Extracto
La actividad proteolítica de la furina responsable del tratamiento de larga duración Notch-1 (p300) juega un papel crítico en la señalización de Notch. La amplitud y la duración de la actividad de Notch se pueden regular en varios puntos de la vía, pero no ha habido ningún informe respecto a la regulación de la interacción Notch-1-furina, a pesar de su importancia. En el presente estudio, encontramos que la interacción Notch-1-furina está regulada por la tirosina quinasa no receptor, c-Src. c-Src y Notch-1 están físicamente asociados, y esta asociación es responsable de Notch-1 y la activación de procesamiento. También se encontró que el factor de crecimiento TGF-α, un ligando de EGFR, y PDGF-BB, un ligando PDGFR, inducen la interacción Notch-1-furina mediada por c-Src. Nuestros resultados apoyan tres nuevas y provocadoras conclusiones: (1) La asociación entre Notch-1 y furina es un proceso bien regulado; (2) crecimiento extracelular señales del factor regulan esta interacción, que está mediada por c-Src; (3) No hay diafonía entre los factores de crecimiento plasma receptor-c-Src y Notch vías. Co-localización de Notch-1 y c-Src se confirmó en los tejidos tumorales de xenoinjertos y en los tejidos de pacientes con cáncer pancreático. Nuestros resultados tienen implicaciones para el mecanismo por el cual las vías del receptor c-Src señalización Notch y el factor de crecimiento regulan el crecimiento celular y el cáncer de carcinogénesis
Visto: Ma. YC, Shi C, Zhang YN, Wang LG, Liu H , Jia HT, et al. (2012) La tirosina quinasa c-Src medie Directamente factor de crecimiento inducido activación de Notch-1 e Interacción de Furin y Notch-1 en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (3): e33414. doi: 10.1371 /journal.pone.0033414
Editor: Laszlo Buday, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 3 Noviembre 2011; Aceptó 8 de febrero de 2012; Publicado: 30 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30873033 a YXZ) y programas del Estado Mayor básico de investigación de Desarrollo (2009CB521800 y 2010CB529400 a YXZ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. FHS ahora sirve como un editor de PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de páncreas tiene el peor pronóstico de todos los principales tipos de cáncer y sigue siendo la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los Estados Unidos y en todo el mundo [1]. Esto podría ser debido al hecho de que no hay métodos efectivos de diagnóstico precoz son actualmente disponibles, así como la falta de terapias eficaces. Se ha informado de que la red de señalización Notch es frecuentemente desregulado en tumores malignos humanos incluyendo los cánceres de páncreas, con la expresión regulada hasta de receptores Notch y sus ligandos [2]. la señalización de Notch está implicada en la proliferación celular y la apoptosis, que afectan el desarrollo y la función de muchos órganos.
Notch
genes codifican proteínas que pueden ser activados por la interacción con una familia de ligandos [3] . Notch-1 está presente en la superficie celular como una molécula heterodimérica (p120 /p200), mientras que la proteína precursora (p300) probablemente no llega a la superficie de la célula y se escinde en p120 y p200 en la red trans-Golgi (TGN) por La furina (S1 escisión) [4], [5]. La unión del ligando induce la escisión secuencial de receptores Notch, primero la escisión del dominio extracelular (ECD) por ADAM (una desintegrina y metaloproteasa) TACE proteinasa (S2 escisión) y después del dominio transmembrana por un complejo enzima γ-secretasa (escisión S3), liberar el dominio intracelular (NICD) [3], [6]. Este último se transloca al núcleo, donde se asocia con el CSL proteína de unión al ADN (CBF1 /rbpj-κ) para regular la transcripción de genes múltiples efectoras, incluyendo miembros del /de la familia de HES HEY [7]. Recientemente, Lago et al nuevo demostró una correlación entre la pérdida de la escisión por furina y la pérdida de
in vivo
función del receptor Notch, apoyando la noción de que S1 es una escisión
in vivo
mecanismo de control Notch-1 de señalización [8]. Por lo tanto, la actividad proteolítica responsable del procesamiento de p300 desempeña un papel crítico en Notch-1 de señalización, ya que determina la estructura del receptor. Sin embargo, no está claro si la escisión de Notch por furina es un estocástico, o bien proceso a regular.
