Extracto
Antecedentes
La desregulación de la vía canónica de Wnt /CTNNB1 (beta-catenina ) vía es uno de los primeros eventos en la patogénesis del cáncer de colon. Las mutaciones en
APC
o
CTNNB1
son muy frecuentes en el cáncer de colon y causar estabilización aberrante de CTNNB1, que activa la transcripción de Wnt genes diana mediante la unión a la cromatina a través de los factores de transcripción TCF /LEF. Aquí mostramos un análisis integrador de la ocupación de la cromatina en todo el genoma de CTNNB1 por inmunoprecipitación de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) y el perfil de expresión génica de análisis de microarrays en caída mediada por ARNi de CTNNB1 en células de cáncer de colon.
resultados
Hemos observado picos de unión CTNNB1 3629 en todo el genoma y una correlación significativa entre CTNNB1 unión e inducida por el cambio de derribo de la expresión génica. Nuestro análisis integrador llevó al descubrimiento de una firma objetivo Wnt directa compuesta de 162 genes. análisis de la ontología de genes de esta firma reveló un enriquecimiento significativo de genes vía Wnt, lo que sugiere múltiples regulaciones de retroalimentación de la vía. Proporcionamos evidencia de que este gen firma se superpone parcialmente con el LGR5
+ firma de células madre intestinal, y se enriquece significativamente en las células madre intestinales normales, así como en clínicas muestras de cáncer colorrectal. Curiosamente, mientras que la expresión del gen diana conjunto CTNNB1 no se correlaciona con la supervivencia, la expresión elevada de los reguladores de retroalimentación negativa dentro de la firma predice mejor pronóstico.
Conclusión
Nuestros datos proporcionan un genoma de gran vista de la ocupación y la regulación de la cromatina genes de Wnt /CTNNB1 señalización en las células de cáncer de colon
Visto:. Watanabe K, J Biesinger, Salmans ML, Roberts BS, Arthur WT, Cleary M, et al. (2014) integrativa chip-ss /análisis de microarrays identifica una firma CTNNB1 Objetivo Enriquecido en las células madre intestinales y cáncer de colon. PLoS ONE 9 (3): e92317. doi: 10.1371 /journal.pone.0092317
Editor: Ted S. Acott, Casey Eye Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Octubre, 2013; Aceptado: 20 Febrero 2014; Publicado: 20 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Watanabe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación de Susan G. Komen conceder KG110897 (XD), un Departamento de Defensa BCRP beca posdoctoral (KW-W81XWH 10-1-0383) de Estados Unidos, y los Institutos nacionales de Salud de subvención R01HG006870 (a XX). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Brian S. Roberts y William T. Arthur son ex empleados de Rosetta Inpharmatics, LLC , Merck & amp; Co Inc. Michele Cleary es actualmente un empleado de Merck & amp; Co., Inc. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Antecedentes
señalización de Wnt /CTNNB1 es una vía conservada que desempeña papeles fundamentales en el desarrollo embrionario, la homeostasis del tejido y el mantenimiento de las células madre. En intestino normal, esta vía es esencial para el desarrollo y mantenimiento de las células madre intestinales [1], [2]. La activación de la señalización de Wnt canónica implica la estabilización de CTNNB1 citoplasmática, que se degrada de otra manera por el proteasoma a través de un complejo de degradación compuesta de proteína supresora de tumores APC, serina /treonina quinasa GSK-3, y Axin. Estabilizado CTNNB1 se transloca en el núcleo donde se une a TCF /LEF factores de transcripción y activa la expresión del gen diana [2]. Un evento clave de iniciación de los cánceres colorrectales (CRC) es CTNNB1 estabilización través de la pérdida de la
APC
gen o la activación de mutaciones en el gen
CTNNB1
[3]. Este evento genético se presenta principalmente en la población de células madre intestinales [4] - [6] y conduce a la proliferación anormal de células mutadas través de la activación de los genes diana tales como
MYC
y
CCND1
[7 ]. Sin embargo, dadas las funciones celulares divergentes de señalización /CTNNB1 Wnt, otros genes diana pueden también contribuyen a la patogénesis de la CRC.
