Extracto
Antecedentes
La vía Hippo regula el tamaño del órgano mediante la inhibición de la proliferación celular y la promoción apoptosis de las células después de su activación. La Proteína Asociada Sí 1 (YAP1) es un efector de la vía nuclear Hippo que promueve el crecimiento celular como una transcripción co-activador. En el cáncer humano, el gen YAP1 se informó como amplificado y sobre-expresado en varios tipos de tumores.
Métodos
se utilizó la tinción inmunohistoquímica de la proteína YAP1 para evaluar la expresión de YAP1 en los tejidos tumorales pancreáticas . siRNA oligonucleótidos se utilizaron para la expresión de desmontables YAP1 y sus efectos sobre las células de cáncer de páncreas se investigaron usando la proliferación celular, apoptosis, y los ensayos de crecimiento independiente de anclaje. El Wilcoxon, coeficiente de correlación de Pearson, de Kendall Tau, Rho de Spearman, y una de dos muestras independientes
t gratis (dos colas) se utilizó la prueba para determinar la significación estadística de los datos.
resultados
estudios de inmunohistoquímica en tejidos tumorales pancreáticas reveladas YAP1 intensidades de tinción eran de moderada a fuerte en el núcleo y el citoplasma de las células tumorales, mientras que el epitelio normal adyacente mostró negativa a la tinción débil. En células cultivadas, la expresión y localización YAP1 fue modulada por la densidad celular. YAP1 expresión de proteínas totales se incrementó en las fracciones nucleares en BxPC-3 y PANC-1, mientras que se redujo en HPDE6 como la densidad celular aumentó. Además, el tratamiento de las líneas celulares de cáncer de páncreas, BxPC-3 y PANC-1, con YAP1-siRNA oligonucleótidos dirigidas a reducir significativamente su proliferación
in vitro
. Además, el tratamiento con oligonucleótidos YAP1 siRNA disminuyó el crecimiento independiente de anclaje en agar blando de células de cáncer pancreático, lo que sugiere un papel de YAP1 en la tumorigénesis del cáncer de páncreas.
Conclusiones
YAP1 se sobreexpresa en el cáncer de páncreas tejidos y puede desempeñar un papel importante en la clonogenicidad y el crecimiento de células de cáncer de páncreas
Visto:. Diep CH, Zucker KM, Hostetter G, Watanabe a, C Hu, Muñoz RM, et al. (2012) baja regulación de la proteína asociada Sí 1 Expresión reduce la proliferación celular y clonogenicidad de cáncer de páncreas células. PLoS ONE 7 (3): e32783. doi: 10.1371 /journal.pone.0032783
Editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de junio de 2011; Aceptado: February 2, 2012; Publicado: 1 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Diep et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional para la Investigación del cáncer, la familia Katz, y el Programa Helios estudiosos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Como una de las formas más letales de la enfermedad humana, el cáncer de páncreas tiene una tasa de supervivencia a un año y cinco años de 26% y 6%, respectivamente [1]. Existe una necesidad crítica de nuevas estrategias de tratamiento para proporcionar un efecto intencional en la supervivencia de pacientes con cáncer de páncreas.
La vía Hippo regula tamaño de los órganos mediante la inhibición de la proliferación celular y promueve la apoptosis celular [2], [3] . Los componentes de la vía de Hipona fueron identificados en las pantallas de mosaicos genéticos en
Drosophila
, que consisten en la quinasa Hipona (Hpo), la proteína Salvador (SAV) adaptador, la proteína quinasa Wts, la proteína adaptadora Mats, y el Yorkie (Yki) nuclear co-activador transcripcional. Tras la activación de la vía, Hpo y Sav fosforila y activa Wts conjuntamente con Mats. WTS fosforila Yki para inactivar y retenerlo en el citoplasma. En los mamíferos, los componentes de la vía Hippo están muy conservadas homólogos, que incluyen MST1 /2 (Hpo), WW45 (Sav), LATS1 /2 (WTS), Mob1 (MATS), y YAP1 (Yki) [4] - [ ,,,0],8].
