Extracto
La exposición de las células a la radiación (IR) ionizante induce, no sólo, la activación de múltiples vías de señalización que desempeñan papeles cruciales en la celda la determinación del destino, sino también la alteración de las vías moleculares implicados en la muerte celular o la supervivencia. Recientemente, la metilación del ADN se ha establecido como un proceso epigenético crítica implicada en la regulación de la expresión génica en células de cáncer, lo que sugiere que la inhibición de la metilación del ADN puede ser una estrategia de tratamiento eficaz del cáncer. Debido a las alteraciones de la expresión génica por la metilación del ADN se han considerado para influir radioresponsiveness, se investigó el efecto de un inhibidor de la ADN metiltransferasa, 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC), en la radiosensibilidad. Además, hemos investigado los mecanismos celulares subyacentes de tratamientos de combinación de la radiación ionizante (IR) y 5-aza-DC en células de cáncer de colon humano. líneas celulares de cáncer de colon se ensayaron inicialmente para sensibilidad a la radiación IR por
in vitro Opiniones y fueron tratados con dos dosis diferentes de 5-aza-DC. La supervivencia de estas líneas celulares se midió utilizando MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) y ensayos clonogénicos. Se examinaron los efectos de la 5-aza-dC junto con la irradiación sobre el crecimiento celular, la distribución del ciclo celular, la apoptosis y la expresión de genes relacionados con la apoptosis. tratamiento de irradiación de combinación con 5-aza-dC disminuyó significativamente la actividad de crecimiento en comparación con el tratamiento de irradiación solo o con 5-aza-dC tratamiento solo. El porcentaje de células HCT116 en la fase sub-G1 y su tasa de apoptosis se incrementó cuando las células fueron tratadas con irradiación en combinación con 5-aza-dC en comparación con cualquiera de los tratamientos solos. Estas observaciones fueron fuertemente apoyados por un aumento de la actividad caspasa, el aumento de las colas de cometa utilizando el ensayo del cometa, y el aumento de los niveles de proteína de moléculas asociadas a la apoptosis (caspasa 3/9, se escindió PARP). Nuestros datos demuestran que el 5-aza-DC radiosensibilidad en células de cáncer de colon mejorada, y los efectos de la combinación de 5-aza-DC con la radiación mostraron mayores efectos celulares que la de un solo tratamiento, lo que sugiere que la combinación de 5-aza-DC y la radiación tiene el potencial de convertirse en una estrategia clínica para el tratamiento del cáncer
Visto:. Kim JG, Bae JH, Kim JA, Heo K, K Yang, Yi JM (2014) Combinación efecto de la regulación epigenética y la radiación ionizante en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (8): e105405. doi: 10.1371 /journal.pone.0105405
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 25 de mayo de 2014; Aceptado: 21 de julio de 2014; Publicado: 19 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por un Plan Nacional de I & amp; D Programa (50596-2014) a través del Instituto de Radiología Dongnam & amp; Ciencias Médicas financiados por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de Corea. Este trabajo también fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación (NRF) y el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación futura (MSIP), el gobierno de Corea, a través de su Programa Nacional de Tecnología Nuclear (2013M2A2A7043665). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la epigenética es el estudio de los cambios heredables en la expresión genética o fenotipo celular causado por mecanismos distintos a los cambios en las secuencias de ADN subyacentes [1]. La regulación epigenética de la expresión génica está mediada por mecanismos tales como la metilación del ADN, las modificaciones de las histonas, y el posicionamiento del nucleosoma lo largo del ADN. Típicamente, la hipermetilación del ADN juega un papel crítico en la inactivación de los genes implicados en la regulación del ciclo celular, reparación del ADN, la apoptosis, la señalización celular, la transcripción, y otros procesos celulares [2].
