Extracto
Los tumores de células oncocíticos se caracterizan por la acumulación de la mitocondria morfológicamente anormales en sus células, lo que sugiere un papel para mitocondrial anormal biogénesis en la transformación celular oncocítica. Poco se sabe acerca de la razón de la dismorfología de las mitocondrias acumulados. Las proteínas que regulan la morfología de las mitocondrias, las proteínas "mitocondrias" dar forma, pueden modular su tamaño y número; Sin embargo, hasta ahora no se sabe nada acerca de una posible participación de la dinámica mitocondrial en la transformación celular en tumores oncocítico. Nuestro objetivo fue evaluar el estado de la morfología de las mitocondrias y su papel en la transformación celular oncocítico. por lo tanto, se evaluó el patrón de expresión de las principales proteínas de fusión y de fisión mitocondrial en una serie de muestras de tumor de células de tiroides, así como en líneas de células tumorales de tiroides, con y sin características de células oncocíticas. La expresión de la fusión mitocondrial (OPA1, MFN1 y de Mfn2) y de fisión (Drp1 y Fis1) las proteínas se evaluaron por inmunohistoquímica (IHC) en una serie de 88 tumores de tiroides humanos.
in vitro
estudios, con fines comparativos y para profundizar en el estudio, se realizaron mediante TPC1 - un carcinoma papilar de tiroides derivado de línea celular y XTC.UC1, tiroides folicular línea celular de carcinoma derivado oncocítico. Tanto IHC y
in vitro
análisis de proteínas mostraron un aumento general en los niveles de proteínas mitocondriales "-dar forma" en los tumores tiroideos oncocíticas. Además, se encontró sobreexpresión de la proteína pro-Drp1 fisión que se asocia con tumores de tiroides oncocíticas malignas. Curiosamente, el bloqueo farmacológico de la genética y la actividad Drp1 fue capaz de influir en la capacidad de migración /invasión de las células del cáncer de tiroides ', una característica de malignidad del tumor. En este estudio se muestra que la dinámica mitocondrial desequilibradas caracterizan las características malignas de tumores de células tiroideas oncocíticas, y participa en la adquisición del fenotipo de migración
Visto:.-Ferreira da Silva-A, Valacca C, E Rios, Pópulo H, Soares P, Sobrinho-Simões M, et al. (2015) Dinámica de proteína mitocondrial Drp1 se sobreexpresa en tumores de tiroides oncocíticos y regula la migración de las células del cáncer. PLoS ONE 10 (3): e0122308. doi: 10.1371 /journal.pone.0122308
Editor Académico: Marc Liesa, Escuela de Medicina de la Universidad de Boston, Estados Unidos |
Recibido: 1 de octubre de 2014; Aceptado: 19 Febrero 2015; Publicado: 30 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Ferreira-da-Silva et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su apoyo a los archivos de información
Financiación:. Este estudio fue parcialmente apoyado por el proyecto PIC /IC /83037/2007 (VM), el proyecto GPA-12120 de la AIRC y GR-2011- 02351643 del Ministerio de Sanidad italiano (SC). Financiación adicional se obtuvo a partir del proyecto 'microambiente, el metabolismo y el cáncer' basado en IPATIMUP y en parte con el apoyo de Programa Operacional Regional del Norte (etc.2-O-Novo Norte), bajo el Quadro de Referencia Estratégico Nacional (QREN), ya través de la Fundo Europeu de Desenvolvimento regional (FEDER). IPATIMUP es un Laboratorio Asociado del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Educación Superior portugués y es parcialmente apoyado por la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FCT). El estudio también fue FCT través de una subvención de doctorado de AFS (Ref .: SFRH /BD /39104/2007)
Conflicto de intereses:. El co-autor Luca Scorrano ya no es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE, ya que haya renunciado antes de la fecha de presentación de los autores. Por lo tanto nada altera la adherencia de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Se conocen Introducción
Las células cancerosas a someterse a un cambio en sus vías metabólicas basales, un proceso que a menudo se describe como el "
Warburg efecto
", por lo que incluso bajo alta tensión de oxígeno que producen la mayor parte de su ATP por la glicolisis [1]. Este cambio en el metabolismo ha informado que ir acompañado de un cambio en la morfología y tamaño mitocondrial, aunque los detalles moleculares que acompañan a los cambios morfológicos asociados con el efecto Warburg siguen sin explicación, ya que también se sabe poco sobre cómo la morfología mitocondrial está regulada [2,3 ]. Los últimos años han visto la identificación de los componentes centrales de la maquinaria de la dinámica mitocondrial, un grupo cada vez mayor de proteínas que, entre otras funciones celulares, regulan la fusión y la fisión mitocondrial. La disfunción dinámica mitocondrial se ha dado a conocer progresivamente en un amplio número de patologías, especialmente las enfermedades neurodegenerativas y el cáncer [4].