al igual que en el
Drosophila
modelo, los componentes básicos de mamíferos Hippo forman complejos de proteína quinasas que actúan en una cascada de fosforilar YAP1 (también conocido como YAP o YAP65) y volver a ubicarla en el citoplasma [6], [7], [9], [10]. Como el principal objetivo abajo de la vía de Hipona, YAP1 es una paradoja. Como un oncogén, la amplificación del locus del gen YAP1 en 11q22 se encuentra en varios tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, carcinomas de células escamosas orales, meduloblastomas, y carcinomas de células escamosas de esófago [11] - [15]. Además, la sobreexpresión de la proteína YAP1 y su localización nuclear se han observado en colon, hígado, pulmón, ovario, y cánceres de la próstata [6], [12], [16]. Overholtzer y sus colegas informaron que la sobreexpresión de YAP1 en una línea de células epiteliales MCF10A inmortalizada dio lugar a su transformación oncogénica [11]. Por el contrario, YAP1 también se encontró para estabilizar y mejorar la muerte celular apoptótica p73-dependiente durante inducida por cisplatino daño en el DNA [17]. AKT, un jugador clave en múltiples vías de supervivencia celulares, se ha demostrado que fosforilar YAP1 el fin de suprimir la expresión de genes pro-apoptótica [18]. En un subgrupo de cánceres de mama, la expresión de la proteína significativamente YAP1 se redujo debido a la pérdida de heterocigosidad, y shRNA desmontables de YAP1 aumento de la migración, invasión y crecimiento de tumor mejorado [19]. En general, estos resultados sugieren que la expresión y el papel de YAP1 en el cáncer pueden ser de tipo celular y /o contexto celular dependiente.
En este estudio, hemos tratado de dilucidar el papel de YAP1 en el cáncer de páncreas. Se examinó la expresión de la proteína YAP1 y localización en los tejidos tumorales pancreáticas tomadas de pacientes con cáncer de páncreas y se investigaron los efectos fenotípicos de YAP1 baja regulación en líneas de células pancreáticas cultivadas. Hemos determinado que YAP1 se sobreexpresa en los tejidos tumorales pancreáticas, y la baja regulación de la proliferación y YAP1 disminuido clonogenicidad de las células de cáncer de páncreas cultivadas.
Materiales y Métodos
Cell Culture
las líneas celulares de cáncer pancreático ASPC-1, BxPC-3, Capan-1, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA PACA-2, y PANC-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) (Invitrogen). La línea inmortalizada humana pancreático ductal de células epiteliales, HPDE6, fue proporcionado por el Dr. Tsao MS (Universidad de Toronto, Canadá) y se cultivaron en queratinocitos medio libre de suero suplementado con extracto de pituitaria bovina (30 mg /ml) y factor de crecimiento epidérmico (0,2 ng /ml) (Invitrogen) [20], [21]. La línea inmortalizada humana pancreático ductal de células epiteliales, hTERT-HPNE, se obtuvo de ATCC y se cultivaron en medio DMEM suplementado con 20% FBS [22]. Todas las células se cultivaron de forma rutinaria en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2. identidades de líneas celulares fueron verificadas como se describe anteriormente [23].
microarrays de tejidos e inmunohistoquímica (IHC)
Un microarray tisular (TMA) fue construido a partir de bloques incluidos en parafina de 66 casos singulares de páncreas adenocarcinomas ductales, 5 casos de pancreatitis crónica, y 6 muestras de páncreas normales como se describe anteriormente [24]. Para cada caso de cáncer, dos núcleos tumorales y un núcleo normal adyacente se perforaron para el TMA. Los bloques de TMA se seccionaron a 5 m de espesor, se transfiere por flotación de agua, y se secaron durante la noche a temperatura ambiente. Los portaobjetos se eliminó la cera, rehidratada y el antígeno recuperados en línea en el sistema de tinción automática BondMax ™ (Leica Microsystems, Inc Bannockburn, IL). Todos los portaobjetos se someten a calor de recuperación del epítopo inducida por el uso de una solución de recuperación basado EDTA (Leica Microsystems) durante 20 minutos. La peroxidasa endógena y biotina se bloquearon. Los TMA secciones se incubaron durante 30 minutos a 1:125 con YAP1 (H-125) anticuerpo de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Las secciones se visualizaron utilizando el kit Bond ™ Polymer Refinar detección (Leica Microsystems) utilizando cromógeno diaminobencidina como sustrato y se puntuaron como se describe anteriormente [24]. Se utilizó la prueba de rangos con signo de Wilcoxon para comparar el nivel de expresión YAP1 entre el tumor y sus muestras normales adyacentes. Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar la expresión YAP1 entre el tumor y la pancreatitis, así como muestras de páncreas normales de un grupo separado de los sujetos. coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para estimar y probar la asociación entre la expresión nuclear YAP1 y parámetros histopatológicos (el grado del tumor, el estadio y la enfermedad en los ganglios linfáticos regionales), y el análisis de sensibilidad se realizó mediante la tau de Kendall y Rho de Spearman.
