (10 mmol /l, pH 7,45). Las células fueron incubadas en un tampón de hielo frío de lisis (HEPES 10 mM (pH 7,9), KCl 100 mM, EDTA 10 mM, EGTA 20 mM, DTT 100 mM, PMSF 20 mM, 0,5% NP-40 con recién inhibidores de la proteasa añadió leupeptina, aprotinina y benzamidina) durante 20 min. Se recogieron las células y se recogió el lisado en un tubo de microcentrífuga y se pasan a través de una aguja de 21,5-G para romper los agregados de células. El lisado se aclaró por centrifugación a 14.000 g durante 10 min a 4 ° C, y el sobrenadante (lisado celular total) recogida, se dividió en alícuotas y luego se usa en el día de la preparación o inmediatamente se almacena a -80 ° C para su uso en un momento posterior .
Western blot
para el Western blot, 30-50 g de proteína se resolvió más de 8-12% de geles de Tris-glicina y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. En pocas palabras, la membrana se bloqueó y sondó con el conjugado HRP anticuerpo primario y secundario apropiado seguido por quimioluminiscencia y autorradiografía como se describe anteriormente [20].
viabilidad de las células de ensayo
El efecto de delfinidina en la viabilidad celular se determinó por 3- [2-4,5-dimetiltiazol-il] bromuro de tetrazolio ensayo -2,5-difenil (MTT). Las células (NHBE, NCI-H441, A549, y SK-MES-1) se sembraron en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se trataron con 5-100 M concentraciones de delfinidina durante 48 hrs. Se añadió un décimo de volumen de solución 10xMTT (5 mg /ml en PBS) a cada pocillo y se incubó durante 2 horas y la absorbancia se registró en un lector de microplacas a 540 nm después de la solubilización de la reducción de MTT con DMSO. El efecto de delfinidina en la inhibición del crecimiento se evaluó como la viabilidad celular por ciento, cuando se tomaron las células tratadas con DMSO al 100% viables.
El tratamiento de ratones desnudos atímicos
atímicos hembra de cuatro y cinco semanas de edad ( nu /nu) de ratones desnudos fueron adquiridos de National Laboratory NCI-Frederick para la Investigación del cáncer y alojados en condiciones libres de patógenos con unas 12 horas de luz /12 horas de oscuridad calendario de la Facilidad de recursos Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham, en conformidad con la directrices institucional de Cuidado de Animales y el empleo. El protocolo animal utilizado en este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham, y el número de protocolo animal es 120609365. Los animales fueron alimentados con dieta libre fitoquímico AIN-76 PD SEMI (Test dieta, Richmond, IN)
ad libitum
. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con un número fijo de células NCI-H441 (4x10
6 en 50 l de RPMI + 50 l de Matrigel) en cada flanco para iniciar el crecimiento del tumor. Los animales fueron divididos aleatoriamente en tres grupos con 6 animales en cada grupo. El primer grupo de animales recibió una inyección i.p. inyección de DMSO (100 l) y sirvió como control. Los animales del grupo 2 y 3 recibieron una inyección i.p. inyección de delfinidina (1 mg /animal y 2 mg /animal, respectivamente) en 100 l de DMSO tres veces /semana. tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana, y el volumen del tumor se calculó mediante la fórmula ½ (
L
1 ×
L
2 ×
H
) , donde
L
1 es el diámetro de largo,
L
2 es el diámetro corto, y H es la altura del tumor. Todos los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación y la muerte se confirmó por dislocación cervical cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 1.200 mm
3 en el grupo de control. a continuación, se realizaron experimentos similares con SK-MES-1 en las células. Todos los procedimientos realizados fueron de conformidad con las directrices para el uso y cuidado de animales de laboratorio y aprobados por el IACUC.