Un grupo particular de tumores poco comunes que se ha informado en prácticamente todos los órganos, con una mayor frecuencia en la tiroides y riñón [5,6]. Estos tumores tienen células con una clara altamente eosinofílica, citoplasma granular e hinchado, con grandes núcleos y nucleolos prominentes [7,8,9,10]. Microscopía electrónica ha demostrado que este aspecto hinchado es debido a una acumulación anómala de las mitocondrias que muestran morfología anormal [11,12,13]. Estos tumores se describen como oncocytic-, oxyphilic-, eosinofílica, "célula Hürthle (cuando se hace referencia a la tiroides) tumores" o como "oncocitomas". En aras de la simplicidad, vamos a designarlos como "oncocitomas" o "tumores de células oncocítico" [10]. En la práctica clínica actual, los criterios para el diagnóstico de las variantes de células oncocíticas de carcinoma papilar de tiroides (PTC) y el carcinoma de tiroides folicular (FTC) incluyen características nucleares, signos de capsular y /o invasión vascular que se comparten con los tumores de células no oncocíticas de la misma clase, así como la proliferación mitocondrial típica para tumores de células oncocíticas [5,6,7]. De hecho, esta idea de que la transformación oncocítico se produce en la parte superior de los tumores "convencionales" está respaldada por las alteraciones genéticas similares de carcinomas oncocíticas y sus homólogos no oncocíticas, que muestran una incidencia comparable de las diversas anomalías genéticas, como la RET /PTC reordenamientos y mutaciones BRAFV600E [6,14,15,16,17,18]. Aunque las primeras recomendaciones consideran todos los tumores tiroideos malignos oncocíticas, estudios posteriores han demostrado que mientras los casos fueron estratificados correctamente de acuerdo con sus características clínico-patológicas, tales como la edad de los pacientes, la estadificación de los tumores y quirúrgico procedimiento-el pronóstico de los pacientes con la célula oncocítico PTC y FTC variantes es similar a la de los pacientes con carcinomas convencionales respectivas, no oncocíticas [3,5,17,19].
las principales diferencias entre los tumores oncocíticas y no residen en el oncocíticas frecuencia de las variaciones que se encuentran en el ADN mitocondrial (ADNmt) y genes de ADN nuclear que codifican proteínas mitocondriales [2,5,20,21]. De estos, una gran deleción 5 kb, a menudo referido como el "deleción común" que elimina un número de genes de ADNmt e interrumpe la replicación del ADNmt y la transcripción, se encuentra con frecuencia en tumores de tiroides oncocíticas y se asocia con un aumento de masa mitocondrial [20, 22,23,24].
los datos registrados sugieren que las mutaciones en la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) los genes, es decir, en los genes del complejo I, pueden resultar en el deterioro del sistema de la fosforilación oxidativa y pueden conducir a la acumulación de mitocondrias anormales [ ,,,0],20,25]. El uso de herramientas bioinformáticas, recientemente hemos demostrado que las mutaciones del ADN mitocondrial de alta patogenicidad, es decir, en los genes para el Complejo I, conducen al fenotipo oncocítico [21].
Las variantes de la translocasa de la membrana mitocondrial interna 44 homólogo (timm44) que se parte del sistema de importación de proteína mitocondrial también se han descrito en las formas familiares de tumores de tiroides oncocíticas; esto sugiere que la desregulación de la maquinaria de importación mitocondrial y por consiguiente de la función mitocondrial se asocian con la biogénesis mitocondrial anormal [26].