Análisis de inmunotransferencia YAP1
Para lograr la densidad celular necesario después de 48 horas de crecimiento, BxPC-3, PANC-1, y las células se sembraron HPDE6 de la siguiente manera en T175 cm
2 frascos en completa medios de cultivo: dos millones de células de 20-30%, cuatro millones de células de 50-70%, y siete millones de células para el 100%. Las células se lavaron con DPBS, tripsinizaron y contaron entonces en la Cellometer Auto T4 (Nexcelcom Biosciences, Lawrence, MA). Se utilizaron cuatro millones de células para el fraccionamiento subcelular utilizando el Kit Biovision nuclear /citosólico Fraccionamiento (Mountain View, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Para generar lisados de células enteras de un millón de células se lisaron en tampón RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) con un cóctel de 1X proteasa y fosfatasa inhibidor (Roche) y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Los extractos se centrifugaron a 14.000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Un total de 20 g de proteína por carril se separó por electroforesis en gel NuPAGE Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen). Las transferencias se incubaron con un fosfo-YAP1 (Ser127) anticuerpo (Señalización Celular) a una dilución 1:2000 o una YAP1 total (H-125) anticuerpo (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA) a una dilución durante la noche a 1:2000 4 ° C y luego se expusieron a un anticuerpo unido a HRP anti-IgG de conejo (Señalización celular) a una dilución 1:3000 a temperatura ambiente durante 1 hora. PARP (Cell Signaling) a una dilución 1:2000 sirvió como control de carga para la fracción nuclear, mientras que α-tubulina (Cell Signaling) a una dilución 1:2000 sirvió como control para el conjunto de los lisados de células y de la fracción citosólica.
siRNA tratamiento y celular Ensayos de proliferación
expresión YAP1 silenciamiento se logró con dos oligonucleótidos dúplex YAP1 siRNA dirigidos a dos regiones diferentes del YAP1 transcripción (Qiagen, Valencia, CA) a una concentración final de 20 nM usando la transfección siLentfect reactivo (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los siRNAs se inversa-transfectadas por incubación de los siRNAs en 10 l de RPMI 1640 medio de cultivo celular libre de suero (Invitrogen) que contiene 50 l de la mezcla de reactivos de lípidos siLentfect (Bio-Rad) por pocillo y dispuestos en placas de 96 pocillos. El reactivo de transfección siRNAs y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, las células se sembraron a la mezcla de reactivo de siRNA de la transfección a 4800 células /pocillo y suero suplementado-a una concentración final de 5% para BxPC-3 y 2% para PANC-1. Para la línea celular HPDE6, 6000 células /pocillo se sembraron a siRNA-transfección mezcla de reactivos en el medio de queratinocitos. Las placas se almacenaron en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2. Después de 24 horas, el medio de transfección se retiró de cada pocillo y se reemplazó con medio de crecimiento fresco suplementado con suero. La viabilidad celular se determinó mediante la adición de 100 l de la CellTiter-Glo Luminescent de ensayo (Promega, Madison, WI) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ° C durante una hora, y la luminiscencia se registró con el lector de microplacas Synergy HT (BioTek, Winooski, VT).
La apoptosis y el ciclo celular análisis
La transfección de YAP1 siRNAs en las líneas de células pancreáticas fue como se describe en los estudios de proliferación celular anterior. Noventa y seis horas después de la transfección inicial, caspasa-3 y -7 actividades se determinaron mediante la adición de 100 l de la caspasa-Glo 3/7 de ensayo (Promega) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ° C durante una hora, y la luminiscencia se registró con el lector de microplacas HT Sinergia (BioTek). La actividad de la caspasa en las células tratadas con siRNA se normalizó a la de las células sólo control.
análisis del ciclo celular de YAP1 siRNA tratada líneas de células pancreáticas fueron como se describe anteriormente [23].