Hemos examinado varios inhibidores de la quinasa y se encontró que los inhibidores de la quinasa Src inhibidas Notch-1 y la unión de Furin. c-Src es un 60000 no receptor de tirosina quinasa producto Mr del proto-oncogén c-Src, y el homólogo celular de la proteína transformación de virus del sarcoma de Rous, v-Src [10] (Ishizawar y Parsons, 2004). La acumulación de pruebas implica Src como un determinante importante de la tumorigénesis, invasión y metástasis [9]. c-Src se sobreexpresa en más del 70% de las líneas celulares de carcinoma de páncreas, y la actividad de la quinasa Src con frecuencia es alta [10]. Por lo tanto, Src y Notch-1 son proteínas importantes que afectan el crecimiento de células de cáncer de páncreas, la invasión y la metástasis. En el presente estudio, se detectó una interacción directa entre estas proteínas. También se encontró que la interacción entre Notch-1 y de Furin es no estocástico, sino más bien bien regulado, ya que c-Src se une a Notch-1 y estimula la interacción Notch-1 y furina. Encontramos que la unión de EGFR y PDGFR por sus ligandos también estimuló la interacción Notch-1-furina, lo que indica que las señales del factor de crecimiento extracelular pueden regular directamente la activación Notch-1 en el aparato de Golgi trans-.
Resultados
1. Efectos de los inhibidores de Src en inducida por furina Notch-1 de escisión
Para investigar el cual quinasa o quinasa de la familia está implicada en la regulación de la inducida por furina Notch-1 de escisión, se probaron varios inhibidores de la quinasa. Las células en crecimiento BxPC-3 y HPAC se trataron con las concentraciones indicadas de PP2 o SU6656 y los extractos se sometieron a electroforesis y se transfirieron para la detección de Notch-1. El Src quinasa inhibidor PP2 reducida escisión de longitud completa Notch-1 más de dos veces. Después del pretratamiento con PP2 durante 20 minutos, los productos 120 kD de escisión de Notch-1 disminuyeron y de longitud completa de proteína Notch-1 aumentaron (Figura 1A). También proporcionamos una exposición más ligera de una transferencia Western similar en el panel inferior de la figura 1A para mostrar la disminución del producto de 120 kD de escisión más claramente. la inhibición inducida por PP2 de longitud completa Notch-1 de escisión parecía ser dependiente de la dosis (datos no mostrados).
(A) Src inhibidores PP2 y SU6656 induce la inhibición de la longitud completa de procesamiento de Notch-1 por furina en HPAC células del cáncer pancreático. células HPAC se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS. Las células se trataron con 10 mM de PP2 o SU6656 de 60 min. Se realizaron transferencias Western con anti-Notch-1 anticuerpo. Panel inferior, la disminución de Notch-1 /p120 se muestra en una exposición más ligera de una transferencia de Western similar. Notch-1 p300, FL proteínas Notch de longitud completa; p120 Notch-1, escinden las proteínas Notch. (B) El ligando EGFR TGF-α induce de longitud completa Notch-1 de escisión, que se reduce por c-Src PP2 inhibidor tanto en las células de cáncer de páncreas HPAC y BxPC3. Las células fueron suero starvated durante 48 horas, se trató con PP2 10 M durante 60 min, y luego tratados con 7 nM TGF-α de 20 min. Se realizaron transferencias Western con anticuerpos beta-actina anti-Notch-1, fosfo-c-Src, c-Src y. p-c-Src, fosfo-c-Src.
Si bien es cierto que PP2 inhibe selectivamente quinasas Src, a concentraciones más altas, PP2 También se sabe que el inhibidor de EGFR. Hemos llevado a cabo experimentos de dosis-respuesta y se encontró que PP2 inhibe la c-Src con una IC50 de 4 M en células HPAC (Figura S1), pero 10 M PP2 única actividad EGFR inhibido en un 45%, lo que indica PP2 inhibe la actividad de EGFR con una CI50 más de 10 M en el sistema de cultivo celular (Figura S2). Como 10 M PP2 inhibe la actividad de c-Src en un 77%, parece PP2 inhibe Notch-1 de escisión principalmente a través de c-Src, pero no a través del EGFR, a pesar de que no podía descartar la posibilidad de que la inhibición directa de EGFR contribuye poco a PP2 inducida por la baja regulación de Notch-1 escote. SU6656, que pertenece a una clase estructural diferente de los inhibidores de la quinasa Src tuvo un efecto similar sobre Notch-1 como la escisión PP2 (Figura 1A).