Así, la identificación y caracterización de genes diana CTNNB1 el genoma han sido una búsqueda importante en CRC estudios. Transcripcional de perfiles se utilizó para identificar Wnt /CTNNB1 genes diana en las células de cáncer de colon [8]. Sin embargo, el análisis de la expresión génica por sí sola es limitada debido a la incapacidad de distinguir entre los efectos primarios y secundarios de activación de la vía Wnt. Más recientemente, la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), seguido de análisis de ADN a gran escala tal como ADN-chip (chip-chip) o secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) [9], [10] se utilizó para identificar los loci genómico para que CTNNB1 o TCF factores se unen directamente [11] - [14]. Sin embargo, los estudios basados en chips de diversos factores de transcripción sugieren que no todos los eventos de unión identificados se correlacionan con la regulación de la transcripción a nivel funcional [15]. Por lo tanto, es importante llevar a cabo un análisis de integración que incorpora tanto el mapeo de ocupación de la cromatina y la expresión de genes de perfiles en el mismo tipo de células de cáncer de colon con el fin de identificar los genes diana Wnt /CTNNB1 directos y funcionales, que aún no se ha hecho en el genoma de toda la literatura.
En el presente estudio, se combinan chip-ss con el análisis de microarrays utilizando la línea celular humana de cáncer de colon SW480, donde la actividad de señalización Wnt desregulado ha sido bien documentada. Se presenta una correlación significativa entre CTNNB1 vinculante y regulación de la expresión, y la identificación de un conjunto básico de 162 genes Wnt 'como objetivo directo genes que están vinculados y activados por CTNNB1. La firma gen diana de Wnt se enriquece en células madre intestinales normales y CRC, pero no para predecir el pronóstico de los pacientes con CCR. Nuestro estudio proporciona un recurso importante para la comprensión de la biología de la señalización de Wnt.
Resultados
análisis de chip-ss de ocupación de la cromatina en las células SW480 CTNNB1
SW480 células contienen una mutación de inactivación en el
APC
gen que se traduce en un alto nivel de proteína constitutivamente CTNNB1 estabilizado en los núcleos [16], [17]. Para capturar la interacción presumiblemente dinámica de CTNNB1 con la cromatina [18], [19], hemos optimizado un protocolo de chip usando proteína-proteína reticulantes-amina específica antes de formaldehído reticulación junto con la extracción nuclear [20] (ver Métodos) . La unión específica de CTNNB1 fue validado por primera vez por chip-PCR para objetivos conocidos, incluyendo
MYC
y
LEF1 gratis (Figura 1A). Los ADN de varios experimentos chip utilizando anticuerpo o control de isotipo de control de IgG anti-CTNNB1 se agruparon para la secuenciación Solexa /Illumina, que produjo aproximadamente 26 millones de secuencia de 36 nucleótidos lecturas individuales en cada serie. Sólo lee asignada de forma única en el genoma humano (15776628 para IgG control y 17112552 para anti-CTNNB1) se usaron para el posterior análisis (Tabla 1). Basado en modelos Análisis de chip-Sec (MACS) [21] identificó 3629 CTNNB1 regiones de pico de unión (
p
valor ≤ 1E-5, FDR ≤ 5%) a través de todo el genoma (Tabla 1). Aproximadamente el 60% de los picos se encuentran en una proximidad de las regiones de genes de codificación incluidos el promotor (2-kb 5 'de acompañamiento región, 21,5%), 5'-UTR (6,9%), el exón (5,5%), el intrón (21,6 %), 3'-UTR (3,2%) y aguas abajo (2-kb región flanqueante 3 ', 0,5%) regiones (Figura 1B). Enriquecimiento de CTNNB1 de unión en los promotores (21,5%) fue estadísticamente significativa (
p
& lt; 0,001) en comparación con la distribución de los picos generados al azar de tamaños similares (3,5 ± 0,2%). Coherente con un informe anterior [12], la distribución de pico significativamente correlacionado con la proximidad de los sitios de inicio de transcripción (TSS) (Figura 1C). Desde un promotor unido a la TCF CTNNB1 /puede actuar de forma remota desde el SAT [18], hemos tratado de DST que se encuentra dentro de los 20 kb de los picos observados, y se identificaron 2794 genes que se utilizaron en el análisis posterior para identificar los genes diana directos .