Anchorage- ensayos independientes
En placas de 6 pocillos, 250.000 células (BxPC-3 y PANC-1) fueron inversa transfectadas con 20 nM del YAP1 siRNAs (Qiagen) durante 48 horas (72 horas y para la extracción de proteínas y de inmunotransferencia análisis). Las células se lavaron con DPBS, se tripsinizaron, y se contaron por exclusión de azul de tripano. Seis mil BxPC-3 células viables y 3.000 células viables PANC-1 se mezclaron con 1 ml de medio de crecimiento y 0,3% de agar y después en capas sobre 0,5% de agar en placas de camas de rejilla 35 mm. Las células se dejaron crecer durante 21 días y se contó toda el área del plato. Las colonias de más de 50 células se contaron como positivos para la transformación. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.
Las células restantes de la transfección se mantuvieron para el ARN y la extracción de proteínas. Para la extracción de RNA, el kit RNeasy Mini (Qiagen) se utilizó siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Un microgramo de RNA total se utilizó en una reacción de síntesis de ADNc de 20 l (Quantas Biosciences, Gaithersburg, MD). Las reacciones se llevaron a cabo en 1 l de la mezcla de reacción de ADNc, 10 l SYBR Green /Taq polimerasa mezcla maestra (Roche, Indianapolis, IN), 4 l de cebadores (YAP1, 5'-GCCATTAAAGGCAGCTGTTC-3 'y 5'-AGCACTGTGCCAGGTATCAC- 3 '; GAPDH, 5'-ATTGCCCTCAACGACCACTT-3' y 5'-GGTCCACCACCCTGTTGC-3 ', a una concentración final 400 nM), y agua 5 l hasta un volumen final de 20 l. Se utilizó el único color en tiempo real sistema de detección de PCR Bio-Rad MyIQ (Hercules, CA) para realizar la RT-PCR. amplificación de dos etapas (95 ° C durante 30 seg y 58 ° C durante 30 seg) se repitió durante 40 ciclos. Después de la reacción PCR, un análisis de curva de fusión se realizó (60 ° C durante 5 segundos) durante 35 ciclos. Los datos fueron analizados utilizando el comparativo C
T método [25]. Análisis de toda lisado celular nivel de expresión de proteína de YAP1 fue descrito como anteriormente, con la excepción de que el siRNA-tratamiento fue durante 72 hrs.
Resultados
YAP1 se sobreexpresa en los adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDA )
Para evaluar el nivel de expresión de la proteína en los tejidos YAP1 PDA, se realizó la inmunotinción usando un microarray tisular (TMA). Entre los casos de PDA 66 contenidas en el TMA, 64 fueron evaluables para la tinción del tumor, de los cuales 33 tenían búsqueda de epitelio normal. El anticuerpo YAP1 mostró tinción tanto nuclear como citoplásmica, que es coherente con la función celular conocido de la proteína YAP1 - YAP1 se localiza en el citoplasma cuando se inactiva y se transloca en el núcleo cuando se activa. Se evaluó la intensidad de la tinción para ambos YAP1 nuclear y citoplasmática y se resumieron los resultados en la Tabla 1. Aproximadamente el 77% (49/64) de los casos de PDA habían positivo (marcado 1+ o superior) tinción YAP1 nuclear en las células tumorales, el 63% ( 31/49) de los cuales tenía una fuerte 3+) tinción (moderada (2+) o. En contraste, sólo el 48% (16/33) de los casos tuvo una tinción positiva en el epitelio normal adyacente, con sólo el 18% (6/33) tenían tinción moderada o fuerte. Por otro lado, las intensidades de tinción en el citoplasma son comparables entre el tumor y los tejidos normales adyacentes, donde el 56% (36/64) de los casos tenía 2+ o superior tinción en el tumor y 43% (14/33) tenían 2+ o superior tinción en el epitelio normal adyacente. El análisis de los casos de tumores que se combina con los tejidos normales adyacentes utilizando la prueba de los rangos con signos de Wilcoxon-también mostró significativamente más alta expresión en las células tumorales en comparación con las células ductales normales adyacentes con un valor de p de 0,0002. Pero lo más importante, la diferencia en el nivel de proteína YAP1 entre el tumor y el epitelio normal adyacente es mucho más significativo en el núcleo (valor de p = 0,0007) que en el citoplasma (valor de p = 0,027), indicando que YAP1 no sólo se sobreexpresa en PDA pero también es altamente activados.