Una característica notable de la mitocondria acumuladas en los tumores de células oncocíticas es su ultraestructura anormal y morfología. Esto indica una desregulación también en las proteínas que controlan la dinámica mitocondrial, las proteínas "mitocondrias conformación", un proceso que depende de la fusión mitocondrial y la fisión y inextricablemente ligado a la biogénesis mitocondrial, la distribución, la señalización y la apoptosis [27,28,29]. Curiosamente, el desequilibrio del fenotipo mitocondrias hacia la fragmentación orquesta la capacidad migratoria de las células, donde la migración representa una función fisiológica fundamental, como los linfocitos de células T y células metastásicas tumorales [30,31]. De hecho, con el fin de hacer posible el movimiento, las mitocondrias necesitan ser fragmentado para favorecer su relocalización y la captación de regiones subcelulares específicos. En el caso de células tumorales, una correlación directa se ha demostrado entre el grado metastásico y la fragmentación Drp1 dependiente de la mitocondria en cáncer de mama [31]. la fisión mitocondrial requiere la dynamin citosólica relacionados con la proteína 1 (Drp1) y sus receptores mitocondriales de fisión 1 (Fis1), el factor de fisión mitocondrial (MFP) y la División mitocondrial (mediana) 49 y 51. Por el contrario, la mitofusina membrana externa (NMF) 1 y 2 y la membrana interna dynamin-como atrofia óptica proteína 1 (OPA1), mediar en la fusión mitocondrial [32,33]. A pesar de las alteraciones morfológicas mitocondriales conocidos observados en los tumores de células oncocíticas, el conocimiento acerca de los niveles y el papel de estas proteínas mitocondrias que dan forma es escasa. Por lo tanto, nos propusimos investigar si la dinámica mitocondrial alterada en los tumores de las células de la tiroides oncocíticas. Nuestros datos indican que las proteínas de fisión mitocondrial Drp1 y Fis1 se sobreexpresa en tumores de células oncocíticas, y que los niveles de expresión se correlaciona con Drp1 oncocítico malignidad del tumor de células
ex vivo y con la capacidad de migración de una línea de células tumorales de tiroides oncocítico
in vitro
. Curiosamente, el bloqueo genética y farmacológica de Drp1 reduce la migración de la línea celular tumoral oncocítico, que ofrece un nuevo enfoque terapéutico para hacer frente a los tumores de células metastásicas oncocíticas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el presente estudio se llevó a cabo bajo la ley ética y reguladora nacional para el uso de muestras biológicas. El material utilizado en este estudio proviene del "Banco de Tecidos e Tumores" (Banco tumores y tejidos) del Hospital de São João, Oporto, que recoge todas las muestras con el consentimiento informado por escrito de los pacientes, o sus tutores en el caso de la menores de edad. Para tener acceso a estas muestras, los investigadores deben presentar un proyecto a la Comisión de Ética del Hospital de São João para su aprobación. Nuestro proyecto ha sido aprobado.
Selección de pacientes
Una serie de 88 tumores de tiroides fueron recuperados de los archivos de Servicio de Anatomía Patológica del Hospital de S. João (HSJ), Oporto. muestras de tiroides fueron obtenidas de pacientes con edades comprendidas entre 15 y 83 años de edad. La histología de todas las muestras tumorales fue revisado de forma independiente por dos patólogos (ER) y del SMS y la clasificación final se hizo de acuerdo a los criterios de la OMS [34]. El diagnóstico de los tumores tiroideos fueron los siguientes: adenoma folicular de tiroides (FA, n = 19; 12 oncocítico y 7 no oncocítico), carcinoma de tiroides folicular (FTC, n = 7; 1 oncocítico y 6 no oncocítico), variante folicular del carcinoma papilar de tiroides (FVPTC, n = 30; 8 y 22 oncocítico no oncocítico), carcinoma papilar de tiroides convencional (CPTC, n = 32; 9 y 23 oncocítico no oncocítico).
Debido a la corta el seguimiento de los casos incluidos en esta serie ya la consiguiente número limitado de episodios de muerte, no se analizó la supervivencia global. El presente estudio se llevó a cabo bajo la ley ética y reguladora nacional para el uso de muestras biológicas.