A.
optimización chip. Chip-PCR se realizó para los elementos de unión CTNNB1 conocidos en regiones reguladoras de genes myc y Lef1. anticuerpo anti-* PYGO2 se utilizó como control positivo, como proteína se asocia con la proteína PYGO2 CTNNB1-TCF /LEF complejo [51].
B.
Distribución de las regiones de unión a CTNNB1 en el genoma en relación a los genes humanos RefSeq. Un «promotor» se define como la región de 2 kb aguas arriba del TSS, mientras que una región de "aguas abajo" se define como la región de 2 kb aguas abajo del sitio de terminación de la transcripción. región intergénica se refiere a todos los lugares que no sean 'promotor', 5'-UTR, 'exón', 'intrón', '3' UTR ', o' aguas abajo '.
C.
Distancia desde el centro de cada pico de unión CTNNB1 a la SAT del gen más cercano. La línea roja representa un patrón distribuido al azar generada por tomar 1000 permutaciones aleatorias de los picos.
D.
Programa MEME identifica un motivo de consenso TCF /LEF-vinculante dentro de los picos de chip-ss.
Uso Múltiple EM para Motif Elicitación (MEME), una de novo motivo descubrimiento programa [22], se analizaron los picos CTNNB1 únicas para detectar la presencia de cualquier posible motivo de consenso. Una larga secuencia TCF /LEF consenso [12], [13] surgió como el motivo de categoría alta (valor E = 7.9e-1135) (Figura 1D). También se identificaron varias otras secuencias candidatas; sin embargo, parecían representar secuencias repetitivas, que son artefactos comunes de este análisis (datos no mostrados). Estos datos confirman que CTNNB1 se une a la cromatina principalmente a través de /LEF de unión al ADN proteínas TVC [11]. Dicho esto, no podemos excluir los posibles motivos de unión que no han sido detectados por MEME, así como la existencia de otros motivos asociados que se encuentran fuera de las regiones de pico chip [12], [14]. De hecho, una búsqueda k-mer [23] reveló que la secuencia de consenso AP-1 (TGAYTCA) se enriquece significativamente en comparación con el tamaño similar fragmentos genómicos aleatorios (
p
= 1.78e-50), en consonancia con el trabajo previo informar al enriquecimiento de la AP-1 en motivos CTNNB1 elementos de unión [12].
Uso de la UCSC Genome browser (NCBI36 /hg18) [24], visualizamos CTNNB1 unión a conocidos genes diana de Wnt /CTNNB1.
AXIN2
es un objetivo clásico y contiene múltiples TCF /LEF regiones de unión en su promotor y el primer intrón [25]. Nuestro análisis chip-ss sí, identificado varios picos en
AXIN2
, con sus correspondientes posiciones bien con los sitios de unión reportados (Figura 2A). También se detectaron picos en las regiones reportadas de otros genes diana conocidos que incluyen
MYC
[12] y
LEF1
[26] (Figura 2 B y C).
Se muestran Los resultados para las distribuciones CTNNB1 e IgG en gens Ref-ss. Cajas de color rojo indican las posiciones de consenso motivos TCF /LEF-unión. H3K4me1 y H3K4Me3 dominios de múltiples Enciclopedia de Elementos de ADN (ENCODE) líneas celulares se muestran como referencia para potenciador /promotor y regiones promotoras, respectivamente.
Análisis combinacional de unión a la cromatina y la expresión génica de datos identifica un directa CTNNB1 firma gen diana que contiene reguladores de retroalimentación de la vía de señalización de Wnt
Para identificar los genes diana CTNNB1 directos y funcionalmente relevantes, analizamos el conjunto de datos chip-ss con los datos de perfil transcripcional de control y CTNNB1-SW480 agota las células [27] . Como se ha descrito anteriormente [27], desmontables de CTNNB1 se realizó utilizando dos siRNAs-CTNNB1 específicas diferentes, que cuando se prueba en un ensayo funcional usando un reportero Activado-Beta-catenina (BAR) [28] fueron capaces de suprimir la actividad de BAR por ~99 % y ~97%, respectivamente. Se realizó el conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) utilizando la prueba modificada de Kolmogorov-Smirnov (KS) [29] para evaluar los genes vinculados-CTNNB1 para su distribución en el conjunto de datos de microarrays en el que los genes se ordenan de rango por su expresión diferencial entre el control y CTNNB1 células-agotado. La prueba de KS reveló una correlación altamente significativa (
p = 0
) entre CTNNB1 vinculante y los cambios de expresión génica después de CTNNB1 caída, y esto era cierto con las dos siRNAs (Figura 3A y datos no presentados). La mayoría de los genes destino a CTNNB1 se correlacionaron positivamente, mientras que un pequeño número de los genes se correlacionaron negativamente, con la expresión CTNNB1 (Figura 3B). Esto es consistente con CTNNB1 actuando principalmente como un activador transcripcional pero siendo capaz de reprimir la expresión de ciertos genes [30] también.
