Extracto
La amigdalina, un compuesto natural, ha sido utilizado por muchos pacientes con cáncer como un enfoque alternativo para el tratamiento de su enfermedad. Sin embargo, si es o no realmente esta sustancia ejerce un efecto antitumoral nunca ha sido resuelto. Un estudio in vitro fue iniciado para investigar la influencia de la amigdalina (1,25 a 10 mg /ml) sobre el crecimiento de un panel de líneas celulares de cáncer de vejiga (UMUC-3, RT112 y TCCSUP). El crecimiento tumoral, la proliferación, el crecimiento clonal y la progresión del ciclo celular se investigaron. La regulación del ciclo celular proteínas CDK1, CDK2, CDK4, ciclina A, ciclina B, ciclina D1, p19, p27, así como el objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) señales relacionadas phosphoAkt, phosphoRaptor y phosphoRictor se examinaron. dependiente de la dosis amigdalina redujo el crecimiento y la proliferación en todas las líneas celulares de cáncer de vejiga tres, que se refleja en un retraso significativo en la progresión del ciclo celular y la detención G0 /G1. Evaluación molecular reveló disminuida phosphoAkt, phosphoRictor y la pérdida de los componentes de CDK y ciclina. Dado que se observaron los efectos más destacados de la amígdala en la CDK2-ciclina A eje, siRNA derribar los estudios se llevaron a cabo, dejando al descubierto una correlación positiva entre CDK2 /ciclina A nivel de expresión y el crecimiento del tumor. La amígdala, por lo tanto, puede bloquear el crecimiento tumoral mediante la modulación de CDK2-ciclina abajo y A. En la investigación vivo deben seguir para evaluar el valor práctico de la amígdala como un fármaco antitumoral
Visto:. Makarević J, J Rutz, Juengel E , Kaulfuss S, M Reiter, Tsaur I, et al. (2014) La amígdala Bloques cáncer de vejiga Crecimiento Celular
in vitro fotos: por disminución de ciclina A y CDK2. PLoS ONE 9 (8): e105590. doi: 10.1371 /journal.pone.0105590
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 22 de abril de 2014; Aceptado: 23 de julio de 2014; Publicado: 19 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Makarevic et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el "Brigitta und Norbert Muth Stiftung" (http://www.muth-stiftung.de) y el "Freunde und der Goethe Förderer -Universität Frankfurt "(http://www2.uni-frankfurt.de). La financiación fue recibido por el RAB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de vejiga es el segundo tumor maligno más común del tracto genitourinario en los países occidentales, con una incidencia de 37,9 /100.000 por año para los hombres y 9,6 /100.000 por año para las mujeres [1]. Aproximadamente el 70% de los tumores inicialmente diagnosticados son superficiales y pueden ser tratados mediante resección transuretral, con lo que se preserva la vejiga. El 30% restante de los tumores se vuelven músculo invasivo y se asocian con un alto riesgo de metástasis [2]. Para los pacientes con enfermedad localmente avanzada o metastásica, la quimioterapia es una opción de tratamiento. Sin embargo, el pronóstico de los pacientes con metástasis sigue siendo pobre, con una supervivencia media de 14 meses y una tasa de supervivencia a 5 años del 15% [3].
Más del 50% de los pacientes de cáncer en Europa uso complementario /medicina alternativa (CAM) en lugar de, o en combinación con terapia convencional [4]. La insatisfacción con el tratamiento convencional y la reducción de efectos secundarios de quimioterapia son las razones más comunes dadas por el uso de CAM [5], [6]. Sin embargo, aunque el uso de CAM es muy popular entre los pacientes con cáncer, en beneficio basada en la evidencia a partir de compuestos de base natural es insuficiente. La discrepancia entre el uso de un producto natural y el conocimiento sobre sus propiedades anti-tumorales se refleja sobre todo en el caso de la amígdala. La amígdala (D-mandelonitrilo-β-gentiobiósido) es un diglucósido cianogénico presente en las semillas de muchos frutos y en numerosas plantas pertenecientes a la familia de las rosáceas, como Prunus persica (melocotón), Prunus armeniaca (albaricoque) y Prunus amygdalus amara (almendra amarga ). El término "laetrilo" se utiliza con frecuencia como sinónimo de la amígdala. Sin embargo, laetrilo es estructuralmente diferente del compuesto madre, la amígdala, y es un acrónimo (levógiro y mandelonitrilo) para una forma purificada, semi-sintético de la amigdalina. La presente investigación emplea "amígdala".