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia tinción
Se cortaron secciones de cinco micrómetros, en deparaffinized xileno, rehidratada en etanol, y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato. Para la recuperación de antígenos, las secciones se calentaron a 95 ° C durante 30 min en tampón de citrato (pH 6,0). Brevemente, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante específico para 1 hr a temperatura ambiente. A continuación, las secciones se incubaron con solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencideno durante 2 min y de contraste con solución de hematoxilina de Mayer. Para la tinción de inmunofluorescencia después de la recuperación de antígeno, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con Alexafluor-488 anticuerpo secundario marcado durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se montaron con medio de montaje Vectashield que contiene DAPI y se analizaron bajo microscopio de fluorescencia.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± SEM. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante la prueba t de Student. El
p
valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
delfinidina tratamiento inhibe la fosforilación constitutiva e inducida por EGF de EGFR en células NCI-H441
.
activación aberrante y la sobreexpresión de EGFR conduce a la desregulación de las vías cruciales para la proliferación celular, la supervivencia, la progresión del cáncer, la angiogénesis y la metástasis [21] de señalización. sobreexpresan las células NCI-H441 EGFR fueron tratadas con delfinidina (5-60 mM; 3 horas) para determinar su efecto sobre la expresión de EGFR. Como se muestra en la Figura 1A, el tratamiento delfinidina redujo significativamente la expresión y la fosforilación de EGFR en células NCI-H441. Además, la sobreexpresión de su ligando EGF, que activa el EGFR, juega un papel importante en la tumorigénesis de NSCLC [22]. por lo tanto, se determinó el efecto de delfinidina en la fosforilación inducida por EGF de EGFR y encontramos que su tratamiento inhibe la activación inducida por EGF de manera significativa y la fosforilación de EGFR (Figura 1A). Un efecto similar de delfinidina en la fosforilación de EGFR también se observó en SK-MES-1 en las células (datos no presentados). Esto demuestra que delfinidina tratamiento reduce tanto la fosforilación constitutiva y EGF inducida de EGFR.
[A] células NCl-H441 fueron tratados con delfinidina (5-60 mM) durante 3 horas en medio celular completa (panel izquierdo) . En el panel derecho, las células NCl-H441 privadas de suero se trataron con delfinidina (5-60 mM) durante 3 horas y después se incubaron con o sin EGF (50 ng /ml) durante 15 min. Después se recogieron las células de tratamiento y se prepararon lisados celulares y se determinó la expresión de EGFR y fosforilados-EGFR. [B] las células NCl-H441 fueron tratados con delfinidina (5-60 mM) durante 3 horas en medio celular completa (panel izquierdo). En el panel derecho, las células NCl-H441 privadas de suero se trataron con delfinidina (5-60 mM) durante 3 horas y después se incubaron con o sin VEGF (20 ng /ml) durante 30 min. Después se recogieron las células de tratamiento y se prepararon lisados celulares y se determinó la expresión y VEGFR2 VEGFR2 fosforilados. La igualdad de carga de la proteína se confirmó por extracción de la inmunotransferencia y reprobing para β-actina. Las inmunotransferencias se muestran aquí son de un experimento representativo repitió tres veces con resultados similares.
delfinidina tratamiento inhibe la fosforilación constitutiva e inducida por VEGF de VEGFR2 en células NCI-H441
Al igual que en EGFR, la sobreexpresión y la activación aberrante de VEGFR2 también se ha informado en varias células cancerosas, incluyendo NSCLC [23]. Como EGFR, VEGFR2 sufre dimerización y VEGFR fosforilación dependiente de ligando y la activación resultante de desregulación de la señalización aguas abajo. Esto entonces desencadena mitogénica, quimiotáctico, y las señales pro-supervivencia, junto con la estimulación de la formación de vasos del tumor [24]. Por lo tanto, también se evaluó el efecto de delfinidina (5-60 mM; 3 h) sobre la expresión de VEGFR2 en células NCH-H441 y encontramos que su tratamiento redujo significativamente la expresión de VEGFR2 en células NCI-H441 (Figura 1B). Además, la delfinidina tratamiento inhibe la activación inducida por VEGF y la fosforilación de VEGFR2 (Figura 1B). Un efecto similar de delfinidina en la fosforilación de VEGFR2 también se observó en SK-MES-1 en las células (datos no presentados). Estos resultados demuestran claramente que delfinidina tratamiento inhibe la fosforilación constitutiva y inducida por VEGF de VEGFR2.