Figura 1 representa ejemplos de tinción diferencial YAP1 en PDA, los tejidos normales adyacentes, y el páncreas normal. En algunos tejidos del páncreas y pancreatitis normales se observó moderada a fuerte tinción YAP1 en las células acinares y conductos pequeños (Figura 1C). Sin embargo, la expresión general de YAP1 en el tumor es significativamente mayor que en el páncreas normal y los casos de pancreatitis (p-valor = 0,011).
A) Negativo a débil tinción citoplásmica en el epitelio ductal normal (flechas blancas) . B) tinción moderada (principalmente citoplasmática) en los conductos normales adyacentes a un tumor (flechas blancas). C) de moderada a fuerte tinción en un centroacinar normal y pequeñas células ductales (flechas blancas); D) Tinción débil en un adenocarcinoma ductal (flechas negras); E) tinción fuerte en un adenocarcinoma ductal bien diferenciado (flechas negras); y F) tinción fuerte (en su mayoría nuclear) en un adenocarcinoma ductal pobremente diferenciado (flechas negras).
A continuación, se correlaciona el nivel de expresión YAP1 nuclear activado con parámetros histopatológicos en pacientes con cáncer de páncreas. Como se muestra en la Tabla 2, no hay asociación entre la expresión nuclear YAP1 y el grado del tumor o la enfermedad residual en los ganglios linfáticos regionales, pero no existe una correlación marginalmente significativa (r = 0,33 y p-valor = 0,068 en el análisis coeficiente de correlación de Pearson) entre YAP1 nivel nuclear y el estadio del tumor.
también examinamos el nivel de expresión de YAP1 en un panel de ocho cáncer de páncreas humano y dos líneas inmortalizadas normales pancreáticos humanos de células epiteliales a través de Western Blot (Figura 2A). Seis líneas celulares de cáncer pancreático (BxPC-3, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA PACA-2, y PANC-1) exhibieron alta a moderada niveles de proteína de YAP1. Dos líneas celulares de cáncer pancreático (ASPC-1 y Capan-1) tenían niveles indetectables de proteína YAP1, respectivamente. Las dos líneas de células pancreáticas inmortalizadas (HPDE6 y hTERT-HPNE) tenían baja a moderada expresión de la proteína YAP1. Este perfil de expresión de YAP1 en líneas de células pancreáticas es coherente con lo que hemos observado en las muestras de tejido del tumor de páncreas (Tabla 1).
A) Análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas YAP1 en un panel de ocho cáncer de páncreas y dos Las líneas celulares inmortalizadas pancreáticas (no transformadas). B-E) tinción inmunohistoquímica para YAP1 en xenoinjertos de cáncer de páncreas: B) AsPC-1; C) BxPC-3; D) MIA Paca-2; y E) PANC-1.
Más investigación de la expresión YAP1 en xenoinjertos de tumores formados por las líneas celulares de cáncer de páncreas también mostró resultados similares. La Figura 2 muestra la tinción diferencial y localización de YAP1 en tumores de xenoinjertos de cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas mediante inmunohistoquímica. El tumor AsPC-1 tenía muy baja tinción de YAP1 y se limitaba al citoplasma (Figura 2B), que está de acuerdo con los resultados de transferencia Western (Figura 2A). BxPC-3 y MIA PaCa-2, que tenía moderada a la expresión de proteínas de alta de YAP1 por Western Blot (Figura 2A), mostró de moderada a fuerte inmunotinción en el citoplasma y (a veces fuerte) tinción moderada en los núcleos (2C y 2D, respectivamente ). PANC-1 tenía expresión de la proteína YAP1 similar con una intensa tinción del citoplasma con baja a moderada tinción de los núcleos (Figura 2E).