se observan con frecuencia aberraciones en la metilación del ADN en muchos diferentes tipos de cáncer [3], [4]. En particular, el silenciamiento de genes supresores de tumores u otros genes relacionados con el cáncer por hipermetilación del ADN aberrante en promotor o regiones reguladoras contribuye a la tumorigénesis [5], [6]. A diferencia de las alteraciones genéticas, epigenéticas eventos, incluyendo la metilación del ADN, son reversibles, por lo que la regulación epigenética muy interesante desde el punto de vista del desarrollo de nuevos enfoques para la terapia. la hipermetilación del ADN puede ser revertida por los agentes de ADN-desmetilación. Además, los inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMT) puede restaurar la expresión de genes silenciados por la metilación del ADN. En los últimos años, el inhibidor de DNMT, 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC), se ha demostrado que tienen actividades contra el cáncer en pacientes con leucemia, síndrome mielodisplásico, y varios tumores sólidos [7], [8] . Aunque una sola terapia epigenética no ha mostrado reacciones significativas contra la mayoría de los tumores sólidos [9], los estudios preclínicos sugieren que una combinación de modificadores epigenéticos, como los inhibidores Dnmt o inhibidores de la histona deacetilasa, puede ser eficaz. Además, la combinación de estos modificadores epigenéticos con agentes quimioterapéuticos convencionales también puede ser eficaz. Por lo tanto, este tipo de terapias combinatorias se están estudiando en ensayos clínicos [10], [11]. Sin embargo, algunos informes han investigado radio sensibilidad a la exposición a 5-aza-DC [12] - [15]. Recientemente, ha habido un creciente interés en las estrategias que utilizan sustancias que regulan la radiosensibilidad celular para aumentar la radiosensibilidad del tumor. Por lo tanto, en este estudio, se presenta el potencial terapéutico de la combinación de 5-aza-DC con radiación (IR) ionizante para aumentar la radiosensibilidad en células de carcinoma colorrectal y examinar los mecanismos celulares subyacentes a estos efectos.
Materiales y Métodos
cultivo de células y 5-aza-dC tratamiento
los colorrectal líneas celulares de carcinoma humano: HCT116, SW480, Colo320, y RKO, que se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, VA, EE.UU.), así como a las células de doble knockout (DKO) para ADN metiltransferasa-1 y el ADN metiltransferasa-3b en la línea celular HCT116 [16], que retiene & lt; 5% de metilación del ADN genómico, se cultivaron a 37 ° C con 20 % O
2 y 5% de CO
2. Los HCT116, DKO, y células SW480 se mantuvieron en medio de McCoy 5A (WelGENE, Daegu, Corea). células Colo320 se mantuvieron en medio RPMI (WelGENE). RKO células se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) (WelGENE) que contiene 10% de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) y 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Las células fueron tratadas con 5-aza-DC (0,5 o 1 M; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Una vez al día durante 3 días (Figura S1) guía
irradiación ionizante (IR) la exposición
Las células tratadas con 5-aza-dC por 3 días o células de control no tratados fueron expuestos a los rayos gamma procedentes de una fuente
137 Cs-ray (Eckert & amp; Ziegler, Berlín, Alemania) a una dosis tasa de 2,6 Gy /min. Después de la irradiación a dosis de 2, 5 y 10 Gy, las células se incubaron durante 3 días a 37 ° C, 20% de O
2, y 5% de CO
2.
ensayo clonogénico
HCT116, células SW480, RKO, Colo320, y DKO se sembraron en placas de 6 pocillos (5000 células /pocillo) y se trató con 5-aza-dC e IR. Las células se cultivaron durante 2 semanas. El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco cada 2 días. Las colonias se fijaron y tiñeron con cristal violeta al 1,25%, se lavó extensivamente para eliminar el exceso de tinte, y la imagen utilizando un escáner MultiXpress C9250ND (SAMSUMG, Seúl, Corea). Las colonias con & gt; 50 células /colonias se contaron usando la Imagen-Pro Plus 7.0 del software (Media Cybernetics, Rockville, MD, EE.UU.)
proliferación celular y la viabilidad celular ensayos
La proliferación celular fue. se determina usando el -2,5-difeniltetrazolio ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) (MTT). Las células (2 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 ° C. Después de 48 h, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y ml MTT en PBS se añadieron 5 mg /a cada pocillo durante 4 h. Después de retirar la solución de MTT, una solución de solubilización (dimetil sulfóxido /etanol, 01:01) se añadió a cada pocillo para disolver los cristales de formazán. La absorbancia a 570 nm se midió utilizando un lector de microplacas Paradigm (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.). células HCT116 tratados con 5-aza-dC y /o irradiación se sembraron a una concentración de 5 x 10
4 células /pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 24, 48, 72 y 96 h, las células se recogieron, se diluyeron con una solución de trabajo azul de tripano, y se contaron para generar una curva de crecimiento.