También probamos si la actividad de c-Src inducida por el factor de crecimiento afecta Notch 1 de activación. La proliferación HPAC y células BxPC-3 se sembraron en medio de crecimiento estándar durante 24 horas y se transfirieron a DMEM libre de suero durante 48 horas para permitir que los receptores que se equilibre en la superficie celular. Ellos se trataron a continuación durante 60 minutos con PP2 antes de la estimulación con 7 nmol /L TGF-α. Después de 20 minutos, se prepararon lisados de células enteras, y los extractos se sometieron a electroforesis y se transfirieron para detectar Notch-1, p-c-Src, y β-actina. La Figura 1B demuestra marcada activación de c-Src en las células TGF-alfa-tratada. El pretratamiento de las células con PP2 10 M durante 60 min resultó en una inhibición casi completa de la fosforilación de c-Src en todas las líneas celulares ensayadas (Figura 1B). En las células HPAC y BxPC3 expuestos a la escisión TGF-α de Notch-1 aumentaron aproximadamente 2 y 3 veces, respectivamente, y estos aumentos también fueron inhibidos por el tratamiento previo con PP2 (Figura 1B).
2. aumentos de TGF-alfa CSL vinculante para el promotor Hes-1
Después de la escisión sucesiva por furina, TACE y γ-secretasa, Notch-1 NICD se libera de la membrana plasmática y se transporta al núcleo, donde se asocia con la de unión a ADN CSL proteína (CBF1 /rbpj-κ) e induce la transcripción de varios genes efectores, incluyendo Hes-1. Para probar si el TGF-α induce la unión de CSL al promotor Hes-1 se realizaron ensayos de CHIP. Antes del tratamiento de TGF-α, se detectó una pequeña cantidad de CSL en el sitio de unión CSL de Hes-1, y ésta aumenta progresivamente tras el tratamiento de TGF-α de 30 y 60 min (Figura 2A). Para cuantificar mejor los cambios en CSL de unión al promotor Hes-1, se realizaron ensayos de Q-PCR en las muestras de astillas. CSL unión a Hes-1 de nuevo aumentado a 30 min y 60 min después del tratamiento TGF-α (Figura 2B).
(A) ensayo de CSL CHIP. células HPAC se cultivaron en medio libre de suero durante 48 horas, después se trató con 7 nM TGF-α de 0, 30, 60 min. muestras de cromatina se inmunoprecipitaron con anticuerpo CSL, el ADN se extrajo y se amplificó utilizando Hes-1 promotor cebadores para 35 ciclos de PCR. M, escalera de 100 pb de ADN. (B) Análisis de Q-PCR de muestras de ADN ChIP muestra que la asociación de CSL-1 TGF-α inducida con el promotor de Hes-1, lo que resulta en alrededor de 0,5, y 2- plegado aumenta en el 30 min y, 60 min punto de tiempo , respectivamente. Las desviaciones estándar se indican (n = 3).
Hemos demostrado previamente que la sobreexpresión de INET aumenta la proliferación de células de cáncer de páncreas y la invasión [11]. En el presente estudio, hemos hecho colonigenic ensayo y se encontró que la sobreexpresión de forma activa de Notch-1, Notch extracelular truncado (NEXT), aumentó significativamente la formación de colonias de células HPAC (Figura S3).
3. Efectos de los inhibidores de c-Src y factores de crecimiento en la interacción Notch-1 y de Furin
Para determinar si c-Src afecta a la actividad furina, que mide los efectos de PP2 y SU6656 sobre la actividad furina en las células BxPC3 y HPAC utilizando un ensayo de fluorescencia. PP2 y SU6656 sólo redujeron la actividad furina en un 30% (datos no mostrados), lo que no podría explicar la reducción de 2 veces en Notch-1 escote. Por lo tanto, razonó que los inhibidores de c-Src podrían afectar la interacción entre Notch-1 y furina. Las células tratadas con PP2 10 M o SU6656 durante 20 minutos y luego se realizaron ensayos de inmunoprecipitación para mirar a la asociación entre la furina y Notch-1. PP2 y SU6656 de hecho inhibieron significativamente de Furin-Notch-1 de unión (Figura 3A). Una densitometría cuantitativa para la Figura 3A se proporciona en la figura S4. A una concentración de 10 mM, PP2 y SU6656 redujo de Furin-Notch-1 asociación en un 53% y 43%, respectivamente (figura S4).