La expresión y localización de YAP1 está regulada por la densidad celular
se ha informado de que el aumento de densidad de las células puede resultar en la activación de la vía Hippo y, posteriormente, el secuestrante de YAP1 en el citoplasma [6]. La hipótesis de que en las células de cáncer de páncreas se ve disminuida por ejemplo la regulación de la localización YAP1 por la densidad celular. Para explorar esta hipótesis, se evaluó el nivel de expresión y la localización de YAP1 a diferentes densidades de células por fraccionamiento subcelular de proteínas e inmunotransferencia.
Como se muestra en la Figura 3, a densidades de células más bajas (20-70%), la YAP1 proteína estaba presente tanto en el citoplasma y el núcleo en las dos líneas celulares de cáncer pancreático, BxPC-3, y PANC-1, mientras que en la línea inmortalizada normal, pancreático ductal de células epiteliales, HPDE6, YAP1 no era detectable en la fracción citosólica. Cuando las células se convirtieron en 100% de confluencia, el nivel relativo YAP1 nuclear proteína (relación de YAP1 nuclear vs. YAP1 total) aumentado en BxPC-3 y PANC-1, pero no en HPDE6 (Figura S1). Aunque el nivel de proteínas citosólicas YAP1 aumenta a medida que las células se vuelven confluentes en las tres líneas celulares, el aumento de HPDE6 es la más significativa. Esto indica que relativamente más YAP1 permanecerá activa (no fosforilada) en las líneas celulares de cáncer que en la línea celular inmortalizada HPDE6 la normalidad cuando las células se vuelven confluentes. El nivel de fosfo-YAP1 (p-YAP1) proteína, que sólo se detectó en el lisado de células y la fracción citosólica en las líneas celulares, también confirma las diferencias en YAP1 localización celular entre las líneas celulares de cáncer y HPDE6. p-YAP1 no se detectó en la fracción citosólica de las células confluentes HPDE6 baja y hubo un aumento espectacular cuando las células se convirtieron en 100% de confluencia. En las células cancerosas, por otra parte, p-YAP1 está presente a bajas densidades celulares y aumenta a medida que las células se vuelven más confluente. Estos resultados indican que la expresión y localización YAP1 no es tan estrechamente regulada por la densidad celular en las células cancerosas como en las células normales, lo que sugiere que la función YAP1 podrían ser dysregulated en células de cáncer pancreático
.
A medida que aumenta la densidad celular, el páncreas líneas celulares de cáncer, BxPC-3 y PANC-1, la respuesta a la desactivación de YAP1 como un cofactor de transcripción por el secuestro de citosólica es menos importante que HPDE6. Las células se extrajeron a aumentar las densidades de células después de 48 horas de la siembra inicial. PARP sirve como el control de carga para la fracción nuclear. α-tubulina sirve como control de carga para los extractos celulares totales y fracción citosólica.
siRNA desmontables de YAP1 reduce la proliferación celular, induce la apoptosis, y que disminuye el crecimiento independiente de anclaje en líneas celulares de cáncer pancreático
a fin de analizar el papel de YAP1 en la tumorigénesis, hemos examinado el efecto de silenciamiento YAP1 por siRNA oligonucleótidos sobre la proliferación de células de páncreas, la apoptosis y el crecimiento independiente de anclaje. células BxPC-3 y PANC-1 se inversa-transfectadas con dos oligonucleótidos de ARNsi dirigidos a diferentes regiones de la secuencia YAP1 mRNA. Los de AllStars negativo siRNA Control (Neg siRNA) y de AllStars Muerte de control siRNA (Qiagen) se utilizaron como controles para comparar los efectos de transfección de ARNsi sobre la proliferación celular y la eficiencia de la transfección.
Durante un transcurso de tiempo de 96 horas, las células tratadas con YAP1 siRNA, observaron una reducción significativa en las tasas de crecimiento en comparación con las células de control negativo siRNA (siRNA Neg) y sólo. En la Figura 4, el siRNA Neg tuvo un efecto mínimo sobre la proliferación de BxPC-3 y PANC-1 en comparación con las células no tratadas Sólo control. Sin embargo, ambas secuencias YAP1 siRNA había suprimido significativamente la proliferación tanto en BxPC-3 y PANC-1. Noventa y seis horas después del tratamiento siRNA, siRNA secuencia YAP1_1 inhibió el crecimiento de células BxPC-3 y PANC-1 por 69% y 53%, respectivamente (p & lt; 0,01) y la secuencia de siRNA YAP1_2 inhibió el crecimiento en un 34% y 33% , respectivamente (p & lt; 0,05). YAP1 secuencias de siRNA no redujeron significativamente la proliferación en HPDE6 (Figura S2A)
.