El crecimiento del tumor análisis
En
la evaluación in vivo
del crecimiento del tumor, se utilizó un modelo SCID portadores de tumores de xenoinjerto subcutáneo de ratón generado mediante la infección de células. C.B-17 ratones SCID hembras fueron comprados del Laboratorio Central. Animales (Seúl, Corea). Seis ratones hembra semana de edad se dividieron en grupos experimentales (n = 3 en cada grupo). Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea en el lado derecho de la zona dorsal con 5 × 10
6 células diluidas en 100 l de PBS. Los volúmenes de los tumores se midieron una vez por semana. El volumen del tumor se calculó utilizando la siguiente ecuación: (eje corto)
2 x (eje largo) x 0,5
El análisis de citometría de flujo
Análisis del ciclo celular se realizó utilizando yoduro de propidio (PI. ). Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, y se fijaron en 75% de etanol a 4 ° C durante 1 h. Antes del análisis, las células se lavaron de nuevo con PBS, se suspendieron en una solución de PI fría con 1 mg /ml de RNasa, y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un instrumento FACScan (BD FACSAria; BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). La apoptosis de las células tratadas se evaluó mediante una anexina V /kit de detección de apoptosis FITC (BD Biosciences). En resumen, todas las células se sembraron y se trató en platos de 100 mm. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS frío. Las células fueron teñidas con ficoeritrina (PE) anexina V y 7-amino-actinomicina y se incubaron durante 15 min en la oscuridad. Después de la tinción, se añadió tampón de unión a las células, que fueron analizados utilizando el instrumento FACScan. software FACSDiva (BD Biosciences) se utilizó para el análisis de datos.
caspasa 3/7 ensayo de la actividad
Para el ensayo de actividad de caspasa 3/7, las células (5 × 10
3 células ) se sembraron con 100 l de medio de McCoy 5A en una placa de 96 pocillos. Después de 24 h de incubación, 100 l de la 3/7 kit de ensayo de la caspasa-Glu (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de sustrato y tampón de mezcla se añadieron a cada pocillo. Las células y las soluciones se mezclaron suavemente durante 30 min y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. actividad de fluorescencia se midió utilizando un luminómetro (ATTO, Tokio, Japón). Todos los ensayos se repitieron tres veces y contenían controles negativos.
se determinó el daño del ADN de ensayo
daños en el ADN utilizando el OxiSelect Comet Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, EE.UU.). células HCT116 tratados con IR 5-aza-dC- y /o (1 × 10
5) se mezclaron con agarosa de bajo punto de fusión (relación 1:10), y luego la diapositiva cometa se llenó con 75 l de la mezcla. Los portaobjetos se incubaron a 4 ° C durante 30 min y después se sumergen en tampón de lisis a 4 ° C en la oscuridad durante 1 h. A continuación, el tampón de lisis se aspiró de diapositivas, y portaobjetos se sumergió en una solución alcalina a 4 ° C en la oscuridad durante 30 min. A continuación, para eliminar la solución alcalina, las diapositivas se almacenan en tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE) durante 5 min. Los portaobjetos se colocaron en una cámara de electroforesis horizontal y se sometieron a electroforesis con tampón TAE a 25 V durante 20 min. Los portaobjetos se secaron y se tiñeron con colorante de ADN (célula Biolabs). colas de los cometas se detectaron bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon, Tokio, Japón).
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en tampón de lisis, y los lisados totales de células que contienen cantidades iguales de proteínas se cargaron en 4-12% de geles de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y después se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche disuelta en PBS que contiene 0,02% de Tween-20 y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios específicos. Las membranas se incubaron a continuación con peroxidasa de rábano picante específico anticuerpos secundarios conjugados. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sistema de fusión FX5 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Alemania). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-exfoliados caspasa 3 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), anti-exfoliados caspasa 9 (Cell Signaling Technology), anti-troceados (Cell Signaling Technology) PARP1, anti-survivina (Abcam , Cambridge, MA, EE.UU.), anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.), y anti-α-actina (Sigma-Aldrich).