(A) Src inhibidor PP2 o SU6656 inhibe Notch-1 y de Furin asociación. células HPAC se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS sin privación de suero. Las células fueron tratadas con PP2 10 M o SU6656 de 60 min. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo. Una densitometría para la Figura 3A se proporciona en la figura S4. (B) PDGF-BB induce la interacción de Furin y Notch-1. La proliferación de células HPAC se suero starvated durante 48 horas, después se trataron con 20 ng /ml de PDGF-BB de 20 min. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo. (C) SU6656 inhibe inducida por PDGF asociación de Furin-Notch-1. La proliferación de células HPAC se suero starvated durante 48 horas, se trató con SU6656 de 60 min, y luego tratados con 20 ng /ml de PDGF durante 20 min. SS, la privación de suero; PDGF, PDGF-BB; FBS, las células se cultivaron en medio normal, DMEM suplementado con 10% de FBS sin privación de suero; Notch-1 p120, proteínas Notch escindida; Notch-1 p300, proteínas Notch FL. (D) El EGFR ligando TGF-α induce la activación de Src en Golgi. células transfectadas HPAC-RFP-B4GLT1 eran suero starvated durante 48 h y después se trató con 7 nM TGF-α. Las células fueron teñidas con anti-fosfo-Src (
verde
) anticuerpos para visualizar co-localización de fosfato Src (verde) y B4GALT1 marcador de TGN-RFP desfavorecidos.
Bar, España 10 micras.
Para probar si la actividad Src inducida por el factor de crecimiento afecta Notch-1 de activación y la interacción Notch-1-furina, BxPC-3 y HPAC células eran privaron de suero durante 48 horas y posteriormente se incubaron con 20 ng /ml de PDGF-BB durante 20 minutos. Los resultados de la Figura 3C revelan una marcada activación de c-Src en las células tratadas con PDGF-BB. En estas células co-inmunoprecipitación de longitud completa Notch-1 con furina aumentó más de 5 veces (Figura 3B). La forma principal de Notch-1 asociado con furina era de longitud completa (Figura 3B), en contraste con el Notch-1 que interactúa con c-Src, que era predominantemente p120 (Figura 4A). El tratamiento con 7 nmol /L TGF-α tuvo un efecto similar a PDGF-BB (datos no mostrados).
(A) associatesd c-Src con Notch-1 en células BxPC3. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-c-Src, y immunoblotteding (IB) se realizaron con anticuerpos anti-c-Src anti-Notch-1 y. IgG de conejo normal se utilizaron como controles negativos. (B) PP2 inhibe TGF-α inducida por c-Src y Notch-1 asociación. células HPAC suero starvated se trataron con 10 mM PP2 durante 60 minutos, después se trató con 7 nmol /L TGF-α de 20 min. IgG de conejo normal se utilizaron como controles negativos para IP. Las células cultivadas en medio normal (DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal) sin privación de suero se utilizaron como controles positivos. N, medio normal. (C) SU6656 inhibe inducida por TGF-α c-Src y Notch-1 asociación. Notch-1 /p300, proteínas Notch FL.; proteínas Notch Notch-1 /p120, se escindió. (D) Asociación de c-Src con Notch-1 es dependiente de su actividad quinasa. de tipo salvaje, Y416F, Y527F y fusionado con una etiqueta HA se transfectaron transitoriamente en células HeLa. lisados de células enteras se prepararon a continuación, se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Notch-1, y immunoblottedting (IB) se realizaron con anti-HA y anticuerpos anti Notch-1. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo.
A continuación, probado los efectos de los inhibidores de c-Src en el aumento inducido por PDGF-BB en Notch-1 y de Furin unión. El pretratamiento de las células con PP2 10 M o SU6656 de 60 min dio como resultado la inhibición en casi completa del aumento inducido por PDGF-BB en Notch-1 y la unión de Furin (Figura 3C). Estos hallazgos indican que las señales de factores de crecimiento extracelulares mediadas por c-Src inducen Notch-1 y de Furin unión y activar Notch-1.