delfinidina tratamiento inhibe la expresión de la proteína de PI3K y la fosforilación de AKT y MAPK en NCl-H441 y células SK-MES 1-
la resistencia a los inhibidores de EGFR se asocia con la activación de PI3K /AKT y MAPK vías de señalización [25]. EGFR /PI3K /AKT /MAPKs señalización juega un papel fundamental en la tumorigénesis, la proliferación celular mejorada, la angiogénesis y la inhibición de la apoptosis en varios tumores malignos humanos, incluyendo NSCLC [21,26]. Una vez que la señalización /AKT PI3K se activa por EGFR, que fosforila varios objetivos de abajo que participan en los principales procesos celulares incluyendo la proliferación celular y la apoptosis. El tratamiento de delfinidina (5-60 mM; 48 horas) resultó en disminución de la expresión de p85 (una subunidad reguladora) y p110α (una subunidad catalítica) de PI3K en NCI-H441 y SK-MES-1 células (Figura 2A). PI3K regula la fosforilación y la activación de AKT, que promueve la supervivencia celular mediante el bloqueo de las funciones de las proteínas pro-apoptóticas y la promoción de la inducción de las proteínas de supervivencia celular [27]. Como consecuencia de la inhibición de PI3K por delfinidina, la fosforilación de Akt se redujo significativamente en ambos NCI-H441 y SK-MES-1 en las células (Figura 2A).
NCI-H441 y SK-MES-1 en las células [A] fueron tratados con 5-60 delphindin mu M durante 48 horas para determinar su efecto sobre la expresión de proteínas de PI3K, la fosforilación de AKT y MAPK. Después se recogieron las células de tratamiento, se prepararon lisados celulares y la proteína se sometió a SDS-PAGE seguido de análisis de inmunotransferencia y detección de quimioluminiscencia. La igualdad de carga de la proteína se confirmó por extracción de la inmunotransferencia y reprobing para β-actina. Las inmunotransferencias se muestran aquí son de un experimento representativo repetido tres veces con resultados similares. [B] la viabilidad celular de A549, NCI-H441, SK-MES-1 y células NHBE tratados con 5 a 100 mM de delfinidina durante 48 horas, se determinó mediante el ensayo de MTT como se describe en "Materiales y Métodos". Los datos mostrados son la media ± SEM de tres experimentos separados en los que se repetía cada tratamiento en 10 pozos. [C] NCI-H441 y SK-MES-1 células fueron tratadas con 5 a 60 delphindin mu M durante 48 horas para determinar su efecto sobre la expresión de la proteína de PCNA y cyclinD1. Después se recogieron las células de tratamiento, se prepararon lisados celulares y la proteína se sometió a SDS-PAGE seguido de análisis de inmunotransferencia y detección de quimioluminiscencia. La igualdad de carga de la proteína se confirmó por extracción de la inmunotransferencia y reprobing para β-actina. Las inmunotransferencias se muestran aquí son de un experimento representativo repetido tres veces con resultados similares.
La vía MAPK es otra cascada de señalización que es activada por EGFR y juega un papel importante en la regulación de muchas respuestas celulares incluyendo proliferación celular y la apoptosis [28]. La familia MAPKs se compone de tres subgrupos principales: ERK (extracelular regulada por señal de la proteína quinasa), JNK (cinasa c-Jun N-terminal) y p38 MAPK [29]. ERK están principalmente involucrados en la regulación de los factores de proliferación /diferenciación activadas por mitógenos, mientras que JNK y p38 MAPK realizan funciones relacionadas con la muerte celular por apoptosis [30]. Por lo tanto, también se evaluó el efecto de delfinidina en las MAPK señalización en las células NSCLC. Se encontró que delfinidina tratamiento redujo significativamente la fosforilación de ERK1 /2, JNK1 /2 y p38 en ambos NCI-H441 y SK-MES-1 en las células (Figura 2A).