A-B Opiniones. parcelas KS correlación entre CTNNB1 vinculante y regulación de la expresión. Los genes 2794 CTNNB1 unida se compararon por su correlación con los cambios de expresión sobre siRNA desmontables de CTNNB1. Los genes en el microarray fueron calificados por
p
valor (
Un
,
p
= 4.4e-16) o retirarse aumento (
B Opiniones,
p
= 0) en cada GSEA
El uso de un criterio de combinatoria, es decir, baja regulación en el análisis de microarrays con
p
. & lt; 0,01 y el logaritmo de la razón & lt ; -0.2 después del tratamiento de ambos siRNAs y se presentan picos de unión CTNNB1 dentro de ± 20 kb de la SAT, se identificaron 162 genes Wnt como objetivos directos y funcionales (Tabla S1). Se incluyen en esta firma de destino son conocidos objetivos tales como
AXIN2, CDX2, ID2, LEF1, Lgr6, MSX1, NKD1, NKD2, SP5, TDGF1, España y
TNFRSF19
, lo que indica la validez de la firma. También probamos 10 genes de la lista, y utilizamos el chip-PCR para confirmar la unión en los sitios esperados (Figura 4A) CTNNB1. El uso de un shRNA contra CTNNB1 que es diferente de los dos siRNAs utilizados en el análisis de microarrays, hemos validado que desmontables de CTNNB1 dio lugar a una regulación por disminución significativa de la mayor parte de los genes de la prueba, incluyendo
FASLG, IL10, LMO2, MPZL2, Notum , PPP1R2, España y
TREM2 gratis (Figura 4B).
Un
. Chip análisis por PCR de los genes indicados utilizando una muestra de la cromatina preparado de forma independiente.
LEF1
y
GAPDH
sirven como controles positivos y negativos, respectivamente.
B Opiniones. RT-PCR cuantitativa de los genes indicados. se muestran la media ± desviación estándar de 4 experimentos independientes.
valores de p
se calculan con el estándar de dos colas
t-
prueba. NS: no significativo, *:
p Hotel & lt; 0,05 y **:
p Hotel & lt; 0,01
Gene Ontología (GO) el enriquecimiento plazo. base de datos para anotación, y Visualización, integrada Discovery (DAVID) [31] de la 162-meta-firma sugiere importantes funciones de desarrollo de la vía Wnt, incluyendo la morfogénesis embrionaria apéndice, el corazón o el desarrollo muscular (Tabla S2). GO análisis de genes también reveló que participan en varias vías de señalización, que sugieren posibles conversaciones cruzadas entre la señalización de Wnt y estas vías. En concreto, vía detectado significativamente GO términos incluyen señalización (
FASL, BMP-7, CXCL4, CXCL6, CXCL14, EDAR, IL10RA, IL10, TNFRSF1B, TNFRSF11B, TNFRSF19
), las vías en el cáncer (
FASL, GLI3 citoquina , AXIN2, FGF3, FGF9, FGF19, LEF1, Wnt6, wnt11
), o la vía de señalización Hedgehog (
GLI3, BMP-7, Wnt6, wnt11
) (Tabla 2).
GO análisis de los genes identificados también codifican componentes de señalización Wnt como objetivos CTNNB1 y generamos una lista ampliada de los reguladores de retroalimentación potenciales (Tabla 3).
AXIN2, LEF1, NKD1
y
NKD2
han sido descritos como reguladores de retroalimentación negativa o positiva de la vía [25], [32], [33].