El análisis estadístico
Los resultados fueron presentados como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando de Student
t-test
. Un
P
-valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Declaración de Ética
Todos los animales protocolos utilizados en el presente estudio fueron revisados y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de Dongnam Instituto de Radiología & amp; Ciencias Médicas (dirams-CICUAL-11-005).
Resultados
Efectos de 5-aza-DC sobre la radiosensibilidad de las líneas celulares de cáncer colorrectal
Para determinar si 5 -aza-dC aumenta la sensibilidad celular a IR, el cáncer de colon líneas celulares HCT116, SW480, RKO, Colo320, y DKO fueron expuestos a 5-aza-dC a dos dosis diferentes (0,5 mM y 1 mM) durante 72 h antes de ser se expone a tres dosis diferentes de IR (2 Gy, 5 Gy y 10 Gy) (Figura S1). A continuación, un ensayo clonogénico se realizó demostrando que 5-aza-dC podría radiosensibilizar todas las líneas celulares de cáncer de colon analizados, y la combinación de 5-aza-dC y IR era superior al tratamiento de 5-aza-dC solo. células DKO, genéticamente inhiben DNMT1 y 3b, mostró también la supresión del crecimiento por IR con forma dependiente de la dosis (Figura 1A).
(A) ensayo clonogénico de HCT116, las células SW480, Colo320, y RKO tratadas con 5-aza -dC (0,5 y 1 M) y /o IR (2 Gy, 5 Gy y 10 Gy). ensayo clonogénico de irradiado (2 Gy, 5 Gy y 10 Gy) células DKO. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (5000 células /pocillo) y se trataron con 5-aza-dC /IR. Después de 2 semanas, los cultivos se fijaron con etanol y se tiñeron con 1,25% de cristal violeta. También se muestran fotografías de colonias individuales. (B-E) fracción de supervivencia (SF) de HCT116 /DKO (B), SW480 (C), Colo320 (D) y células RKO (E) tratados con 5-aza-dC (0,5 y 1 M) y /o ionizante radiación (IR; 2 Gy, 5 Gy y 10 Gy). El SF se calcula como media de colonias /células sembradas. La relación de mejora de la dosis se calculó como la relación de la curva de SF obtenido por tratamiento con una combinación de 5-aza-dC y IR a la obtenida por el tratamiento con IR solo. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
P
-valores se calcularon utilizando Estudiante de
t-test
. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P
. & Lt; 0,001
curvas de supervivencia de radiación se generaron para cada línea celular tratados con 5-aza-DC e IR para entender si la irradiación puede sensibilizarse por 5 -aza-dC en líneas celulares de cáncer de colon (Figura 1B-E). El uso de la dosis requerida para generar una fracción de supervivencia (SF) de 0,5 como referencia, se calcularon las tasas de mejora de la dosis (Ders). Las células tratadas con 5-Aza-dC durante 72 h antes de la irradiación mostraron un aumento en la radiosensibilidad, con una DER de: 1,19 (0,5 M 5-aza-dC) y 1,41 (1 M 5-aza-dC) en células HCT116, 1,23 (0,5 M 5-aza-dC) y 1,42 (1 M 5-aza-dC) en células SW480, 1,23 (0,5 M 5-aza-dC) y 1,28 (1 M 5-aza-dC) en células Colo320, y 1,14 (0,5 M 5-aza-dC) y 1,31 (1 M 5-aza-dC) en células RKO (Figura 1B-e). Nuestros datos sugieren que una dosis más baja de 5-aza-DC podría radiosensibilizar células de cáncer colorrectal. Debido a 1 M 5-aza-DC o 10 Gy de IR son citotóxicos, dosis relativamente bajas de 5-aza-DC (0,5 M) e IR (2 Gy y 5 Gy) fueron elegidas para realizar nuevos estudios para examinar los efectos de la combinación de una inhibidor de DNMT, 5-aza-dC y IR.