Tejido de microarrays (TMA)
zonas representativas de diferentes lesiones fueron cuidadosamente seleccionados en hematoxilina y eosina-manchado secciones y se marcan en bloques de parafina individuales. Dos núcleos de tejido (3 mm de diámetro cada uno) fueron obtenidos de todos los especímenes seleccionados y se depositaron con precisión en duplicadas TMA bloques de parafina receptor utilizando un instrumento de tejido-array (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) como se describe en otro lugar [35]. En cada bloque de microarrays de tejidos, también se incluyeron las áreas de tejido de la tiroides no neoplásico como controles. 3 micras múltiples secciones fueron cortadas de los bloques de TMA y se transfirieron a ultrafrost diapositivas.
El análisis inmunohistoquímico
Las técnicas de inmunohistoquímica (IHC), se realizó en las secciones incluidas en parafina fijadas en formol-3μm. Las secciones se desparafinaron y se rehidrataron en una serie decreciente de concentración de soluciones de etanol. especímenes individuales Deparaffinized así como TMA secciones estaban sujetos al calor inducida por la recuperación de antígeno, ya sea en 10 mM pH 6 tampón de citrato (citrato de sodio) o en 1 mM pH 8 etilendiamina tampón de ácido tetraacético (EDTA) (LabVision Corporation, Fremont, CA, EE.UU.), en una microondas fijado en 300Watts durante 10 minutos.
Después de soluciones de recuperación se habían enfriado, los tejidos fueron sometidos durante 10 minutos para bloquear la actividad peroxidasa endógena y de la unión no específica con 3% de H
2O
2 y con el gran volumen Ultra V Bloque reactivo (Thermo Scientific /Vision Lab, Fremont, EE.UU.) en función del sistema de detección utilizado
.
las secciones fueron incubadas en una cámara humidificada con los siguientes anticuerpos primarios y, en consecuencia con las especificaciones del fabricante: anticuerpo policlonal de conejo específico para Fis1 (1: 100) ref. ALX-210-907 de Alexis Biochemicals, ahora Enzo Life Sciences (Farmingdale, Nueva York, EE.UU.), anticuerpo monoclonal de ratón específico para Drp1 (1: 100) ref. 611 112 y el anticuerpo monoclonal de ratón específico para OPA1 (1: 100) ref. 612.607, ambos de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.), policlonal de conejo específico para MFN1 (1: 250) ref. sc-50330 (Santa Cruz de Biotecnología de Santa Cruz, EE.UU.), anticuerpo monoclonal de ratón específico para la Mfn2 (1: 400) ref. 9927-M03 de Abnova, (Jhongli City, Taiwán). Como control para el anticuerpo policlonal de ratón contenido mitocondrial específico para SDHA (1: 2000) ref. MS203, desde Mitosciences, ahora Abcam se utilizó (Cambridge, UK). controles positivos probados anteriormente de tiroides, mama y el músculo se incluyeron para todos los anticuerpos en la serie. Los controles negativos se llevaron a cabo mediante la sustitución del anticuerpo primario con suero de ratón no inmune
.
La técnica de inmunohistoquímica se realizó con un estreptavidina-biotina inmunoperoxidasa sistema de detección marcada (Thermo Scientific /Vision Lab, Fremont, EE.UU.) o el G Envision /2 System /AP (K5355, Dako, Dinamarca) según las instrucciones del fabricante.
para MFN1 y SDHA la tinción inmunohistoquímica se desarrolló con DAB (3,3'-diaminobenzidina) sustrato. Para los anticuerpos restantes la inmunotinción se realizó con o la /2 System /AP (K5355, Dako, Dinamarca), y las muestras Envision G se desarrollaron con un cromógeno rojo permanente.
inmunotinción fue ciegamente semi-cuantitativamente evaluada por dos observadores (VM y AFS) sin conocimiento de toda la información clínica de los casos; Se obtuvo una puntuación de IHC a través de la suma de la intensidad de la tinción (0- ausente; 1- débil; 2- moderada; 3- fuerte) por la extensión de las células tumorales teñidas (1-0 a 25%; 2-25 a 50% ; 3-50 a 75%; 4- & gt; 75%). Evaluación del porcentaje de células inmunorreactivas para todos los anticuerpos se realizó mediante el recuento de 300 células tumorales en campos aleatorios. En todos los casos discrepantes se llegó a un consenso. Como marcador mitocondrial, y como un medio para evaluar la cantidad de mitocondrias, se accedió a SDHA niveles de expresión y se utilizan para normalizar los resultados. En cada muestra, se comparó la expresión de las proteínas de interés, tanto en tejido normal y tumoral, contra las manchas SDHA. Por lo tanto, para cada caso, hemos sido capaces de evaluar de manera individual y precisa los cambios en la expresión de la proteína en el estudio independiente de la cantidad de mitocondrias, indicados por la expresión SDHA.