Wnt6
y
wnt11
codifican ligandos Wnt que tienen papeles potenciales promotores de tumores, incluso en los CRC con
APC
mutaciones [34] y que tienen la capacidad para señalar al estroma componentes para modular el microambiente del tumor [35]. Otros reguladores potencial de retroalimentación incluyen
APCDD1
,
Notum, PPP1R2
, y
ZNRF3
.
APCDD1
se divulga para regular negativamente la vía en el paso de la interacción ligando-receptor y su mutación es responsable de una enfermedad autosómica dominante, pérdida de cabello, hipotricosis hereditaria simple [36].
Notum
codifica una α /β-hidrolasa secretada, que se conoce para antagonizar Wnts por la liberación de glypicans de la superficie de la célula [37].
PPP1R2
producto del gen inhibe la proteína fosfatasa 1 compleja, que regula el estado phospholyration de GSK3 [38] y en consecuencia la degradación CTNNB1 [39].
ZNRF3
codifica una ubiquitina ligasa E3 que promueve específicamente la ubiquitinación y la degradación de los receptores Frizzled [40], [41]. Como se mostró anteriormente, hemos confirmado
Notum
y
PPP1R2
a ser blancos de buena fe de CTNNB1. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la señalización Wnt está sujeto a regulaciones complejos de retroalimentación.
El objetivo de la firma CTNNB1 se enriquece en células madre intestinales y CRC, pero no se correlaciona con la supervivencia de los pacientes con CCR
LGR5
+ células intestinales son el ciclismo de forma activa las células madre y de la vía de señalización de Wnt /CTNNB1 juega un papel crítico en su auto-renovación [2]. Por lo tanto, se comparó la firma de destino CTNNB1 identificado en este estudio con una firma genética informó recientemente (un conjunto de 510 genes identificados a partir de perfiles de transcripción basada en microarrays y la masa perfiles de proteínas por espectrometría) que se enriquece en LGR5
+ células madre intestinales [42 ]. Un solapamiento estadísticamente significativa (
p Hotel & lt; 8.9e-07, factor de representatividad & gt; 4,1; en comparación con el azar) se encontró: 17 genes (~ 10%) en la firma gen diana CTNNB1 también fueron parte de el LGR5
+ firma de células madre intestinales (Figura 5, Tabla 4). GSEA en un microarray de datos establecidos a partir de una población EphB2 enriquecida intestinal de células madre de las células epiteliales de colon humano (GSE31257) [43] también reveló el enriquecimiento de nuestro 162-meta-firma en estas células [Normalized Enriquecimiento Puntuación (NES) = 1,81, FDR
q
-valor = 0.0; Figura 5B]. Estos datos sugieren que los genes diana CTNNB1 directos en las células SW480 también se activan en las células madre intestinales normales.
Un
. La superposición entre el objetivo CTNNB1 conjunto de genes y la LGR5
+ intestinal vástago conjunto de genes de células.
p
valor y factor de representación más destacado significación estadística en comparación con el azar. Cálculo se basó en el supuesto de que el número de genes totales es 20000.
B-C
. GSEA para los 162 genes utilizando datos comparativos entre EphB2
alta célula humana intestinal tallo y EphB2
poblaciones de células nonstem bajas (
B
), o entre el cáncer de colon y muestras de tejido normal (
C
).
Para probar la relevancia de la 162-meta-firma en muestras clínicas, se realizó GSEA en los datos de expresión génica de muestras de cáncer de colon humano (GSE41328) [44] . Este análisis reveló un enriquecimiento notable de la firma diana CTNNB1 en muestras de cáncer de colon en comparación con tejidos de colon normales (NES = 2,01, FDR
q
-valor = 0.0; Figura 5C). También se utilizó un conjunto de datos de expresión génica a disposición del público para comprobar si el 162-meta-firma puede predecir el resultado de los pacientes con cáncer de colon [45]. A pesar del enriquecimiento de la firma en muestras de cáncer de colon, no se observó ninguna correlación significativa entre la expresión general de la firma y la supervivencia después de la cirugía libre de enfermedad de los pacientes con cáncer de colon (Figura 6A). Dicho esto, la expresión de varios de los reguladores de retroalimentación negativa que hemos identificado en este trabajo se correlacionó con una tasa de supervivencia libre de enfermedad mejor. Por ejemplo, los pacientes con alta expresión promedio de
AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2
, y
Notum
mostraron significativamente la supervivencia libre de enfermedad en comparación con el grupo de bajo expresor (Figura 6B). En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto un enriquecimiento de los genes diana CTNNB1 directa en las células madre intestinales y muestras clínicas de CRC. Sin embargo, una correlación significativa con el pronóstico de los pacientes con CRC se limita a un subconjunto selecto de CTNNB1 genes diana, es decir, los factores de retroalimentación negativa, en lugar de toda la firma de destino.