La amígdala fue uno de los más populares, los tratamientos no convencionales contra el cáncer en la década de 1970. En 1978, 70.000 pacientes con cáncer de Estados Unidos habían utilizado la amigdalina para tratar su cáncer [7]. Aún así, la investigación basada en la evidencia en la amígdala es escasa y su beneficio controvertido. Los defensores consideran que la amígdala una cura natural del cáncer, mientras que los opositores advierten que la amígdala es ineficaz e incluso tóxicos. Aunque se ha argumentado que la amígdala no es seguro, no presenta toxicidad aguda grave ha sido encontrado. También se ha llegado a la conclusión de que la amígdala no tiene potencial anti-tumoral, aunque a partir de 368 pacientes con cáncer que figuran en una revisión, el 12,5% experimentaron una respuesta completa o parcial, 6.8% tenían enfermedad estable y el 22,9% demostró un beneficio sintomático de la amígdala [8]. Para obtener una idea de cómo podría funcionar la amígdala, se inició una investigación in vitro para determinar su influencia en el crecimiento y la proliferación del cáncer de vejiga. Además, la progresión del ciclo celular y la regulación del ciclo celular proteínas se evaluaron en amigdalina células tratadas y no tratadas. siRNA derribar los estudios se llevaron a cabo para explorar proteínas alteradas por la amigdalina, lo que puede tener relevancia clínica.
Los datos in vitro presentados aquí apuntan a un crecimiento y proliferación efectos de la amigdalina de bloqueo significativa, probablemente inducida por una disminución de la la regulación del ciclo celular proteínas CDK2 y ciclina A.
Materiales y Métodos
cultivo de células
RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Alemania) y TCCsup (DSMZ, Braunschweig, Alemania) células de carcinoma de vejiga se cultivaron y se subcultivaron en medio RPMI 1640, 10% suero de ternera fetal (FCS), mM tampón HEPES 20, 1% glutamax y 1% de penicilina /estreptomicina (todos: Gibco /Invitrogen; Karlsruhe , Alemania). RT112 es un modelo moderadamente diferenciado (grado 2/3) de cáncer de vejiga invasivo humana (patológica en estadio T2), mientras que TCCsup es un carcinoma de células transicionales, de grado 4. UMUC-3 representa un alto grado 3, el cáncer de vejiga invasivo. Se utilizaron subcultivos de pasajes 7-24.
amigdalina tratamiento
amigdalina de huesos de albaricoque (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) estaba recién disuelto en medio de cultivo celular y se añadió a las células tumorales en concentraciones que van desde 1,25 hasta 10 mg /ml. Controles permanecieron sin tratar. En todos los experimentos, los cultivos de células tumorales tratadas se compararon con los cultivos no tratados. Para evaluar los efectos tóxicos de la amígdala, la viabilidad celular se determinó por el azul de tripano (Gibco /Invitrogen). Para la evaluación de la apoptosis se determinó la expresión de anexina V /yoduro de propidio (PI), utilizando el Annexin V-FITC de detección de apoptosis kit (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania). Las células tumorales se lavaron dos veces con PBS, y después se incubaron con 5 l de anexina V-FITC y 5 l de PI en la oscuridad durante 15 min a TA. Las células se analizaron en un citómetro de (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). El porcentaje de células apoptóticas (temprana y tardía) en cada cuadrante se calculó utilizando el software CellQuest (BD Biosciences).
Medición del crecimiento y proliferación de células tumorales
El crecimiento celular se evaluó mediante la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) bromuro (MTT) ensayo de reducción de colorante -2,5-difeniltetrazolio (Roche Diagnostics, Penzberg, Alemania). Las células tumorales (100 l, 1 × 10
4 células /ml) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Después de 24, 48 y 72 h, se añadió MTT (0,5 mg /ml) durante 4 h adicionales. Posteriormente, las células se lisaron en un tampón que contiene 10% de SDS en HCl 0,01 M. Las placas se incubaron a continuación durante la noche a 37 ° C, 5% de CO
2. La absorbancia a 570 nm se midió para cada pocillo utilizando un lector de ELISA de microplacas. Cada experimento se realizó por triplicado. Después de restar la absorbancia de fondo, los resultados se expresaron como media del número de células.