La combinación de 5-aza-dC y IR inducida por la supresión del crecimiento en células de cáncer de colon
Se analizó la proliferación celular en las células HCT116 tratados con 5 -aza-dC o IR solo o con la combinación de 5-aza-dC y IR. Las curvas de crecimiento mostraron que el tratamiento con una combinación de 5-aza-dC y IR (2 Gy y 5 Gy) dio como resultado la inhibición estadísticamente significativa del crecimiento en células HCT116 y SW480 en cada punto de tiempo examinado (24, 48, 72, y 96 h ) en comparación con la de las células control, en las células tratadas únicamente con 5-aza-dC, o en las células tratadas solamente con IR (2 Gy y 5 Gy) (Figura 2A;
P
& lt; 0,05). Además, se llevó a cabo el ensayo de MTT en células HCT116 y SW480 que habían sido tratadas con o sin 5-aza-dC (0,5 M) y luego se irradia con 2, 5, y 10 Gy, respectivamente. La absorbancia del ensayo realizado en las células tratadas con una combinación de 5-aza-dC y IR fue significativamente menor (
P
& lt; 0,05) que la de las células tratadas con 5-aza-dC o IR por sí solo ( Figura 2B). También se realizó análisis de la curva de crecimiento y el ensayo de MTT en células DKO, que también mostraron una disminución de la supresión del crecimiento, así como la proliferación, en función de la dosis de radiación (Figura 2A y B). Por lo tanto, estos resultados indican que los efectos de la 5-aza-dC y IR en la inhibición del crecimiento son aditivos. Sobre la base de nuestra
in vitro
datos de inhibición significativa del crecimiento en las células tratadas con la combinación de 5-aza-DC e IR, estábamos interesados en determinar si estos efectos podrían ser observados
in vivo
. Con este fin, las células HCT116 se expusieron a 5-aza-dC (0,5 M) durante 72 h antes de la exposición a IR (2 Gy y 5 Gy), y luego se inyectan por vía subcutánea en ratones SCID. Figura 2C mostró retrasó significativamente el crecimiento del tumor con el tratamiento de combinación de 5-aza-dC y IR (2 Gy y 5 Gy) en comparación con el tratamiento solo, ya sea con 5-aza-dC o IR. Además, el volumen de los xenoinjertos de células tratadas con tanto 5-dC-aza e IR se redujeron en comparación con los de las células tratadas con 5-aza-dC o IR solo
.
(A) el crecimiento de la célula curvas obtenidas usando 0,5 M 5-aza-dC y dos dosis diferentes de radiación (2 Gy y 5 Gy) en células de cáncer de colon (HCT116, DKO y SW480) y (B) ensayos de MTT en células de cáncer de colon tratados con 5-aza-dC (0,5 M) y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de tres experimentos. (C) El crecimiento del tumor después del tratamiento 5-aza-dC (0,5 M) y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy) en ratones SCID. células HCT116 (5 × 10
6 células) que habían sido tratados con 5-aza-dC (0,5 M) y se irradió (2 Gy y 5 Gy) se inyectaron por vía subcutánea en ratones SCID (n = 4), y el promedio el tamaño del tumor se midió una vez por semana durante 7 semanas.
P
-valores se calcularon utilizando Estudiante de
t-test
. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
Para dilucidar los mecanismos de inhibición del crecimiento por 5-aza-DC, IR y el tratamiento de combinación, se utilizó citometría de flujo para determinar la inhibición del crecimiento si se asoció con cambios en el ciclo celular. análisis de la distribución del ciclo celular mostró que la proporción de las células tratadas en la G1, S, y las fases G2-M no fue diferente de las células de control, excepto que hubo un aumento en la proporción de células en la fase sub-G1, lo que sugiere un aumento en la apoptosis (Figura 3). La proporción de células HCT116 tratados con 5-aza-dC o IR (2 Gy) sola en la fase sub-G1 de las células era ocho veces (5-aza-dC), dos veces (IR, 2 Gy), y cuatro veces (5 Gy) mayor que la de las células de control y más de ocho veces mayor en las células tratadas con 5-aza-dC y IR que en las células de control. Curiosamente, a diferencia de las células HCT116, SW480 células mostraron G2 /M detención después de IR por sí solo (2 Gy y 5 Gy) en comparación con los controles [2-Gy G2 /M fracción: 46,77% (frente a 28,03% en las células de control); 5 Gy G2 /M fracción: 58,88% (vs. 22,03% en las células de control)]. Sin embargo, la fase sub-G1 de las células tratadas con 5-aza-dC o IR (2 Gy) sola fue seis veces (5-aza-dC), dos veces (2 Gy), y siete veces (5 Gy) mayor que las células de control y un exceso de 19 veces aumento en las células tratadas con 5-aza-dC y IR que en las células de control. También confirmó que la fase sub-G1 de las células irradiadas con 2 Gy o 5 Gy en comparación con las células control se incrementó en las células DKO. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que los efectos inhibidores del crecimiento de 5-aza-DC o del IR se deben a un aumento de la apoptosis.