Es bien aceptado que la longitud total Notch-1 cleavaged primero por furina en el TGN. Como factor de crecimiento TGF-α y PDGF-BB induce interacciones Notch-1-furina, nos preguntamos si el factor de crecimiento induce la activación de c-Src en el TGN. Las células transfectadas con HPAC B4GALT1 RFP-desfavorecidos como marcador TGN. Se demostró que B4GALT1 se encuentra principalmente en el TGN, y por alguna medida, medial Golgi [12]. se se añadieron células transfectadas HPAC-B4GALT1 suero starvated durante 48 horas y 7 nM TGF-α de 30 min. Para determinar si CSRC se activa en el TGN, nos fijamos en co-localización de fosfo-Src y B4GALT1 mediante microscopía confocal. Hemos demostrado colocalización de B4GALT1 RFP-desfavorecidos y immunoreactivty fosfo-c-Src en células TGF-a-tratada, pero no en las células control (Figura 3D). Los resultados indican que el TGF-α induce podría rápidamente la activación de c-Src en TGN.
4. c-Src asocia directamente con Notch-1 |
Nos preguntamos si c-Src quinasa afecta a la activación de Notch-1 directamente, o actúa indirectamente a través de otros efectores. BxPC3 células se lisaron y el lisado se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-c-Src, y Notch-1 se detectó mediante transferencia Western. Algunos Notch-1, tanto de longitud completa Notch-1 /p300 y Notch-1 /p120, se asoció con c-Src (Figura 4A). También immunoprecipitated Notch-1 y encontramos cantidades significativas de c-Src en los inmunoprecipitados Notch-1 (datos no presentados). Estos resultados indican que el c-Src físicamente asociados con Notch-1.
A continuación, preguntó si el factor de crecimiento estimulado la activación de c-Src podría conducir a una mayor asociación de c-Src y Notch-1. células HPAC se mueren de inanición de suero durante 48 horas y posteriormente se incubaron con 7 nmol /L TGF-α durante 30 minutos. En las células tratadas con TGF-α, co-inmunoprecipitación de tanto de longitud completa Notch-1 y Notch-1 /p120 con c-Src aumentó aproximadamente 3 veces, y fue inhibida por el pretratamiento con PP2 (Figura 4B) o SU6656 (Figura 4C ).
para demostrar que la actividad de la quinasa src es esencial para la asociación de c-src con Notch-1, generamos quinasa muertos y mutantes constitutivamente activos src. La actividad quinasa se ha desactivado mediante la mutación del sitio de tirosina Y416 a la fenilalanina (c-Src Y416F), mientras que constitutivamente activa Src Y527F se generó mediante la mutación de la tirosina 527 inhibitoria a la fenilalanina. Overexpressed estos mutantes en células HeLa y se evaluó la capacidad de los diferentes c-Src construye asociar con Notch-1. Notch-1 unida a la de tipo salvaje y formas constitutivas de c-Src, pero la unión a la quinasa mutante muertos se redujo más de 3 veces (Figura 4D). Estos resultados demuestran que se requiere la actividad quinasa de c-Src para una eficiente unión a Notch-1.
5. Co-localización de c-Src con Notch-1
in vivo
Para determinar si c-Src y Notch-1 co-localizar
in vivo
, se realizó la inmunotinción . Colocalización de Notch-1 y la inmunorreactividad de c-Src podría ser visto desde la fluorescencia amarilla cuando las imágenes de Cy3-manchado anti-Notch-1 y FITC-manchado inmunorreactividades anti-c-Src se fusionaron (Figura 5A). A continuación, prueba de co-localización de HA-etiquetados c-Src y endógena Notch-1. De tipo salvaje HA-c-Src se expresó en células HeLa. microscopía de fluorescencia confocal reveló co-localización de c-Src-HA y Notch-1 (Figura 5B), y la expresión de la bandera de etiquetado SIGUIENTE en células HeLa revelado co-localización de SIGUIENTE-FLAG y c-Src (Figura 5C).
(A) la interacción intracelular de c-Src y Notch1. c-Src y Notch-1 se visualizaron con un microscopio confocal.
Bar, España 10 micras. (B) Co-localización de HA-etiquetados c-Src y Notch-1. HPAC células fueron transfectadas con pcDNA3-c-Src-HA plásmido, y co-teñidas con anti-Notch-1 (
rojo
) anticuerpos anti-HA (
verde
) y visualizar endógena Notch-1 y HA-etiquetados c-Src, respectivamente.