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer de tiroides: TPC1 (amablemente proporcionados por Dumont JE y Mareel M-Instituto Nacional de Investigación del Centro del cáncer, Tokio, Japón), una línea celular derivada de PTC, y XTC.UC1 (MG de Wong y Savagner F- Servicio de Cirugía, Centro Médico de Veteranos, San Francisco, California), una línea celular obtenida de una variante del carcinoma folicular oncocítico, se utilizaron en este estudio. Ambas líneas celulares se habían caracterizado previamente en el nivel molecular y genotípica [36,37]. células TPC1 se cultivaron con medio RPMI con Glutamax suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS), 1% (v /v) Pen Strep y 0,5% (v /v) de fungizona (todos de GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.); XTC.UC1 se mantuvo con DMEM /F12 (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 10% (v /v) FBS, insulina a 10μg /ml, TSH a 10 mU /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU. ), 1% Pen Strep (/v) y 0,5% (p /v) fungizona v v. Ambas líneas celulares se autentican mediante análisis de perfiles de ADN, obtenida con el sistema PowerPlex 16 (Promega, Madison, EE.UU.), de acuerdo con los perfiles de ADN disponibles en la American Type Culture Collection y Ciencia Banco de Recursos de Investigación de la Salud.
Las construcciones y transfecciones
Citoplasmáticos GFP (ctGFP), las mitocondrias, dirigida DSred (mtRFP), las mitocondrias, dirigidos YFP (mtYFP) y plásmidos pcDNA3.1-HA-K38A-Drp1 fueron descritas anteriormente y fueron un regalo de T. Pozzan (veneciana Instituto de Medicina Molecular, Padua, Italia) [33]. El pcDNA3.1 vacío se obtuvo de BD-Clontech y la generación de plásmido pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 se describió anteriormente [33]. XTC.UC1 líneas celulares fueron transfectadas transitoriamente por electroporación utilizando el Sistema de neón de transfección (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). En co-transfecciones experimentos, 1.5μg de soporte para señalización (ctGFP en transwell experimentos) más 3μg de pcDNA 3.1 o pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 fueron utilizados por 2.0x10
6 células. La combinación específica de plásmidos transfectados en cada experimento se indica en las leyendas de las figuras. Después de 24 h, las células transfectadas fueron ordenados por FACS y se utilizaron para experimentos 24h después.
PCR cuantitativa
Para la preparación de ADNc, 1 ng de ARN total fue transcrito invertir utilizando el kit de síntesis de la primera cadena de ADNc RevertAid ( Fermentas, Burlington, ON, Canadá). productos de transcripción inversa se amplificaron para todos los genes mencionados por qPCR utilizando TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para el análisis de datos
La actina
y
hCyclophilin
se utilizaron como controles endógenos (datos que se muestran sólo para actina). Los datos se expresan como la expresión relativa de cada gen individual normalizado a los controles correspondientes.
El ABI PRISM 7500 secuencia rápida Sistema de Detección (Applied Biosystems) se utilizó para detectar el nivel de amplificación y se programó para una etapa inicial de 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Se utilizó 50 ng de cDNA para cada muestra y todas las amplificaciones se realizaron por triplicado. La cuantificación relativa de los genes diana se determinó utilizando el método ΔΔCT, que anteriormente fue validado por Regresión Lineal Método de Livak (slope¼0.0696) (Detector de Secuencia usuario Boletín 2; Applied Biosystems).