La proliferación celular se midió utilizando una proliferación de células BrdU inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) kit (Calbiochem /Merck Biosciences, Darmstadt, Alemania). Las células tumorales, sembradas en placas de microtitulación de 96 pocillos, se incubaron con 20 l solución de BrdU-etiquetado por pocillo durante 8 h, se fijaron y se detectaron utilizando mAb anti-BrdU de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 450 nm.
ensayo clonogénico
Las células del tumor, tratados previamente con la amígdala durante 2 semanas, se transfirieron a placas de 6 pocillos a 300 células por pocillo. Después de 10 días de incubación, durante el cual las células fueron o bien expuestos a la amigdalina o no, las colonias se fijaron y se contaron. Las colonias de al menos 50 células fueron contadas como una sola.
Análisis del ciclo celular
Análisis del ciclo celular se llevó a cabo con células tumorales subconfluentes. poblaciones de células tumorales se tiñeron con yoduro de propidio, el uso de un ensayo de ciclo más kit de reactivo de ADN (BD Pharmingen) y después se sometieron a citometría de flujo con un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). 10.000 eventos se recogieron para cada muestra. La adquisición de datos se llevó a cabo utilizando el software Cell-Quest y la distribución del ciclo celular se calculó utilizando el software ModFit (BD Biosciences). El número de células cerradas en el G1, G2 /M o la fase S se presenta como%.
Western blotting
Para investigar proteínas implicadas en la regulación del crecimiento celular, lisados de células tumorales se aplicaron a un gel de poliacrilamida al 7% y se sometió a electroforesis durante 90 min a 100 V. La proteína luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después del bloqueo con leche en polvo no grasa durante 1 h, las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos monoclonales dirigidos contra las proteínas del ciclo celular: Cdk1 (IgG1, clon 1), CDK2 (IgG2a, clon 55), cdk4 (IgG1, clon 97), ciclina A (IgG1, clon 25), ciclina B (IgG1, clon 18), ciclina D1 (IgG1, clon G124-326), p19 (IgG1, clon 52 /p19), p27 (IgG1, clon 57; todo: BD Pharmingen ). El objetivo de mamíferos de la vía de la rapamicina (mTOR) se investigó mediante el uso de los siguientes anticuerpos monoclonales anti fosfo Rictor (Prictor; IgG, Thr1135, clon D30A3), anti fosfo Raptor (pRaptor; IgG, Ser792; ambos: New England Biolabs, Frankfurt, Alemania), anti fosfo Akt (pAkt; IgG1, Ser472 /Ser473, clon 104A282; BD Pharmingen). la modulación epigenética fue investigado por H3 acetilada contra (AH3; IgG, Lys9, clon C5B11) y anti acetilado H4 (AH4; Lys8, policlonal, IgG; tanto: New England Biolabs).
HRP-conjugado de cabra anti -mouse IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York, EE.UU., 1:5.000 dilución) sirvió como anticuerpo secundario. Las membranas se incubaron brevemente con reactivo de detección ECL (ECLTM, Amersham /GE Healthcare, München, Alemania) para visualizar las proteínas y luego analizadas por el sistema de fusión FX7 (Peqlab, Erlangen, Alemania). β-actina (1:1000; Sigma, Taufenkirchen, Alemania). sirvió como control interno
software de Gimp 2.8 se utilizó para realizar el análisis de densidad de píxeles de las bandas de proteínas. Se calculó relación de intensidad de cada proteína /intensidad de investigados de β-actina, y valores de intensidad se han expresado en porcentaje, en relación con los controles establecidos en el 100%.