El crecimiento de las células de las curvas A) BxPC-3 y B) PANC-1 transfectadas con siRNA oligonucleótidos YAP1. Las dos muestras independientes
t
prueba (dos colas) se utilizó para calcular la significación estadística en el punto temporal de 96 horas en comparación con siRNA Neg. * Indica p & lt; 0,05, y ** indica p & lt; 0,01. C) La caspasa-Glo 3/7 de ensayo (Promega) se utilizó para determinar el nivel de apoptosis en células de cáncer pancreático transfectadas con oligonucleótidos YAP1 siRNA después de 72 horas. ** Indica una de dos muestras independientes
t
prueba (dos colas) p-valor de. & Lt; 0,01 en comparación con el control de siRNA negativo (Neg siRNA) guía empresas
Para evaluar el efecto de la inhibición YAP1 sobre la apoptosis, se midió la activación de la caspasa-3 y caspasa-7 en células de cáncer pancreático tratados con siRNA. Como se muestra en la Figura 4C, 72 horas después de la transfección, las dos secuencias YAP1 siRNA inducidos caspasa 3/7 actividad en más de 2 veces (p & lt; 0,05) en comparación con el ARNsi de control negativo en BxPC-3, mientras que una secuencia (YAP1_1) actividad de la caspasa inducida significativamente (p & lt; 0,05) en PANC-1. Sin embargo, ni la secuencia de YAP1 siRNA induce significativamente la actividad de la caspasa 3/7 en las células HPDE6 (Figura S2B). Este hallazgo sugiere que desmontables de expresión YAP1 induce la apoptosis dependiente de caspasa en las células del cáncer pancreático.
A continuación, los efectos de la inhibición YAP1 sobre la distribución del ciclo celular fueron examinados (Tabla S1). Ambas secuencias YAP1 siRNA causaron un aumento considerable en la población celular G0 /G1 en tanto BxPC-3 y PANC-1, en comparación con el ARNsi de control negativo. En HPDE6, las dos secuencias de siRNA no indujo efectos consistentes sobre la distribución del ciclo celular en comparación con el control Neg siRNA (Tabla S1).
Desde que se observó un efecto significativo sobre la proliferación celular, hemos querido tener en cuenta si YAP1 desmontables de siRNA aboliría el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de páncreas. células BxPC-3 y PANC-1 se trataron con las secuencias de siRNA durante 48 horas y se recogieron mediante tripsinización. a continuación, se sembró Igual número de células viables para cada tratamiento en agar blando. Después de 21 días, se contaron las colonias de cada grupo y luego normalizada a las células Sólo control y representa como un porcentaje de las colonias. Tanto YAP1_1 y YAP1_2 siRNAs suprimidos clonogenicidad en agar blando en BxPC-3 (95%, p & lt; 0,01) y en PANC-1 (60%, p & lt; 0,05) (Figura 5A). En contraste con la actividad inhibidora similar en el ensayo de proliferación celular (Figura 4A y 4B), la reducción en la formación de colonias fue mucho mayor en BxPC-3 células (~ 95%) que la de las células PANC-1 (~ 60%). Esta diferencia está de acuerdo con el nivel de mRNA YAP1 y la reducción de la proteína por los oligonucleótidos de ARNsi en las líneas celulares (Figura 5B y 5C). Como se muestra en la Figura 5C, la expresión de la proteína reducida por YAP1 siRNAs es más dramático en BxPC-3 células que en las células PANC-1.