Un total de 232 pacientes fueron clasificados en alta ( rojo) o expresadores bajas (azul) en base a la expresión de los genes 162 (
Un
) o cinco genes de retroalimentación negativa (
AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2, notum) gratis (
B Opiniones).
p valores
se calcularon mediante análisis de log-rank.
Discusión
Nuestra proyección imparcial escala del genoma de los genes diana CTNNB1 combinando análisis chip-ss y proporciona una micromatriz recurso importante para la investigación del cáncer de colon. A pesar de la significativa correlación entre la unión de la cromatina y la regulación de la expresión génica, nuestro trabajo descubre un pequeño número (162) de genes como objetivos directos CTNNB1, funcionales en células de cáncer de colon SW480. Este número es considerablemente menor que el de loci con destino a CTNNB1 o de genes CTNNB1 sensibles, lo que sugiere que no todos los loci unidos se funcionalmente utilizados en las células SW480 para la regulación de la transcripción, y que gran parte de los cambios en la expresión génica se produce consecuencias indirectas de CTNNB1 agotamiento. Que podría haber perdido algunos de los objetivos regulados por modesta que requiere el cambio de la expresión génica que se produzca tras el tratamiento con dos diferentes siRNAs y mediante el uso de valores de corte estrictos. Algunos de los loci CTNNB1 unida puede regularse de manera específica al contexto; por ejemplo, los genes que tienen capas adicionales de regulación, tales como los silenciado por metilación del ADN o predominantemente controlada por otros reguladores transcripcionales /traduccionales en células SW480 no pueden mostrar una disminución significativa en la transcripción en el agotamiento del CTNNB1. Sigue siendo posible que estos loci están regulados por CTNNB1 en otros contextos celulares.
Nuestros experimentos de validación sugieren una tasa de éxito del 80% en la identificación de buena fe objetivos CTNNB1 utilizando el enfoque genómico. Una diferencia en la eficiencia desmontables entre si /shRNAs o fuera de objetivo efectos de si /shRNAs puede dar cuenta de los "falsos positivos". La firma de destino CTNNB1 de 162 genes presenta algunas características interesantes. Lo más llamativo es la presencia de reguladores de retroalimentación de la vía. regulación de la retroalimentación de la vía Wnt /CTNNB1 ha sido bien establecida sobre la base de los estudios de genes individuales [25]. Utilizando el análisis de serie de la ocupación de la cromatina (SACO), CTNNB1 ocupación de componentes de la vía canónica de señalización Wnt se ha descubierto [11]. Nuestra conclusión de que componentes de la vía Wnt están sobrerrepresentados en la firma de destino CTNNB1 agrega evidencia adicional para apoyar esta importante modo de regulación. Es de destacar que nuestro estudio y el estudio SACO [11] Destapar en gran medida distintos genes de la vía Wnt como objetivos CTNNB1: de los 15 genes que fueron identificados en el estudio SACO, sólo 2 genes (
AXIN2
y
wnt11
) se encuentra en nuestra lista de 10 genes de la vía Wnt (Tabla 2). Además, cuando se compara con otro estudio CTTNB1 ChIP-seq que utiliza células HCT116 [12], se encontró una superposición de 161 genes con destino a CTNNB1 entre los 988 genes identificados en este estudio y los 2794 genes identificados en el estudio actual. A pesar de que el solapamiento es estadísticamente significativa (
p
& lt; 4.8e-07), un número sustancial de los genes diana era específica para cada estudio. Esto puede ser en parte debido a una diferencia en el ajuste de parámetros o ruidos potenciales en el análisis, pero también podría reflejar una diferencia real en función CTNNB1 entre las líneas celulares de CRC (HCT116 vs. SW480) que se utiliza en los dos estudios. En efecto, una diferencia en los patrones de metilación del ADN de los genes Wnt objetivo entre HCT116 y SW620, una variante metastásica de los ganglios linfáticos de SW480, se ha informado [46]. Por lo tanto, nuestro trabajo revela nuevas facetas de la regulación de la retroalimentación de la señalización de Wnt /CTNNB1. Ajuste de la salida de señalización Wnt por múltiples mecanismos de retroalimentación puede ser importante para la regulación precisa espacio-temporal de su actividad durante los patrones de tejidos y el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Además, el mal funcionamiento de estos mecanismos puede contribuir a condiciones patológicas tales como cáncer [47].