CDK2 y ciclina A derribar
Las células tumorales (3 × 10
5/6 pocillos) fueron transfectadas con ARN de interferencia pequeño (siRNA) dirigidos contra cdk2 (ID gen: 1017, secuencia diana: AGGTGGTGGCGCTTAAGAAAA) o ciclina A (ID gen: 890, secuencia diana : GCCAGCTGTCAGGATAATAAA; Qiagen, Hilden, Alemania), con un reactivo de siRNA /transfección (reactivo de transfección HiPerFect; Qiagen) relación de 01:06. las células y las células tratadas con el control de siRNA 5 nM y no tratados (Todas las estrellas siRNA control negativo; Qiagen) sirvieron como controles. Posteriormente, se analizó el crecimiento de células tumorales como se indicó anteriormente.
Estadísticas
Se realizó todos los experimentos 3-6 veces. La significación estadística se evaluó por el no paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney-U-prueba para experimentos repetidos 6 veces. Los experimentos llevados a cabo 3 veces fueron evaluados estadísticamente mediante la prueba t paramétrico. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un valor de p inferior a 0,05.
Resultados
dosis-respuesta análisis
La exposición de las células tumorales a la amigdalina (aplicación de una sola dosis) dio lugar a una concentración la reducción dependiente del número de células tumorales, con el efecto más prominente de manifiesto en la línea celular TCCsup (fig. 1, 24 h aplicación). No hay signos de toxicidad fueron mostrados por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Dado que la reducción de células más fuerte se observó con 10 mg /ml amigdalina, se empleó esta concentración para todos siguiente investigación. El tratamiento a largo plazo consistente en 10 mg /amigdalina ml añadió a las células tumorales tres veces a la semana durante un período de 2 semanas mostró que el crecimiento celular se redujo en un grado similar a la encontrada con el protocolo de tratamiento a corto plazo (fig. 1, 2 aplicación semanas).
Los controles se mantuvieron sin tratar. Abajo: Tumor crecimiento de las células después de 2 semanas de tratamiento con 10 mg /ml amigdalina. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió 5 veces. Los datos de un experimento representativo se muestran. * Indica una diferencia significativa con los controles (p = 0,0022).
Los controles se mantuvieron sin tratar. El cuadrante superior derecho muestra el porcentaje de células en apoptosis tardía, el porcentaje cuadrante inferior derecho de células en apoptosis temprana (un representante de 3 pruebas; SD
intraensayo & lt; 10%).
La apoptosis
aplicación a corto plazo de la amígdala durante 24 h no indujo la apoptosis (datos no mostrados). Sin embargo, el porcentaje de las células tumorales se someten a apoptosis temprana de aproximadamente el doble después de dos semanas de exposición amigdalina en todas las líneas de células de tres: p = 0,0026 (UMUC-3), p = 0,0145 (TCCSUP) y p = 0,0208 (RT112). Además, una duplicación en la apoptosis tardía se produjo en la línea celular UMUC-3 (fig 2;. P = 0,0230)
proliferación de células tumorales y el crecimiento celular clonal
proliferación en las tres líneas celulares. se redujo significativamente, si se aplicó la amígdala durante 24 h o 2 semanas (Figura 3, izquierda). Después de 2 semanas de exposición a la amigdalina células subconfluentes, se evaluó entonces el crecimiento clonal, con lo cual se añadió la amigdalina, ya sea por un período subsiguiente de 10 días ( "amigdalina B") o no ( "amigdalina A"). El número de clones RT112 fue disminuida considerablemente por la exposición amigdalina 10 días durante la formación clonal, y no hay clones TCCSUP eran evidentes (fig. 3, derecha). Cuando la amígdala no se aplicó durante la formación clonal, también se redujo el número de RT112 y TCCSUP clones, aunque no con tanta fuerza como se vio en el régimen de "amigdalina B" (fig. 3, derecha). La línea celular UMUC-3 no forman colonias y fue, por lo tanto, no se evalúa
A la derecha:. Clonigénicas crecimiento de las células TCCSUP y RT112 (posteriores al 2 de semana cultural subconfluent con 10 mg /ml amigdalina) y sin (control ) y con la amígdala. La amígdala A = 10 días de incubación amigdalina libre durante el crecimiento clonogénico. La amígdala B crecimiento clonogénico = 10 días con 10 mg amigdalina /ml. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron 5 veces. * Indica una diferencia significativa con los controles (p = 0,0022).