A) Porcentaje de colonias en relación con las células sólo en el control de agar suave después de 21 días de crecimiento a partir de la siembra inicial. los valores de p se calcularon comparando el YAP1 siRNA (YAP1_1 y YAP1_2) a la Neg siRNA (independiente de dos colas
t
prueba, de dos colas). B) análisis de qPCR de la expresión de mRNA YAP1 después de 48 horas de la transfección de ARNsi. C) análisis de transferencia de Western de la expresión de siRNA YAP1 después del tratamiento durante 72 horas. Las muestras para cada línea celular se separaron y se analizaron en la misma mancha * indica p & lt;. 0,05, y ** indica p & lt;. 0,01
Discusión
descubrió originalmente en Drosophila como una potente vía para la supresión de tumores, la vía Hippo regula negativamente el crecimiento celular a través de una cascada de quinasa y da como resultado la inactivación de Yki (YAP1 en los mamíferos) [6], [7], [9], [10]. La vía y sus componentes son altamente conservadas en los mamíferos, y varios estudios han demostrado papeles convincentes de la vía de la regulación del crecimiento celular, la proliferación, la supervivencia, y la asociación de neoplasias [26] - [33]. A medida que el efector nuclear de transcripción, YAP1 se ha convertido en un objetivo atractivo de la investigación en tumores malignos de mamíferos. En nuestro estudio, hemos observado que YAP1 se sobreexpresa en tumores de páncreas y en líneas celulares de cáncer. La baja regulación de YAP1 disminuye la viabilidad celular, la proliferación y el crecimiento independiente de anclaje en las células cultivadas.
La localización subcelular de YAP1 en los tumores de páncreas y en las líneas de células cultivadas destacó la desregulación de la vía Hipona. Tras la activación de la vía, YAP1 se inactiva a través de la fosforilación por LATS1 /2 y, por consiguiente retenida en el citoplasma [6], [7]. En nuestros estudios de inmunotinción, la tinción YAP1 es generalmente más intensa en el citoplasma que en el núcleo, y el tumor tiene una proporción significativamente mayor de células con tinción positiva YAP1 en el núcleo de la normal adyacente (77% vs. 48%). Aunque un porcentaje significativo de casos normales adyacentes manchado positivo para YAP1, el nivel de expresión general es significativamente mayor en el tumor (Tabla 1). La tinción de los tejidos YAP1 en páncreas normal está restringida a células acinares y pequeños conductos, lo cual es consistente con un estudio anterior [34] y probablemente representa la función normal de YAP1 en el mantenimiento de la homeostasis del tejido.
Como un estudio previo [6] y la nuestra han observado, la expresión de proteínas YAP1 se modula mediante el aumento de la densidad. A baja densidad, la expresión de proteínas YAP1 es mínimo, pero como la densidad celular aumenta la expresión YAP1 aumenta en consecuencia. En la Figura 3, se observó una banda de migración más lenta en las líneas celulares de cáncer de páncreas inmunotransferencia para YAP1 total de cuando la densidad celular alcanzó 100% en todo el lisado celular y las fracciones nucleares. Postulamos que la banda de migración más lenta observada en la fracción nuclear no es debido a la fosforilación conocida para regular la localización YAP1, sino más bien un desconocido modificación post-traduccional en este momento [35] - [38]. Para estudios futuros, la densidad celular Debe tenerse en cuenta en relación con la expresión de la proteína YAP1. En líneas de células pancreáticas, la expresión de proteínas YAP1 y localización está regulado por la densidad celular, pero tal regulación parecían estar disminuida significativamente en células de cáncer en comparación con la de las células del epitelio ductal normal (Figura 3). Curiosamente, aunque vemos altos niveles de tinción YAP1 en ambos núcleo y el citoplasma en los tejidos de PDA, el nivel de proteína nuclear YAP1 tenía aumento más significativo que el YAP1 citoplasmático en comparación con los tejidos normales adyacentes (Tabla 1). Esto tal vez indica que, además de la regulación positiva de la expresión de la proteína YAP1, componentes de la vía Hippo que regulan la localización YAP1 (fosforilación) también puede estar dysregulated en el cáncer de páncreas. De hecho, se ha demostrado que las reguladas en varios tipos de cáncer, incluyendo el sarcoma de tejidos blandos [39], astrocitoma [40], y el cáncer de mama [41], [42] las LATS1 /2 quinasas aguas arriba de YAP1. Más recientemente, Zhou et al. informado de la pérdida de MST1 activo, otra quinasa aguas arriba de YAP1, en carcinomas hepatocelulares (HCC humanos) y son supresor tumoral en modelos de ratones transgénicos [43] - [45].