Bar, España 10 micras. (C) Co-localización de endógena c-Src y truncamiento extracelular (NEXT) fragmento de Notch etiquetada con FLAG. HPAC células fueron transfectadas con pcDNA3-NEXT-FLAG plásmido, (
verde
) anticuerpos co-teñidas con anti-c-Src (
rojo
) y anti-FLAG para visualizar endógena c-Src y la bandera de etiquetado Notch-1 fragmento SIGUIENTE, respectivamente.
Bar, España 10 micras.
6. Los dominios de proteínas implicados en c-Src-Notch-1
de unión
c-Src se compone de SH3, SH2 y dominios quinasa cuya capacidad para unirse a diversas proteínas se han caracterizado. Hemos expresado una serie de c-Src mutantes de deleción en células HeLa para identificar las regiones necesarias para la asociación con Notch-1 (Figura 6A). Asociación con Notch-1 se redujo si el dominio de quinasa de c-Src se ha eliminado (Figura 6B). En contraste, la supresión del dominio SH3 o SH2 no afectó notablemente asociación con Notch-1 (Figura 6B). Para determinar si el dominio de c-Src KD es suficiente para la interacción con Notch-1, se realizó la inmunoprecipitación y ensayos de Western blot con una proteína de fusión c-Src KD-HA en lisados de células HeLa. Notch-1 unido específicamente a c-Src KD, pero no el dominio SH3 c-Src, y sólo débilmente con el dominio SH2 (Figura 6B). Por lo tanto, parece necesario y suficiente para la interacción con c-Src Notch-1 el dominio KD.
El dominio de quinasa de c-Src se une a Notch-1. (A) Representación esquemática de la estructura de construcciones de deleción c-Src. (B) El dominio KD de c-Src se une a Notch-1
in vitro
. Los fragmentos indicados de c-Src se fusionaron a una etiqueta de HA y transfectadas transitoriamente en células HeLa. lisados de células enteras se prepararon a continuación, se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-HA y immunoblotteding (IB) se realizaron con anticuerpos anti-HA anti-Notch-1 y. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo. (C) Co-inmunoprecipitación de etiquetado con FLAG Notch-1 NEXT y HA-etiquetados c-Src. (D) Representación esquemática de la estructura de las construcciones de deleción Notch-1. (E) El dominio de repetición de anquirina de Notch-1 se une a c-Src. Los fragmentos indicados de Notch-1 se fusionaron a una etiqueta FLAG y transfectadas transitoriamente en células HeLa. lisados de células enteras se prepararon a continuación, se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-FLAG, y immunoblotteding (IB) se realizaron con anticuerpos anti-FLAG y anti-c-Src. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo. (F) Notch-1 es tirosina fosforilada. Notch-1 se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-fosfo-tirosina Ab 4G10. Se prepararon lisados de células enteras de HPAC, y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-fosfo-tirosina (4G10), y los anticuerpos anti-1-Notch, y immunoblotteding (IB) se realizaron con anti-Notch-1. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo. (G) La detección de la fosforilación de tirosina con anti-Notch-1 inmunoprecipitados. Panel superior: lisados de células enteras de HPAC se inmunoprecipitaron con anti-anticuerpos IgG e-1 anti-Notch. Los inmunoprecipitados se sometieron a análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10. panel inferior, la misma mancha fue desnudado, y se detectó con anti-Notch-1 anticuerpo. (H) Src inhibidor SU6656 o PP2 disminuye asociado-fosfo-tysosine Notch-1. lisados de células enteras de HPAC se inmunoprecipitaron con anti-IgG y los anticuerpos 4G10 anti-fosfotirosina. Los inmunoprecipitados se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anti-Notch-1.
También co-transfectadas etiquetada con FLAG Notch-1 NEXT y HA-etiquetados c-Src en células HeLa. Nuestros resultados muestran que el próximo se asocia con HA-etiquetados c-Src (Figura 6C).