células de cáncer de colon (HCT116, DKO y SW480) tratados con 5-aza-DC (0,5 M) y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy) se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron usando un citómetro de flujo FACS. Columnas muestran la proporción de células en cada fase del ciclo celular. columna de negro, la fase sub-G1; brillante columna gris, fase G1; oscura columna gris, fase S; columna blanca, la fase G2-M.
La combinación de 5-aza-DC e IR contribuye a la inducción de la apoptosis en células de cáncer de colon
Para aclarar la inducción de la apoptosis por 5-aza-dC en combinación con IR en las células HCT116 y SW480, las células se tiñeron con doble isotiocianato de fluoresceína marcado con anexina V y PI. El nivel de apoptosis inducida por 5-aza-dC en combinación con IR era mayor que por IR (1,7 veces para 2 Gy o 1,8 veces para 5 Gy) o 5-aza-dC solo (& gt; 2,4 veces) en HCT116 Células. Curiosamente, se observó resultados similares en los niveles de apoptosis elevadas inducidas por el tratamiento de combinación con 5-aza-dC y IR en comparación con IR (3,4 veces para 2 Gy o 2,4 veces para 5 Gy) o 5-aza-dC (& gt; 1,5 veces) solo en las células SW480 (Figura 4A). Por otra parte, hemos investigado los mecanismos celulares subyacentes a los efectos apoptóticos de la combinación de 5-aza-DC e IR. Una de las cascadas de señalización más comunes implicadas en la apoptosis es la activación de la familia altamente apoptosis específica de las caspasas, que, una vez activados, iniciar la muerte celular escindiendo y activando las caspasas efectoras apoptosis [17] de conducción. Para determinar si las caspasas mediada los efectos de la 5-aza-dC y IR, que mide la actividad de las caspasas 3 y 7, que son efectores clave de la apoptosis en células de mamífero [18]. En ambos extractos de células tratadas con 5-aza-dC y IR, ya sea solo o en combinación, las actividades de las caspasas 3 y 7 se incrementaron en gran medida en las células tratadas con 5-aza-dC y IR (2 Gy y 5 Gy) en comparación con los de las células tratadas con IR o 5-aza-dC solo (Figura 4B). Estos resultados se corresponden con un aumento en la apoptosis causada por el tratamiento de combinación de 5-aza-dC y IR y se muestra en la Figura 4A. En ambos análisis, también se demostró que las células DKO aumentar el nivel de apoptosis por IR. Estos resultados están fuertemente apoyados por colas de los cometas más largos observados en el ensayo del cometa, lo que indica una mayor cantidad de daño en el ADN celular en células tratadas con una combinación de 5-aza-DC e IR en comparación con las células de control o células tratadas con 5-aza-DC o IR sola (Figura 4C y D).