#indicates diferencia significativa en la amígdala A (p = 0,0022).
progresión del ciclo celular
progresión del ciclo celular modulada
La amígdala, dependiendo de la línea celular tumoral (fig. 4 ). aplicación amigdalina a corto plazo (24 h) a UMUC-3 aumentó el número de células G0 /G1 (p = 0,0169) y redujo el número de células en fase S (p = 0,0138). En las células TCCSUP tratamiento a corto plazo aumentó el número de células /fase G1 G0 (p = 0,0121), pero reduce el número de células en el /M-fase G2 (p = 0,0406). En las células RT112 exposición amigdalina corto plazo causó reducción G2 /M-fase (p = 0,0039) y un aumento de la fase S (p = 0,0040). Dos semanas de exposición amigdalina bajó el /M-fase G2 (p
UMUC-3 = 0,0036; p
TCCsup = 0,0080; p
RT112 = 0,0015) y aumentó el /G1-fase G0 en todas las células tumorales líneas (p
UMUC-3 = 0,0019, p
TCCsup = 0,0143, p
RT112 = 0,0018). El número de células en fase S también se redujo significativamente después del tratamiento dos semanas en UMUC-3 (p = 0,0093) y las células RT112 (p = 0,0032), en comparación con los controles.
La población de células se expresa como porcentaje del total de células analizadas. Se muestra un experimento representativo de tres.
ciclo celular regulando la expresión de proteínas
Dado que, se podía esperar que las modificaciones del ciclo celular que controla el crecimiento celular proteínas amigdalina influido y la progresión del ciclo celular. La expresión de CDK1 y CDK2 (todas las líneas celulares) y cdk4 (TCCSUP, RT112) se redujo de 24 h después de la aplicación amigdalina (fig. 5). P-valores fueron los siguientes para CDK1 (p
UMUC-3 = 0,0029, p
TCCsup = 0,0052, p
RT112 = 0,0007), por CDK2 (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCsup = 0,0006, p
RT112 = 0,0001), para cdk4 (p
TCCsup = 0,0006, p
RT112 = 0,0001), para ciclina a (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCsup = 0,0001, p
RT112 = 0,0002), para la ciclina B (p
TCCsup = 0,001, p
RT112 = 0,0001) y para la ciclina D1 (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCsup = 0,0001, p
RT112 = 0,0001). p19 se mejoró en UMUC-3 (p = 0,0013) y RT112 (p = 0,0012), pero reduce en TCCSUP (p = 0,0001), mientras que p27 se redujo en todas las líneas celulares (p
UMUC-3 = 0,0013, p
TCCsup = 0,0001, p
RT112 = 0,0001). pAkt así como Prictor (pero no pRaptor), de la vía de mTOR, se encuentra desactivado en las tres líneas celulares. P-valores fueron los siguientes para pAkt (p
UMUC-3 = 0,0002, p
TCCsup = 0,0004, p
RT112 = 0,0082) y para Prictor (p
UMUC-3 = 0,0015, p
TCCsup = 0,0017, p
RT112 = 0,0001). pRaptor sólo estaba disminuida en TCCsup (p = 0,0024).
Las células tumorales se trataron previamente con la amígdala durante 24 h o 2 semanas (controles permaneció sin tratar). ß-actina sirvió como control interno. se muestra un representante de tres experimentos separados. El panel de la derecha de la figura 5 muestra los valores de densidad de píxeles dadas en porcentaje en relación con los controles no tratados con la amígdala. * Indica diferencia significativa con el control.
ligeras diferencias eran evidentes después de 2 semanas en comparación con la exposición amigdalina 24 horas. Cdk1 pero no CDK2 se había reducido regulado en UMUC-3 (p = 0,0001). El 24 h disminuir la influencia de la amigdalina en la expresión de p27 en las células UMUC-3 y TCCSUP se perdió después de 2 semanas, y pRaptor aumentó después de 2 semanas en las células TCCSUP (p = 0,0019), en contraste con el 24 h efecto de disminución (fig. 5 ).