Fraccionamiento subcelular y la inmunotransferencia
fraccionamiento subcelular se llevó a cabo como se describe en Frezza
et al
. [38]. fracciones mitocondriales y citosólicas se obtuvieron y se transfirieron con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Tom20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz de Biotecnología de Santa Cruz, EE.UU.) y un anticuerpo policlonal de cabra anti-actina (1: 2000) sc1616 ref (Santa Cruz de Biotecnología de Santa Cruz, EE.UU.). Las células se lisaron en tampón RIPA, en presencia de inhibidores de fosfatasa y proteasa. cantidades similares de proteína total se resolvieron por SDS-PAGE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare, Little Chalfont, Inglaterra). Hemos utilizado como anticuerpos primarios, los que ya se hace referencia en la sección de inmunohistoquímica (todos a una dilución de 1: 1000). Para la detección de la proteína, se utilizaron un anticuerpo de rábano picante conjugado con peroxidasa secundaria (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) y un sistema de luminiscencia (Perkin-Elmer, Foster City, EE.UU.). Las membranas se volvieron a sondar con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Tom20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz de Biotecnología de Santa Cruz, EE.UU.) para el control de la carga de proteínas. expresión de la proteína se cuantificó usando el Bio-Rad Cantidad Uno de software de análisis 1-D.
Microscopía electrónica
Las células se prepararon usando un procedimiento de fijación de microscopía electrónica convencional y las imágenes fueron tomadas usando un technai 20 ( FEI, Eindhoven, Países Bajos). Las diferencias en el tamaño de la mitocondria entre las líneas celulares se calcularon utilizando toda la superficie mitocondrias. Un mínimo de 15 mitocondrias se midieron por célula y por lo menos 5 células por espécimen diferentes se utilizaron al azar para la medición de tamaño. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
imágenes de la red mitocondrial
Para cuantificar estructural fragmentación de la red mitocondrial, las células fueron cultivadas en placas con fondo de cristal, transfectadas con mitocondrial específica de la proteína fluorescente de color amarillo y rojo, y mtYFP mtRFP respectivamente, y después de 24 horas se fijaron con helado de 3,7% de formaldehído durante 30 minutos. Las células que expresan mtRFP se obtuvieron imágenes con el microscopio Zeiss 510 META confocal de barrido láser utilizando un Plan-Apocromático objetivo 100 /1.46NA con un zoom digital de 2x (excitación a 561 nm, emisión grabada por encima de 575 nm. Por cada línea celular o condición al menos 25 azar Las células seleccionadas fueron imágenes y cuantificados de acuerdo a su red mitocondrial. Un plan-Apocromático 100x (1.46NA) y el objetivo zoom de 2x se utilizaron para las células de una sola imagen. Las imágenes digitales fueron procesadas usando ImageJ 1,47 (National Institutes of Health-NIH, Bethesda Estados Unidos, MD, EE.UU.).
arañazos de la herida ensayo
Las células se cultivaron hasta cerca de 90% de confluencia en placas de 6 pocillos. en condiciones asépticamente una delgada "herida" fue introducido por el rascado con una pipeta 10μl células de la punta y que fueron separados fueron lavadas con PBS. el uso de un contraste de fases establecido y un 40x de magnificación total fotografías fueron tomadas cada 5 minutos durante un total de 15 horas. se realizaron cinco mediciones diferentes por campo utilizando las fotografías tomadas a los 0, 3, 6 , 9, 12 y 15 horas utilizando el software ImageJ. Información más detallada sobre esta metodología ha sido publicado previamente [39]. Las imágenes fueron procesadas con el software ImageJ.
Ensayos
migración /invasión
transfectadas transitoriamente TPC-1 y XTC.UC1 células se volvieron a suspender en RPMI libre de suero y con DMEM /F12, respectivamente, con 0,1 % de FBS y se sembraron en la cámara superior de un transwell placa de 12 pocillos (Corning Costar). Las placas Transwell fueron pre-recubiertas con 5μg /ml de fibronectina (F2006-1MG, Sigma Aldrich) y se incubaron a 37 ° C 5% de CO 2
durante 4 h. Las placas se aclararon con PBS1X a pH 7,4 antes de añadir las células 100.000 por pocillo. Las cámaras inferiores se rellenaron con el medio respectivo suplementado con 10% FBS. Después de 12 horas de ensayo, las membranas Transwell fueron extirpados, invertido y se tiñeron con DAPI en un portaobjetos de vidrio. Se contaron los núcleos visibles en el lado que mira hacia abajo de la membrana. Un mínimo de 5 campos diferentes fueron contados para cada diapositiva y se hizo por triplicado para cada ajuste experimental. Mdivi1 inhibidor se utilizó a 50 micras sobre la base de los datos anteriores publicados y en ausencia de cambios en las células tóxicos o estrés observables [40]. No se encontraron diferencias entre las células tratadas con Mdivi1 desde el tiempo cero o pre-tratada 1 hora antes del comienzo del ensayo.