(a) Los niveles de apoptosis se midió utilizando anexina V y 7-amino-actinomicina y se analizaron utilizando un FACS citómetro de flujo. Los niveles de apoptosis en HCT116, las células DKO y SW480 tratadas con 5-aza-dC (0,5 M) y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy) se expresaron como porcentajes de la población total de células en las etapas tempranas y tardías de apoptosis. (B) Las actividades de las caspasas 3 y 7 se determinaron utilizando el ensayo de caspasa-Glo y estaban representados como porcentajes de HCT116, DKO y células SW480 tratadas con 5-aza-DC (0,5 M) y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy) en comparación con las células no tratadas. El gráfico representa los datos (media ± desviación estándar) de tres experimentos independientes. (C) micrografías representativas de la mancha de ADN fluorescente utilizando el ensayo cometa. la fragmentación del ADN mediante el ensayo de cometa en HCT116, las células SW480 y DKO trató con 0,5 M 5-aza-dC y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy). (D) La cuantificación de células con el ADN dañado representa la media de tres campos microscópicos al azar por muestra, y las barras de error representan ± desviaciones estándar. NS: no significativo.
P
-valores se calcularon utilizando Estudiante de
t-test
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Las caspasas 3 y 9 también se sabe que están implicados en la apoptosis inducida por la radiación [19]. Por lo tanto, se utilizó el Western Blot para confirmar los niveles de activación de las caspasas 3 y 9 en las células tratadas con 5-aza-dC y /o IR. La Figura 5 muestra los niveles más altos de las caspasas activadas 3 y 9 en HCT116, DKO, y células SW480 tratadas con 5-aza-dC o IR solo en comparación con los de las células de control. Curiosamente, el Western Blot, en los tres, probado líneas celulares de cáncer de colon, revelaron que los niveles de proteína de las caspasas 3 y 9 también se incrementaron en las células tratadas con una combinación de 5-aza-dC y IR en comparación con las células tratadas con cualquier agente solo o en células controles. El nivel de PARP1 escindido, que es otro efector clave de la inducción de la apoptosis [20], [21], fue también aumentó en las células tratadas con 5-aza-dC o IR solo en comparación con las células de control, y aún más aumentó en las células tratadas con una combinación de 5-aza-dC y IR. Por el contrario, los niveles de expresión de proteínas de survivina se redujeron en células tratadas con 5-aza-dC y IR solo y en combinación en comparación con los de las células de control. Además, hemos probado el nivel de p53 también. Curiosamente, el nivel de expresión de p53 aumentó en las células tratadas con una combinación de 5-aza-dC y IR que en las células tratadas con 5-aza-dC solo. Estos datos están de acuerdo con el informe anterior, que es las células que expresan de tipo salvaje de p53 son IR mejor sensibles que los de tipo mutante de p53 [14]. Estos patrones de expresión de proteínas fueron confirmados en las células irradiadas DKO. En conjunto, nuestros datos sugieren que la combinación de 5-aza-dC y IR induce sinérgicamente un mayor nivel de apoptosis en comparación con el tratamiento solo con 5-aza-dC o IR en varias células de cáncer de colon.
Western blot análisis para la expresión de proteínas de apoptosis asociada (exfoliados caspasa 3, caspasa escindido 9, PARP1 troceados, survivina, y p53) en células HCT116 y SW480 tratadas con 5-aza-dC (0,5 M) y /o irradiación (2 Gy y 5 Gy), así como en las células irradiadas DKO, utilizando exfoliados caspasa 3, caspasa 9 escindida, PARP1 troceados, survivina, y anticuerpos p53.