Nuestra conclusión de que tanto de longitud completa Notch-1 (p300) y escindido Notch-1 (p120) asociado con c- src indicado que el dominio intracelular Notch-1 (NICD) tiene un sitio de unión de c-src. Para identificar el dominio (s) de Notch-1 responsable de la unión de c-Src, generamos constructos de deleción de la NICD (Figura 6D), y realizaron análisis de co-inmunoprecipitación con etiqueta anti-FLAG y anticuerpos c-Src-específicos. Los resultados muestran que la repetición de anquirina (ANK) mutante -deletion tenía una afinidad de unión muy reducida de c-Src, lo que sugiere que el dominio ANK de Notch-1 es responsable de la unión a c-Src (Figura 6E). Por lo tanto, Notch-1 y c-Src asociado a través del dominio ANK de Notch-1 y el dominio KD de c-Src.
Para probar si Notch-1 es fosforilados en residuos de tirosina, immunoprecipitated lisados celulares HPAC con anticuerpo anti-fosfo-tirosina 4G10, y detectado Notch-1 por transferencia de Western. Algunos Notch-1 /p120 estaba presente en el inmunoprecipitado (Figura 6F). También immunoprecipitated lisados de células HPAC con anti-Notch-1 anticuerpo y se detecta la tirosina-fosforilación con anticuerpo anti-fosfo-tirosina 4G10. Tanto Notch-1 /p300 y Notch-1 /p120 fueron fosforilados en tirosina (Figura 6G). Se han tratado las células HPAC con 10 M SU6656 o PP2 durante 30 minutos, y inmunoprecipitado del lisado de células con el anticuerpo anti-fosfo-tirosina 4G10, a continuación, detectamos asociado-fosfo-tirosina Notch-1 (Figura 6H). Se encontró que SU6656 o PP2 disminuyó notablemente asociado-fosfo-tirosina Notch-1 (Figura 6H). Los resultados indicaron que Notch-1 es potencialmente fosforilado por c-Src.
7. Co-localización de c-Src y Notch-1 en el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas
Para ver si la terapia sistémica con PP2 podría afectar a la interacción de Notch-1-c-Src en xenoinjertos de tumores
in vivo
, establecimos HPAC humanos xenoinjertos de cáncer de páncreas en ratones desnudos. Una vez que los injertos de HPAC habían desarrollado tumores palpables en (200 mg), PP2 se dio en 4 mg /kg como s.c. inyecciones para un total de 8 inyecciones cada dos días. tratamiento PP2 reducción del crecimiento del tumor (
P = 0,0007
frente al vehículo), en comparación con los controles no tratados. (Figura 7A & amp; B)
(A) Efectos del PP2 del crecimiento de tumores de cáncer de páncreas HPAC xenoinjertos en los costados de ratones desnudos. Se muestra una fotografía representativa de un ratón de cada grupo., con tumores localizados en sus flancos. (B) el crecimiento de los xenoinjertos de células de cáncer pancreático HPAC en ratones inmunodeficientes reducida debido a tratamiento PP2. Los volúmenes de los tumores fueron de 200-300 mm
3 en el inicio del tratamiento drogas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de los volúmenes tumorales. La diferencia entre los grupos de DMSO y PP2 fue altamente significativa (
P
& lt; 0,01; n = 10). (C) Los tumores fueron resecados y procesados, y los portaobjetos se tiñeron con H & amp; E. (D) La tinción inmunohistoquímica en xenoinjertos tumorales HPAC. Los tumores fueron resecados y procesados, y los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos de c-Src (rojo), Notch-1 (verde), y DAPI (azul). La localización de c-Src y Notch-1 se visualizaron por un microscopye confocal. co-localizar aparece
amarilla en la superposición.
Bar, España 10 micras. (E) La frecuencia proporción de rojo-verde co-localización en las DMSO y los tejidos tumorales tratados con PP2 (número de células con color /número de células totales con color azul en la Fig. 7D amarillo), se midió con el software Image- Pro Plus software.
hematoxilina y eosina secciones manchadas de los xenoinjertos de tumores se muestran en la Figura 7C. Tenga en cuenta la picnosis nuclear y edema visto en el tumor tratado con PP2. La inmunotinción de secciones en serie reveló co-localización de c-Src y Notch-1 inmunorreactividades en el tejido del tumor de xenoinjerto (panel superior, Figura 7D), lo que implica una correlación positiva entre la c-Src y Notch-1 de activación en las células tumorales individuales. El tratamiento con PP2 redujo significativamente la co-localización de Notch-1 y c-Src (Figura 7D), la frecuencia de rojo-verde co-localización fue mucho menor que en el grupo control (6 ± 1,5 frente a 15,4 ± 4,6%;
P
& lt; 0,01, n = 10;. Figura 7E)
Discusión
Aunque la escisión de Notch-1 en el sitio S1 por furina es necesaria para la activación Notch-1 , el mecanismo de gobierno asociación Notch-1-furina no estaba claro. En el presente estudio hemos demostrado que la activación Notch-1 está regulada por una tirosina quinasa. También demostramos que c-Src se asocia físicamente con Notch-1; c-Src interactúa con Notch-1 a través de su dominio KD, y se requiere la actividad de la quinasa para la asociación eficaz de c-Src con Notch-1. factores de crecimiento extracelulares parecen regular directamente Notch-1 de escisión a nivel de proteínas a través de c-Src.