delfinidina tratamiento inhibe el crecimiento de células de NSCLC
Desde la sobreexpresión y la activación aberrante de EGFR y sus vías de señalización aguas abajo es inhibida por delfinidina, examinamos siguiente su efecto sobre la proliferación celular de células de NSCLC mediante el empleo de un ensayo MTT. NSCLC A549, NCI-H441 y SK-MES-1 en las células que sobreexpresan EGFR y VEGFR2 fueron tratados con delfinidina (5-100 M; 48 horas). Los resultados del ensayo MTT demostraron que delfinidina fue eficaz en la inhibición significativamente el crecimiento celular de A549 (4-70%; p & lt; 0,05 a 0,01), NCI-H441 (6-59%; p & lt; 0,05 a 0,01) y SK-MESSAGE 1 células (9-73%; p & lt; 0,05 a 0,01) (Figura 2B). El IC
50 valores de delfinidina se estimaron en 55, 58 y 44 mM para el A549, NCI-H441 y células SK-MES-1, respectivamente. También se examinaron los efectos de delfinidina en el crecimiento del epitelio bronquial humano normal (células NHBE) en condiciones similares y se encontró que estas dosis tienen un efecto marginal en el crecimiento de estas células (Figura 2B).
delfinidina inhibe tratamiento la expresión de la proteína de la ciclina D1 y PCNA en NCI-H441 y SK-MES-1 en las células
las vías de señalización implicadas en la activación de las MAPK también activan varias proteínas nucleares, las cuales juegan un papel crucial en la progresión del ciclo celular de G1 a la fase S. Específicamente, la ciclina D1 se ha identificado como un efector corriente abajo clave de la señalización de EGFR en células de NSCLC resistentes. Además, las células de NSCLC mutante de EGFR tienen una mayor expresión de la ciclina D1 [31]. El tratamiento de células con delfinidina (5-60 micras; 48 horas) NCI-H441 y SK-MES-1 NSCLC resultó en una reducción significativa de la expresión de la proteína ciclina D1 en una forma dependiente de la dosis (Figura 2C). PCNA es un marcador conocido de la proliferación celular activa durante las fases S y G2 del ciclo celular y juega un papel importante en la iniciación de la proliferación celular [32]. El aumento de la expresión de PCNA en pacientes con cáncer se ha asociado con una tasa de supervivencia de los pobres. Además, EGFR también funciona como un factor de transcripción y aumenta la proliferación celular mediante la activación y estabilización de PCNA [33]. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de delphindin sobre la expresión de PCNA y encontramos que redujo significativamente la expresión de la proteína PCNA tanto en NCI-H441 y SK-MES-1 células (Figura 2C).