Cdk2 /ciclina a knockdown
Desde amigdalina fuertemente modificadas cdk2 y la ciclina a en todas las líneas de células tumorales y estas proteínas regulan la entrada en el ciclo mitótico, el papel de estas proteínas en el crecimiento tumoral se evaluó mediante siRNA knock-down. La incubación de UMUC-3, las células RT112 y TCCSUP con siRNA contra cdk2 o la ciclina A claramente disminuyó el contenido de proteínas (fig. 6, parte inferior derecha) y fue acompañado por bloqueo crecimiento significativo en las tres líneas celulares (Fig. 6).
UMUC-3, las células TCCSUP y RT112 fueron transfectadas con CDK2 o ciclina A siRNA y derribar fue controlado por Western blot (inferior derecha). se muestra un representante de 6 experimentos. * Indica una diferencia significativa con los controles (p = 0,0022).
Discusión
La evidencia presentada aquí demuestra que la amígdala suprime el crecimiento y la proliferación de líneas celulares de cáncer de vejiga tres. El número de células tumorales se someten a la apoptosis temprana aumentó ligeramente después de la exposición a largo plazo amigdalina, aunque no después de la exposición a corto plazo y esta inhibición de la actividad proliferativa no haya sido causado por un efecto tóxico de la amígdala. Otros investigadores también han mostrado signos de apoptotosis inducida por la amígdala. La rápida activación de la caspasa-3, junto con la baja regulación de Bcl-2 y la regulación de Bax en presencia de 0,1 mg /ml amigdalina se ha demostrado en células de cáncer de próstata DU145 y LNCaP [9]. La muerte celular apoptótica también ha sido evocada por la amigdalina en la línea celular de cáncer cervical HeLa [10] y en la leucemia promielocítica humana (HL-60) las células [11]. En total, estos informes indican que la amígdala puede dar cuenta de los eventos apoptóticos en diversas células cancerosas, incluyendo los de la vejiga, y contribuir al crecimiento del tumor reducido.
La amígdala progresión del ciclo celular alterado fuertemente en todas las líneas celulares de cáncer de vejiga tres. Durante el tratamiento a corto plazo, UMUC-3 y TCCsup acumula en G0 /G1, mientras que RT112 fue detenido en la fase S. por lo tanto, la mitosis es influenciado de una manera diferente en diferentes líneas celulares de amigdalina. Otra diferencia fue que p19 se incrementó en RT112 pero disminuyó en TCCsup. Rictor fue desactivado y CDK4 fue suprimida en RT112 pero no en UMUC-3. la inhibición de Cdk4 y aumento p19 Recientemente se ha demostrado para conducir las células tumorales en la fase S [12]. Dado que tanto la inhibición de Cdk4 y p19, en combinación, sólo se produjo en las células RT112, esto podría explicar por qué RT112 acumulado en la fase S, en lugar de en la fase G0 /G1. De hecho, cdk4 no se redujo después de la aplicación 2 semanas amigdalina, y las células RT112 fueron entonces detenido en G0 /G1. Sin embargo, la entrada en fase S no se controla exclusivamente por CDK4 y p19. Más bien, una cohorte de proteínas del ciclo celular está implicado en la conducción de la división celular hacia adelante. La amígdala parece, por lo tanto, interferir en una forma dependiente de la línea celular con varias moléculas de punto de control, perturbar la maquinaria mitótica afinado. bloqueo de crecimiento es el resultado final.
La relevancia de p19 y p27 en la progresión del cáncer de vejiga no ha sido completamente aclarada. Ambas proteínas fueron fuertemente modificadas después de la aplicación amigdalina en esta investigación, p27 se redujo reguladas en todas las líneas celulares, p19 ser hasta reguladas en UMUC-3 y RT112 pero disminuido en TCCsup. Semi-RT-PCR cuantitativa en una serie de 32 especímenes de cáncer de vejiga emparejados con los tejidos normales adyacentes no ha revelado diferencias significativas de p19 y la expresión de p27 [13]. Por otro lado, la evaluación prospectiva de pacientes con cáncer de vejiga de alto grado tratados con cistectomía radical demostró más p27 positivo que negativo tumores en pacientes con recurrencia de la enfermedad [14]. el análisis de microarrays ha demostrado una correlación positiva entre la expresión de p27 y el cáncer de vejiga avanzado [15]. Por el contrario, otro estudio ha informado de un efecto desfavorable de la pérdida de p27 asociado con carcinoma de vejiga [16]. Los experimentos in vitro han puesto de relieve un papel indeterminado de p27 en tanto como la supresión de este crecimiento elevado de proteínas, pero al mismo tiempo reduce la invasión [17] - [19]. En base a esto, no es posible evaluar finalmente si la reducción de p27 después de la aplicación amigdalina está vinculada a la proliferación, la invasión o a ambos. Para profundizar en el proceso de invasión, se ha iniciado una nueva investigación se concentra en la acción de la amígdala en la célula de cáncer se propague.