El análisis estadístico
El análisis estadístico de los resultados de IHC se realizó con VISTA STAT -J 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). La relación entre el nivel medio de expresión (puntuación) de los marcadores inmunohistoquímicos y la histopatología de los diferentes casos fueron evaluados por ANOVA; los resultados se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor de p & lt; 0.05. Cuando, múltiples correcciones de comparación adecuadas se realizaron con el Bonferroni test post hoc /Dunn y, por indicación del programa, comparaciones sólo se consideraron significativas cuando el valor de p & lt; 0,0018.
Cada
Análisis in vitro
se llevó a cabo al menos por triplicado y la media obtenida de este modo se utilizó para la prueba t de Student independiente. Todos los datos se expresan como media ± SE, como se indica en las leyendas de las figuras.
Resultados
de Mfn2, OPA1, Drp1 y Fis1, se sobreexpresa en tumores de células oncocíticas y Drp1 sobreexpresión es asociado con tumores de células malignas oncocíticas
los llamados "mitocondrias-configuración" proteínas son reguladores clave de la forma de las mitocondrias y su dinámica. La red mitocondrial, de hecho, se define por el equilibrio altamente regulado entre los procesos de fusión y de fisión, dependiendo de las necesidades fisiológicas de la célula. Entre varios procesos celulares y condiciones fisiopatológicas, las proteínas de mitocondrias de conformación también actúan sobre la homeostasis del tamaño de orgánulos y el número de [4,28,29,32]. Una vez que los tumores de células oncocíticas difieren de los no ococytic por una acumulación anormal de las mitocondrias con una morfología alterada en el citoplasma celular, la hipótesis de que la dinámica mitocondrial podrían tener un papel en la fenotípica y fisiológica definición oncocítica [11,12,13] . Por lo tanto, hemos realizado un análisis histológico de los principales "mitocondrias para la conformación de" los niveles de proteína en varias muestras de tumores de tiroides humanos histológicos. La figura 1 muestra micrografías de inmunotinción representativos de las proteínas "mitocondrias para la conformación de" observadas en diferentes tipos histológicos de tumores de tiroides, incluyendo 1 carcinoma de tiroides folicular oncocítico (FTC), 6 no oncocítico FTC, 8 variante folicular oncocítico del carcinoma papilar de tiroides (FVPTC) , 22 FVPTC no oncocítico, 9 oncocítico carcinoma papilar de tiroides convencional (CPTC), 23 no oncocítico CPTC, 12 oncocítico adenoma folicular de tiroides (FA) y 7 no oncocítico FA. IHC micrografías representativas de una lesión benigna oncocítico (OFA), una lesión maligna oncocítico (OPTC) y una lesión no oncocítico (el noFVPTC), los histotypes de interés principal en este trabajo, se presentan en la figura 1A, 1B y 1C. Dado que la expresión de las proteínas "mitocondrias de conformación" en el parénquima adyacente normal fue de cero, o solamente detectable por debajo de la puntuación de 2, se omiten en los histogramas de los niveles de expresión de dichas proteínas en el tejido normal. Con la excepción de MFN1, hemos identificado un aumento de los niveles de expresión de las otras proteínas estudiadas, en los tumores de células oncocíticas
vs
. los no oncocíticas y en los cuatro tipos histo-analizados (FVPTC, FTC, CPTC y FA) (figuras 1 y 2A).
micrografías representativas que muestran la inmunotinción de anticuerpos MFN1, MFN2, OPA1, Drp1 y Fis1 en el tejido normal de la tiroides (NT) y en el tejido tumoral de un oncocítica folicular adenoma-OFA) (a), un oncocítica papilar de tiroides carcinoma-OPTC (B) y una variante folicular no oncocítica de carcinoma papilar de tiroides-noFVPTV (C) a una ampliación total de 300x. puntas de flecha negras ilustrativos denotan manchado midieron las zonas tumorales con un mayor gradación de noFVPTV, a la OFA y finalmente OFTC. "# MFN1-Mitofusina 1, de Mfn2-Mitofusina 2, OPA1-atrofia óptica 1, relacionado Drp1-Dinamina proteína 1, la fisión Fis1-mitocondrial 1 proteína.