directa diafonía entre el crecimiento del receptor de c-Src y la vía de Notch
quinasas de la familia Src (SFKs) son receptores quinasas no sobreexpresa en la mayoría de los cánceres de páncreas y que participan en la progresión del cáncer y la metástasis [9]. La inhibición de estas quinasas se ha mostrado prometedor en modelos preclínicos de cáncer. Nuestros resultados indican que las proteínas Notch-1 y C-src son físicamente asociados y que esta asociación medie Notch-1 de procesamiento y la activación. Se ha informado de que Notch-1 se asocia con la serina /treonina quinasas GSK3beta y CDK8 [13], [14]. Nuestros resultados indican que Notch-1 también está regulada por una tirosina quinasa.
Notch-1 es potencialmente un efector aguas abajo de EGFR /PDGFR en células de cáncer pancreático
EGFR señalización impactos muchos aspectos de tumor biología, incluyendo la proliferación, invasión, difusión, y la apoptosis [15]. La activación de EGFR aumenta el crecimiento tumoral, invasión y propagación; también inhibe la apoptosis. La mayoría de los cánceres de páncreas sobreexpresan EGFR, y esto se ha correlacionado con la enfermedad avanzada en la presentación y la reducción de tiempo medio de supervivencia [16]. EGFR produce su efecto sobre las células malignas a través de los bucles autocrinos y paracrinos y se ha demostrado que se unen TGF-α y EGF. EGFR es entonces autophosphorylated y transphosphorylated en residuos de tirosina, lo que resulta en su asociación con el adaptador y moléculas de señalización y conduce a la activación de múltiples cascadas de señalización intracelulares, incluidas las destinadas a Src, AKT y ras /MAPK1 /2 [15].
PDGFR-α y PDGFR-β son receptores tirosina quinasas estructuralmente similares activadas por derivado de plaquetas factor de crecimiento [17]. PDGF induce el crecimiento celular, la supervivencia [18] y la transformación [19]. La activación del PDGFR en tumores también puede ocurrir a través de la estimulación autocrina o paracrina ya que tanto las células tumorales y normales en el estroma secretan PDGF. La sobreexpresión de PDGFR se ha encontrado en los cánceres de páncreas [20]. Como EGFR, PDGFR estimulación conduce a la activación de la señalización intracelular, particularmente de Src, AKT, y ras /MAPK1 /2.
Hemos observado anteriormente que la sobre expresión del dominio intracelular Notch-1 (NICD) aumenta el crecimiento de células de cáncer de páncreas, y derribando Notch-1 inhibe el crecimiento celular [11]. En el presente estudio, encontramos que la sobreexpresión de Notch-1 aumenta la formación de colonias de células de cáncer de páncreas HPAC. Hemos demostrado anteriormente que la activación de cualquiera de EGFR o PDGFR estimula la activación Notch-1, que está mediada por c-Src. Así, la activación Notch-1 juega un papel importante en el crecimiento de células de cáncer de páncreas, y en la proliferación celular estimulada por la activación de EGFR o PDGFR.
En un informe anterior, se encontró que la baja regulación de Notch-1 disminución de la invasión de células, mientras que Notch-1 sobreexpresión de cDNA transfección dio lugar a aumento de la invasión de células tumorales [11]. También se encontró que la baja regulación de Notch-1 redujo la actividad y la expresión de metaloproteinasas de matriz-9 (MMP-9) y VEGF [21] NF-kB de unión al ADN. Por lo tanto, Notch-1 puede actuar como un efector corriente abajo de EGFR /PDGFR señalización hasta la regulación de MMP-9 y VEGF expresión, y la estimulación de la invasión de células y la metástasis. Columnas, significan;