La amígdala reduce la fosforilación de Akt y de la subunidad de mTOR, Rictor. la señalización de Akt-mTOR desempeña un papel importante en la carcinogénesis de vejiga, con la activación de Akt se producen en todo el espectro de la vejiga urotelial carcinomas [20]. El proyecto Genoma del Cáncer Atlas ha identificado la vía AKT /mTOR como diana terapéutica fundamental en el cáncer de vejiga [21]. La acción específica de la amígdala en el Rictor complejo mTOR es de interés, ya que los inhibidores de mTOR-aprobados, everolimus y temsirolimus, se dirigen a la rapaz complejo mTOR, mientras que Rictor se considera insensible a ambos fármacos [22]. Rictor ha demostrado ser un determinante importante en la migración y la invasión del cáncer de vejiga [23]. Por lo tanto, la amígdala no sólo podría ser una herramienta innovadora para neutralizar la diseminación metastásica sino también para complementar los regímenes basados mTOR-inhibidor.
Cdks, junto con las ciclinas, son moléculas clave responsables de la progresión del ciclo celular y la división celular, por lo que en particular cdk están afiliados a las ciclinas particulares. En consecuencia, el crecimiento de células de cáncer aberrante se ha atribuido a la modulación del nivel de expresión de CDK-ciclina. Se observaron las alteraciones de proteínas más fuertes después de 24 h de incubación amigdalina por CDK2 y ciclina A, y pueden representar importantes objetivos de la amígdala. Aunque no hay investigadores hasta la fecha han avanzado esta hipótesis, la amígdala se ha demostrado para alterar los genes implicados en la regulación del ciclo celular de las células de cáncer de colon humano [24]. La CDK2-ciclina A promueve eje /S transición de fase G1, lo que podría explicar por qué CDK2 /ciclina A abajo de la modulación de la amígdala fue acompañado por una detención en la fase G0 /G1 en las células UMUC-3 y TCCSUP. En la investigación in vitro de células de sarcoma de tejidos blandos ha demostrado que la disminución cdk2 combinado con la pérdida de p27 afecta al programa de la invasión celular [25]. Desde reducción cdk2 fue acompañado por una disminución de p27 en el modelo de cáncer de vejiga, parece probable que la amigdalina no sólo actúa sobre el crecimiento tumoral, pero también podría influir en la propagación metastásica.
De hecho, aunque cdk2-ciclina A se alteran en muchos tumores sólidos, información sobre CDK2-ciclina a en el cáncer de vejiga es escasa. Las proteínas y análisis de ARNm de tejidos de carcinoma de vejiga han indicado que cdk2 se asocia estrechamente con el desarrollo de tumores de vejiga y el progreso [26]. pareja de unión de cdk2, ciclina A, se ha correlacionado con el grado del tumor y la escasa supervivencia específica de la enfermedad, evidenciado por inmunohistoquímica y cDNA microarrays [27]. En los experimentos actuales, derribando CDK2 o ciclina A dado lugar a una reducción sustancial del número de células tumorales, lo que indica la relevancia clínica de ambas proteínas para el cáncer de vejiga. Dado que las CDK y ciclinas se incrementan cuando se desarrolla resistencia a los medicamentos [28], [29], para contrarrestar este proceso podría ser un potente estrategia para prevenir o superar la resistencia [29]. Durante los últimos años, varias estrategias terapéuticas novedosas se han diseñado para dirigirse a las CDK. Actualmente, están en varias etapas de desarrollo clínico, ya que ambos agentes únicos y en combinación [30]. La amígdala podría ser una alternativa "natural", mediante el cual graves efectos secundarios asociados con CDK inhibidores convencionales [31] pueden ser evitados.