Incluso para un número relativamente pequeño de genes en el 162-target-firma, los términos funcionales relacionadas aparecen indefinido y diversa. Esto es coherente con los efectos biológicos divergentes de Wnt /CTNNB1 señalización [2]. La firma incluye una serie de reguladores de la transcripción (Tabla S1), lo que implica la existencia de transcripcional objetivos secundarios /indirectos. La identificación de objetivos CTNNB1 directa /TCF por otros [11] - [14] y este trabajo proporciona un marco para diseccionar la contribución relativa de los genes diana directos e indirectos a los efectos biológicos de la vía
es. ampliamente reconocido que la desregulación de la vía Wnt /CTNNB1 es una etapa de iniciación clave de la tumorigénesis intestinal [48]. Esta desregulación se cree que ocurre en la población de células madre intestinal que el crecimiento combustibles tumor [5], [6]. Consistente con esta noción, encontramos la firma objetivo CTNNB1 a ser enriquecido significativamente en las células madre intestinales aislados, así como en muestras de CRC clínicos. Sin embargo, no se observó una correlación significativa entre la expresión de la firma diana y el pronóstico de los pacientes con CCR. Esto es interesante teniendo en cuenta que la expresión elevada de una firma de células madre intestinal predice mal pronóstico de pacientes con CRC [46], [49] y que la desregulación de la vía de Wnt se ha conocido como una característica de la CRC [50]. El hecho de que el objetivo CTNNB1 firma incluye una serie de factores de retroalimentación puede complicar el escenario. Por ejemplo, la supresión de los reguladores de retroalimentación negativa podría resultar en la actividad de señalización Wnt oncogénica en células cancerosas, pero ya que los factores estos retroalimentación sí mismos son objetivos de Wnt, el patrón de expresión del gen diana Wnt en general no puede parecer que se correlaciona con el pronóstico. De hecho, el silenciamiento de genes Wnt objetivo de la metilación del promotor se ha observado en los CRC con mal pronóstico [46]. Nuestros resultados muestran que la expresión de factores de selección de retroalimentación negativa de nuestra lista de genes de hecho se correlaciona positivamente con la supervivencia de pacientes con CRC (Figura 6B). En los casos en que se silencian los reguladores de retroalimentación negativa de la vía, el promedio de expresión del gen diana puede no reflejar la actividad de señalización de la vía real. Por lo tanto, el presente estudio y otros [46] sugieren que las consideraciones cuidadosas de las complejas regulaciones y la dependencia de contexto están garantizados en cuanto a la utilidad clínica de los diversos conjuntos de genes Wnt objetivo que han surgido en la literatura. Nuestro estudio se suma a una visión global de la regulación de la señalización de Wnt en los CRC, que ha sido estudiado durante décadas, pero aún no se entiende completamente.
Conclusión
Nuestros datos proporcionan una vista de todo el genoma del gen regulación por Wnt /CTNNB1 señalización en los CRC. El análisis del gen diana reveló múltiples capas de la regulación por retroalimentación de la vía Wnt /CTNNB1. El objetivo directo firma genética CTNNB1 fue altamente expresado en las poblaciones de células madre intestinales y células cancerosas, pero no mostró correlación significativa con la supervivencia de los pacientes con CCR. Este estudio proporciona un recurso importante para entender las funciones complejas y divergentes de la vía Wnt /CTNNB1.