Discusión
resultados de la exposición en IR la activación simultánea o regulación a la baja de las múltiples vías de señalización que desempeñan un papel crítico en el control de tipo de células específicas de la supervivencia o la muerte. IR es un agente genotóxico conocido carcinógeno humano y que induce daño celular a través de mecanismos directos e indirectos [22]. Recientemente, muchos estudios se han centrado en las moléculas y procesos que influyen en la respuesta de las células a IR. Se conocen muchos tipos diferentes de moléculas para aumentar la radiosensibilidad por que afectan a los puntos de control del ciclo celular, reparación del ADN, la transcripción de genes, y la apoptosis. Los estudios más recientes han sugerido que los mecanismos epigenéticos tales como la modificación de histonas y la metilación del ADN están asociados con el silenciamiento de genes y pueden estar implicados en la regulación de la radiosensibilidad en células de cáncer. Un número de estudios previos han informado de que varios inhibidores de histona deacetilasa son citotóxicos y pueden sensibilizar células tumorales a la radioterapia. Sin embargo, la escasa información disponible sobre los efectos de los inhibidores Dnmt en radiosensibilización [13], [23]. Por otra parte, 5-aza-dC se ha demostrado que tiene poca actividad en tumores sólidos como un solo agente [24], [25], y se sabe poco sobre los mecanismos moleculares o celulares que subyacen a la radiosensibilidad inducida por los inhibidores de epigenéticos. La combinación de fármacos epigenéticos con radioterapia es particularmente interesante, en este contexto, y ha demostrado una eficacia mejorada tanto
in vitro
y
in vivo
en varios tumores sólidos [13] - [15], [26 ]. En el presente estudio, hemos investigado los efectos celulares del inhibidor DNMT, 5-aza-DC, e IR, tanto sola como en combinación, en las células de cáncer de colon. Se encontró que el 5-aza-dC demostró efectos aditivos sobre la inhibición del crecimiento en combinación con IR, lo que sugiere que el 5-aza-dC podría ser un sensibilizador a la radiación útil en el tratamiento del cáncer de colon. Una cosa que debemos tener en cuenta más sobre la base de nuestros resultados, células DKO, sistema modelo genético para la inhibición de la ADN metiltransferasa, no parecen tener más fuerte efecto supresor del crecimiento con IR de utilizar sistema de modelo farmacológico que se trataron 5-aza-DC con IR
.
Dado que nuestros resultados indican que este efecto es mediado por la inducción de la apoptosis, la apoptosis ha sido considerada previamente como un mecanismo potencial para radiosensibilización. Varios resultados diferentes se han comunicado en relación con los efectos de los inhibidores de radiosensibilizadores DNMT. Dote et al. informó previamente que la combinación de IR y zebularine no aumentó significativamente la apoptosis [13]. Por el contrario, Qiu et al. demostró que el 5-aza-DC radiosensibilización inducida en ciertas líneas celulares de cáncer gástrico y provocó un aumento de la apoptosis, que fue acompañado por una mayor expresión de
p53
,
RASSF1
, y
DAPK
familias de genes [14]. En nuestro estudio, 5-aza-DC aumentó el nivel de apoptosis en las células HCT116 y SW480, un hallazgo consistente con los resultados de Qiu et al. Muy interesantemente, Qiu et al. también sugirieron que las líneas celulares de cáncer gástrico que expresan p53 de tipo salvaje son más sensibles a la terapia de combinación con IR y 5-aza-dC en comparación con los que expresan p53 mutante. La línea celular HCT116 utilizado en este estudio expresa p53 de tipo salvaje, y se observó que el nivel de p53 aumentó en respuesta a la 5-aza-dC tratamiento con y sin IR. Además, el nivel de expresión de p53 aumentó en las células tratadas con una combinación de 5-aza-dC y IR que en las células tratadas con 5-aza-dC solo. Sin embargo, a diferencia de las células HCT116, ningún efecto se muestra en el nivel de p53 en las células SW480, que expresa p53 de tipo mutante (Figura 5). p53 ha sido descrito clásicamente como un mediador de la citotoxicidad de IR y actúa mediante la promoción de ya sea la detención del ciclo celular o la apoptosis [27], [28]. Estudios previos han informado de que el 5-aza-dC induce la expresión de p53, que se asocia con la inhibición de la proliferación celular en las células p53 de tipo salvaje, pero no en las células mutantes de p53 en el cáncer de próstata [29], [30]. Sin embargo, debido a que sólo unas pocas líneas de células y moléculas p53 asociada fueron examinados en estos estudios, investigaciones adicionales sobre la posible asociación de la 5-aza-DC con p53 es necesaria. También se requiere más investigación para identificar las alteraciones epigenéticas adicionales asociados con la radiosensibilidad. Hay estudios limitados sobre el papel de la metilación del ADN en la resistencia a IR. Un estudio anterior indicaba que el tratamiento con 5-aza-dC causa hipometilación global, que tiene un efecto radiosensibilizador [23]. Por lo tanto, deben llevarse a cabo estudios definitivos para determinar si IR tiene un efecto en la metilación del ADN específica de sitio o de genes específicos en el cáncer (manuscrito en preparación)
.
En este estudio, el análisis del ciclo celular no se alteró significativamente por la sola