se evaluó la inmunotinción de MFN1, la Mfn2, OPA1, Drp1 y Fis1, teniendo en cuenta todos los tumores tiroideos (a y B), los tumores tiroideos oncocítico solos (C) o la no tumores de tiroides -oncocytic solo (D). La expresión del antígeno media se calculó como se describe en Material y Métodos. Los resultados se muestran en marcar como media ± SEM. * P & lt; 0,05 (prueba t no pareada).#MFN1-Mitofusina 1, de Mfn2-Mitofusina 2, OPA1-atrofia óptica 1, Drp1-Dinamina relacionados con la proteína 1, Fis1-mitocondrial de fisión 1 proteína.
de Mfn2 y la Drp1 a favor de la fisión se sobreexpresan significativamente en el oncocitoma malignas
en un análisis más profundo de las muestras histológicas de los tumores tiroideos humanos, MFN1 era la única proteína mitocondrias-configuración para mostrar diferencias significativas en los niveles de expresión, independientemente del fenotipo o tipos tumorales en comparación (Fig 2A-2D). Un aumento general de los niveles de las otras proteínas analizadas, independientemente de su pro-fusión o papel pro-fisión, fueron significativamente mayores en los tumores oncocíticas en comparación con los de los no oncocíticas (4,2 ± 0,2
vs
2,9 ± 0,2, p & lt; 0,0001 para la Mfn2; 3,3 ± 0,3
vs
2,3 ± 0,2, p = 0,01 para OPA1;. 4,7 ± 0,2
vs
3,0 ± 0,2, p & lt.; 0,0001 para Drp1; 4,9 ± 0,1
vs
3,5 ± 0,2, p & lt;. 0,0001 para Fis1), como se muestra en la cuantificación IHC de la figura 2A (Fig 2A). En contraste, no hubo una diferencia apreciable para cualquiera de estas proteínas, cuando comparamos maligna
vs
. tumores benignos, sin distinguir y agrupar las muestras en oncocítico o no oncocítico (3,5 ± 0,2
vs
3,0 ± 0,3, p = 0,31 para la Mfn2;.. 2,8 ± 0,2
vs 2,3 ±
0,4, p = 0,28 para OPA1; 3,8 ± 0,2
vs
3,5 ± 0,4, p = 0,48 para Drp1;.. 4,1 ± 0,1
vs
3,9 ± 0,34, p = 0,71 para Fis1) (Fig 2B). Por lo tanto, parece que la alteración de la maquinaria responsable de la morfología mitocondrial está estrictamente relacionada con el fenotipo oncocítica, en lugar de a la agresividad tumoral global. Por otra parte, dentro de los tumores no oncocíticas no se encontraron diferencias en los niveles de expresión de proteínas mitocondriales dinámica entre tumores benignos y malignos (Figura 2D). Sin embargo, si tenemos en cuenta el grado de severidad del tumor, sólo dentro del fenotipo oncocítico, curiosamente se observa que la Mfn2 y Drp1 son significativamente más abundantes en los carcinomas en comparación con los adenomas benignos contrapartes '(4,5 ± 0,2
vs
. 3,4 ± 0,4, p = 0,012 para la Mfn2 y 5,1 ± 0,2
vs
. 4,0 ± 0,5, p = 0,038 para Drp1 (figura 2C). Es de destacar que estas diferencias no están relacionadas con diferencias en el número mitocondrial ( Fig S1). Esto sugiere que dentro de los tumores de células oncocíticas, la dinámica mitocondrial asumen un papel en la definición de la malignidad del tumor y la agresividad.
Drp1 acumula activamente en las mitocondrias y la red mitocondrial desequilibrio hacia la fisión
con el fin de aclarar e investigar a fondo el papel de la alteración dinámica mitocondrial en tumores de células oncocíticas, nos cambiamos a
in vitro
experimentos en líneas celulares de cáncer de tiroides: dos XTC.UC1, que es la única línea celular oncocítico disponibles, con la derivación de carcinoma, y TPC1, una línea de células de la tiroides no oncocítico, utilizados con fines comparativos. En primer lugar, se evaluó en las dos líneas celulares el nivel de expresión de las mismas proteínas de fusión /fisión estudiadas en las muestras de tumores humanos.
Por Western blot, que hemos detectado, en la línea celular oncocítico, la misma tendencia de * P & lt;