delfinidina tratamiento modula la expresión de la proteína de la familia Bcl2 , e induce la disociación de caspasas y PARP en NCl-H441 y SK-MES-1 células
La activación de /AKT y MAPK señalización PI3K por los resultados de EGFR en una mayor proliferación celular y la angiogénesis, así como la inhibición de la apoptosis. El tratamiento de EGFR overexpressing células de NSCLC con delfinidina resultó en una inhibición significativa de la PI3K /AKT y MAPK vías de señalización. A continuación examinó los efectos de delfinidina en proteínas de la familia Bcl2 aguas abajo de PI3K /AKT. El tratamiento de NCI-H441 y SK-MES-1 células con delfinidina reduce en gran medida la expresión de proteínas anti-apoptóticas tales como Bcl2, Bcl-xL y MCL-1 (Figura 3A). Además, se encontró que la expresión de proteínas pro-apoptóticas Bak y Bax se incrementó significativamente en delfinidina tratado NCI-H441 y SK-MES-1 células (Figura 3A). La apoptosis es un proceso altamente regulado que involucra una cascada de eventos, incluyendo la activación proteolítica de caspasas. Dentro del proceso de apoptosis caspasas pueden actuar ya sea como los iniciadores o ejecutores. caspasas se activan de ejecutor de su forma pro-enzimática por la acción de otras caspasas dentro de una reacción en cascada. Una vez activada, las caspasas escinden una variedad de proteínas intracelulares, tales como PARP y diferentes proteínas quinasas [34]. Por lo tanto, el próximo examinó si el tratamiento delfinidina (5-60 mM; 48 horas) causó la activación de las caspasas o la escisión de PARP, las cuales son características de la apoptosis. Se encontró que delfinidina tratamiento dio como resultado la activación de la caspasa-9, caspasa-3 y la consiguiente escisión de PARP tanto en NCI-H441 y SK-MES-1cells (Figura 3B)
[A & amp.; B] NCI-H441 y SK-MES-1 células fueron tratadas con 5 a 60 delphindin mu M durante 48 horas para determinar su efecto sobre la expresión de proteínas de la familia Bcl2 y la escisión de las caspasas y PARP. Después se recogieron las células de tratamiento, se prepararon lisados celulares y la proteína se sometió a SDS-PAGE seguido de análisis de inmunotransferencia y detección de quimioluminiscencia. La igualdad de carga de la proteína se confirmó por extracción de la inmunotransferencia y reprobing para β-actina. Las inmunotransferencias se muestran aquí son de un experimento representativo repitió tres veces con resultados similares.
delfinidina tratamiento inhibe la tumorigenicidad de células de NSCLC humanos implantados en ratones desnudos atímicos
Dado que el crecimiento celular reducido efectivamente delfinidina y la apoptosis inducida de células de NSCLC
in vitro
, hemos determinado los efectos de la próxima delfinidina en un
in vivo de xenoinjertos
modelo de ratón implantado con el NCI-H441 o SK-MES-1cells. En ratones desnudos atímicos implantados con EGFR y VEGFR2 que sobreexpresan células de NSCLC, delfinidina tratamiento dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral. ratones tratados delfinidina implantados con células NCI-H441 mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p & lt; ,05-,001) por 27,92 y 45,37% a una dosis de 1 y 2 mg /animal respectivamente, en comparación con el grupo control sin tratar (Figura 4A). El volumen medio del tumor del grupo de control fue de 1268.62 mm
3, mientras que en los grupos tratados delphindin los volúmenes promedio de tumor eran 914.38 mm
3 y 693.01 mm
3 en los ratones que recibieron 1 y 2 mg /animal delfinidina respectivamente (Figura 4A). Además, la delfinidina tratamiento también como resultado la inhibición significativa del crecimiento tumoral en ratones desnudos atímicos implantados con SK-MES-1 células. El tratamiento de delfinidina (1 y 2 mg /animal) dio como resultado la inhibición del crecimiento del tumor 26,34 y 46,01% en comparación con los ratones de control. Estos resultados fueron estadísticamente significativos (p & lt; 0,05 hasta 0,001). el volumen medio de los tumores en los grupos tratados delfinidina se redujo significativamente (913,42 mm
3 y 671.18 mm
3) en comparación con el grupo control no tratado (1241.18 mm
3) (Figura 4B).