No se observaron ligeras diferencias entre la aplicación amigdalina a largo plazo y corto plazo, sobre todo en la línea celular UMUC-3. Cdk2 ya no disminuyó después de 2 semanas, pero cdk1 estaba más fuertemente disminuido después de la aplicación de la amigdalina 24 h. La razón de este cambio sobre la aplicación después de largo plazo no está claro. CDK2 se acumula en el límite de la fase G1 /S, mientras que las células unidades CDK1 en la mitosis [32]. Los diversos mecanismos de CDK1 y CDK2 se han reflejado por el ensayo del ciclo celular que demuestra la detención adicional de UMUC-3 en G2 /M después de 2 semanas de exposición amigdalina. Dado que el crecimiento y la proliferación UMUC-3 se alteró de manera similar en la aplicación amigdalina 24 horas y 2 semanas, CDK2 puede haber vuelto insensibles a la supresión de la amígdala, pero esto fue compensado por una supresión de CDK1. De hecho, cdk1 ha informado para compensar cdk2 mediante la reorientación de CDK1 en la ciclina A vía, que normalmente se limita a cdk2 [33].
Esta es la primera investigación que proporciona información sobre la influencia de la amigdalina en células de cáncer de vejiga líneas en vitro. Tales estudios in vitro no pueden hacer más que presentar una predicción de la eficacia de la amígdala en los pacientes. Los ensayos clínicos con la amigdalina no han sido bien documentados y los estudios controlados aleatorios nunca se han llevado a cabo. Un análisis retrospectivo de 67 pacientes con tumores que habían tomado la amigdalina informó de dos completa y 4 respuestas parciales [34]. Un ensayo de fase II se llevó a cabo en 1982, en el que los pacientes también recibieron vitaminas y enzimas pancreáticas. La terapia se detuvo cuando los niveles de cianuro en la sangre aumentaron y se concluyó que laetril no era un tratamiento eficaz del cáncer [35]. Otros informes sugieren que la amígdala sea de claro beneficio en pacientes con cáncer [8]. Sin embargo, el término "beneficio" no se especificó con claridad. La ambivalencia también se ha reflejado en los informes de casos, en los que la amígdala era ineficaz en cinco y efectiva en cuatro casos [8].
Todavía no está claro si la amígdala también puede actuar sobre las células epiteliales normales, fisiológicamente intactas. Dado que las células epiteliales no inmortalizadas primarios no muestran actividad mitótica o rápidamente pierden actividad mitótica in vitro, estas células no pueden ser sometidos al ensayo de crecimiento MTT. Sin embargo, la amigdalina Recientemente se ha demostrado para bloquear el crecimiento de células endoteliales [36]. Si este fenómeno se puede transferir a otras células permanece abierta. No obstante, el bloqueo del crecimiento celular endotelial por la amigdalina indica que la amígdala puede suprimir la angiogénesis inducida por el tumor.
El riesgo de desarrollar envenenamiento por cianuro tampoco ha sido resuelto. En este sentido, la vía de administración (oral o intravenosa), la cantidad y calidad sin duda influir en la relación riesgo-beneficio. Dado que los informes clínicos de tratamiento de la amígdala son más de 30 años de edad [8], y durante este tiempo la comprensión de los mecanismos moleculares del cáncer ha progresado en gran medida, valdría la pena poner a prueba las suposiciones in vitro se presentan aquí en un modelo in vivo. Bien diseñados, los ensayos clínicos controlados de manera crítica la amígdala prueba a continuación, debe ser considerado.
En general, la amígdala se ha demostrado que bloquear el crecimiento de células de cáncer de vejiga in vitro. Supresión de CDK2 y ciclina A podría ser un mecanismo relevante la definición de cómo la amígdala puede detener o disminuir la proliferación tumoral.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Karen Nelson para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el "Brigitta und Norbert Muth Stiftung" y el "Freunde und der Förderer Goethe-Universität Frankfurt".