Métodos
Cultivo de células
Se obtuvieron células SW480 de la ATCC y se mantuvieron en Dulbecco medio de eagle modificado suplementado con suero bovino fetal 10%.
inmunoprecipitación de la cromatina (chIP) y de alto rendimiento de secuenciación
chIP se realizó de acuerdo con el protocolo de Millipore con algunas modificaciones. células SW480 eran reticulado en primer lugar con un cóctel de agentes de reticulación de proteína-proteína [0,67 mM de sulfato de disuccinimidilo (DSS), 0,67 mM glutarato de disuccinimidilo (DSG), y 0,67 mM glycolbis etileno (succinimidilsuccinato) (EGS)] [20] durante 45 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, en 0,75% de formaldehído durante 10 minutos a 37 ° C. Después del lavado, la cromatina se cortó en fragmentos ~100-300-bp utilizando un Bioruptor (Diagenode Inc.). Los lisados se preclarificaron con la proteína Dynabeads A (Invitrogen) durante una hora a 4 ° C, y pequeñas partes alícuotas del sobrenadante recuperado se sometieron a reticulación y purificación de ADN inversa (como muestras de entrada). muestras de entrada se utilizaron para medir la concentración de ADN de la cromatina y la inmunoprecipitación se realizó con 25 g de la cromatina que contiene ADN a 4 ° C durante la noche con IgG control (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) o anti-CTNNB1 anticuerpo (Santa Cruz Biotechnology, sc-7199). Inmuno-complejos fueron entonces purificados con proteína A y Dynabeads inversa reticularse mediante la incubación con NaCl 200 mM a 65 ° C durante 5 horas. Después de tratamiento con proteinasa K durante 1 hora, el ADN ChIP se recuperó utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen, 28104). la generación de bibliotecas se realizó con muestras de ADN agrupadas chip de cuatro preparaciones chip independientes utilizando el protocolo de Illumina. En pocas palabras, los extremos de los fragmentos de ADN chip se repararon y fosforilados usando Klenow, ADN polimerasa de T4 y T4 polinucleótido quinasa (componentes del kit Illumina). Después de la ligación de adaptadores de Illumina, el ADN se selecciona el tamaño mediante purificación en gel y luego amplificado por PCR utilizando los cebadores Illumina. La secuenciación se realizó en Ambry Genética en una Illumina Genoma Analizador IIx, un carril por ejemplo, 36 pb secuenciación Singleton.
El experimento de validación se ha realizado mediante el chip-PCR con cebadores listados en la Tabla S3.
análisis de microarrays
El análisis se publicó anteriormente [27], y los detalles experimentales son los siguientes. microarrays de dos colores se realizó por duplicado para SW480 células transfectadas con el control (siRNA contra el gen de la luciferasa) y dos siRNAs independientes contra CTNNB1 (CTNNB1#1 hacia adelante; CUAUCUGUCUGCUCUAGUATT, revés; UACUAGAGCAGACAGAUAGTT, CTNNB1#2 hacia adelante; CUGUUGGAUUGAUUCGAAATT, revés; UUUCGAAUCAAUCCAACAGTT), respectivamente. Veinticuatro horas después de la transfección, se extrajo el ARN de las células usando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El ADNc se sintetizó con Cy3 (control) y Cy5 (siRNA CTNNB1) etiquetado, usando una versión personalizada automatizada del kit MessageAmp II aminoallyl (Life Technologies). muestras marcadas se hibridan con Rosetta /Merck Human 44k 1,1 microarray (GPL4372) mediante la incubación a 40 ° C durante 48 horas en un carrusel giratorio. Después de lavar para extraer muestras hibridadas no específicos, microarrays se secaron en una cámara de nitrógeno libre de ozono. Microarrays fueron escaneados utilizando el escáner láser Agilent LP2. La salida del escáner es un archivo TIFF, que contiene datos de la hibridación de microarrays cuantitativos de cada individuo. Los archivos TIFF se procesaron usando el software Rosetta extracción de características a medida, que lleva a cabo el modelado de error. Los datos se procesaron utilizando el sistema de Rosetta Resolver®, que realiza una operación de compresión que combina repeticiones de la misma secuencia en una matriz mientras se aplica ponderación de error. La ponderación de error consistió en ajustar por aditivo y el ruido multiplicativo.