[a] Dieciocho atímicos (
nu /nu
) ratones desnudos femeninos fueron inyectados por vía subcutánea con 4x10
6 células NCI-H441 (en RPMI + 50 l 50 l Matrigel) en cada flanco del ratón para iniciar el crecimiento del tumor y luego se divide aleatoriamente en tres grupos (seis ratones en cada uno). Veinticuatro horas después de la implantación de células, los ratones del primer grupo recibieron i.p. inyección de DMSO (100 l) y sirvió como control. Los ratones del grupo 2 y 3 recibieron i.p. inyección de delfinidina 1 mg /animal y 2 mg /animal, respectivamente, en 100 l de DMSO tres veces /semana. [B] Se realizaron experimentos similares con SK-MES-1 en las células. Una vez que los tumores comenzaron a crecer, se midieron sus tamaños y el volumen del tumor se calculó mediante la fórmula ½ (
L
1 ×
L
2 ×
H
), donde
L
1 es el diámetro de largo,
L
2 es el diámetro corto, y
H
es la altura del tumor . Todos los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un volumen de 1.200 mm
3 en el grupo de control. volúmenes promedio de tumor de los grupos tratados delphindin control y se representaron más días después de la inoculación de células tumorales. Los valores representan la media ± SEM. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, y *** p & lt;. 0,001 frente al grupo de control
delfinidina tratamiento inhibe los marcadores de la proliferación e induce la apoptosis en los tumores de ratones desnudos atímicos implantados con células de NSCLC
a continuación, se examinó la expresión de moléculas asociadas con la proliferación celular y la apoptosis en xenoinjertos tumorales mediante el empleo de técnicas de inmunohistoquímica. Como se muestra en la Figura 5, los resultados de análisis histoquímico de secciones de tumores demostraron que hubo una disminución significativa en el número y la intensidad de marcadores de proliferación celular tales como Ki67 y PCNA en los tumores tratados delfinidina en comparación con sus respectivos grupos de control no tratados. Además, cuando se evaluaron estos tumores para la tinción de la caspasa-3 activa, una característica de la apoptosis, se encontró que hubo un aumento significativo en el número y la intensidad de activa la caspasa-3 tinción en los tumores de los ratones tratados delfinidina (Figura 5A y 5B).
ratones desnudos atímicos se les implantó [A] NCI-H441, y [B] SK-MES-1 en las células. Los ratones se trataron con delfinidina, se recogieron tejidos tumorales en 10% de formalina y se prepararon bloques en parafina y la inmunotinción de Ki67, PCNA y escindidos se realiza la caspasa-3 como se describe en "Materiales y Métodos". Fotomicrografías muestran imágenes representativas de tres muestras tumorales independientes. Bar = 20 micras.
delfinidina tratamiento inhibe los marcadores de la angiogénesis en los tumores de ratones desnudos atímicos implantados con células de NSCLC
Los tumores sólidos reclutar nuevos vasos sanguíneos para el crecimiento, el mantenimiento y la metástasis. Por lo tanto, el uso de agentes que inhiben el desarrollo inducida por tumor de nuevos vasos sanguíneos se considera una estrategia importante para el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, muchas de las terapias clínicas actuales se dirigen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y CD31. Tumor secciones teñidas con anticuerpos anti-CD31 anti-VEGF y demostraron una reducción de la intensidad de la tinción en los grupos tratados con delfinidina. Este estudio demostró claramente que delfinidina tratamiento redujo significativamente la expresión de VEGF y CD31 en comparación con secciones de tumores de los ratones de control (Figura 6A y 6B).
ratones desnudos atímicos se les implantó [A] NCI-H441, y [ ,,,0],B] SK-MES-1 células. Los ratones se trataron con delfinidina, se recogieron tejidos tumorales en 10% de formalina y se prepararon bloques en parafina y de inmunofluorescencia de CD31 e inmunohistoquímica de VEGF se llevaron a cabo como se describe en "Materiales y Métodos". Fotomicrografías muestran imágenes representativas de tres muestras tumorales independientes. Bar = 20 micras
Discusión
No ha habido grandes avances en desentrañar los misterios de la genética y la biología del cáncer.; Sin embargo, la tarea más importante es traducir estos descubrimientos en nuevas terapias que mejoren los resultados del paciente. Las terapias dirigidas son el futuro del tratamiento del cáncer y el desarrollo de nuevos inhibidores terapéuticos de moléculas de transducción de señales, en particular, RTK, es el foco de una investigación exhaustiva. La sobreexpresión y la activación aberrante de RTK tales como EGFR y VEGFR2 se asocian con mayores tasas de proliferación, apoptosis reducida, aumento de la angiogénesis y la metástasis [35]. Por tanto, presentan un objetivo atractivo para el desarrollo de fármacos contra el NSCLC [36,37].