Extracto
La resistencia a los inhibidores de crecimiento epidérmico tirosina quinasa del receptor del factor (EGFR-TKIs), gefitinib y erlotinib, es un problema crítico en el tratamiento de
EGFR
cáncer de pulmón mutante. Varios mecanismos, incluyendo la señalización por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) -motivado activación de Met de derivación, están implicados como mediadores de la resistencia. El objetivo de mamífero de la rapamicina (mTOR), es un conducto de aguas abajo de EGFR y la señalización de MET, y por lo tanto se considera un objetivo atractivo terapéuticamente en el tratamiento de varios tipos de cánceres. El propósito de este estudio fue examinar si los inhibidores de mTOR 2 clínicamente aprobados, temsirolimus y everolimus, vencer la resistencia dependiente de HGF a EGFR-TKI de EGFR
células de cáncer de pulmón mutantes. Tanto temsirolimus y everolimus inhiben la fosforilación de p70S6K y 4E-BP1, que son objetivos de abajo de la vía mTOR, y la reducción de la viabilidad de
EGFR mutantes
las células del cáncer de pulmón, PC-9, y HCC827, incluso en el presencia de HGF
in vitro
. En un modelo de xenoinjerto, temsirolimus suprime el crecimiento de las células PC-9 que sobreexpresan el
HGF
-Gene; Esto se asoció con supresión de la vía de señalización mTOR y la angiogénesis tumoral. Por el contrario, erlotinib no suprimió esta señalización crecimiento vía o tumor. Múltiples mecanismos, incluyendo la inhibición de la producción del factor de crecimiento endotelial vascular por las células tumorales y la supresión de la viabilidad de las células endoteliales, contribuyen al efecto anti-angiogénico de temsirolimus. Estos hallazgos indican que los inhibidores de mTOR pueden ser útiles para controlar el HGF-desencadenó la resistencia EGFR-TKI en
EGFR mutante
cáncer de pulmón, y proporcionan el fundamento para los ensayos clínicos de los inhibidores de mTOR en pacientes estratificados por
EGFR
mutación y estado de la expresión de HGF
Visto: Ishikawa D, S Takeuchi, Nakagawa T, Sano T, J Nakade, Nanjo S, et al. (2013) Control de mTOR Inhibidores del Crecimiento del EGFR cáncer de pulmón mutante Incluso después de adquirir resistencia por HGF. PLoS ONE 8 (5): e62104. doi: 10.1371 /journal.pone.0062104
Editor: Jung weon Lee, de la Universidad Nacional de Seúl, Corea del
Recibido: 29 Noviembre 2012; Aceptado: March 18, 2013; Publicado: 14 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Ishikawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por KAKENHI (Grants-en-Ayudas a la Investigación Científica en 'integrativa Investigación del cáncer Red microambiente' áreas innovadoras (SY) y Grant-en-Ayudas para jóvenes científicos (a TY y ST)), y subvenciones-in- Ayuda para el Proyecto para el Desarrollo de la investigación innovadora sobre la terapéutica del cáncer (P-directo) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Seiji Yano recibido honorarios de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. y AstraZeneca. Seiji Yano recibido fondos de investigación de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. y Eisai Co., Ltd. Esta no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por tumores malignos relacionados con todo el mundo, y más del 80% de los casos se clasifican como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) la activación de mutaciones, tales como el exón 19 de borrado y el exón 21 punto de mutación L858R, se encuentran en una población de NSCLC, y están asociados con una respuesta clínica a los inhibidores de EGFR de tirosina quinasa (EGF-TKIs), gefitinib y erlotinib [1] - [3]. Sin embargo, casi todos los que respondieron adquieren resistencia y desarrollar recurrencia después de períodos variables de tiempo (resistencia adquirida) [4]. Además, el 20-30% de los pacientes muestran respuestas desfavorables, aunque sus tumores tienen mutaciones diana (resistencia intrínseca) [5]. Muchos estudios se han realizado con el fin de delinear estrategias que pueden superar la resistencia adquirida e intrínseca. Estos estudios han identificado varios mecanismos de resistencia adquirida, incluyendo
EGFR T790M
mutación [6], [7],
MET
amplificación [8], [9], el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) sobreexpresión [10], la pérdida de PTEN [11], la transformación a un cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) fenotipo [12] - [14], epitelial a mesenquimal transición (EMT) [15] - [17], la activación de la vía de NFkB [18], la alteración de microRNA [19], y la activación del eje de Gas6-Axl [20]. La complejidad de NSCLC es reflejada por la co-ocurrencia de varias combinaciones de estos mecanismos de resistencia en diferentes individuos. previamente Descubrimos que HGF desencadena resistencia EGFR-TKI activando el eje /PI3K /Akt MET [10]. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión de HGF está presente en los tumores de pacientes japoneses con la resistencia del tumor adquiridos y intrínseca a EGFR-TKI a frecuencias de alrededor de 60% y 30%, respectivamente [21]. Esto indica que el HGF es un objetivo ideal para la superación de la resistencia de EGFR-TKI en
EGFR mutantes
pacientes con cáncer de pulmón. Para superar la resistencia provocada por HGF, 2 señales de EGFR y HGF-MET deben bloquearse de forma simultánea. Ya hemos informado de que la resistencia dependiente de HGF puede ser controlado por un anti-HGF anticuerpos neutralizantes [22], el antagonista de HGF NK4 [22], Met-TKI [23] - [25], y la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) inhibidores [26] en combinación con EGFR-TKI. Sin embargo, estos inhibidores no están aprobados clínicamente y por lo tanto no se puede utilizar para el tratamiento de pacientes con cáncer.
El objetivo de mamífero de la rapamicina (mTOR), una serina /treonina quinasa, es un objetivo corriente abajo de la PI3K y Akt , y desempeña un papel crítico en la supervivencia y la proliferación [27] de células - [29]. La activación de PI3K /AKT y la posterior fosforilación de mTOR inicia la fosforilación de importantes objetivos de abajo, incluyendo ribosomal p70S6 serina /treonina quinasa (S6K1) y el factor de iniciación eucariótico (FEI) 4E proteína de unión (4E-BP1), resultando en un aumento de la la traducción del ARNm y la síntesis de proteínas dependiente de la cubierta, respectivamente. Por lo tanto, mTOR quinasa es un nodo clave de la vía de señalización de PI3K /AKT [27] - [30]. Hasta la fecha, varios análogos de rapamicina inhibidor de mTOR se han desarrollado, incluyendo temsirolimus y everolimus, que se han utilizado para el tratamiento de carcinomas de células renales y tumores neuroendocrinos pancreáticos. La rapamicina y sus análogos se unen FK506-proteína de unión-12 (FKBP12) e interactuar con mTOR, la inhibición de su actividad quinasa y la detención de la traducción de proteínas críticas para la proliferación celular y la supervivencia
.
Debido mTOR es aguas abajo de ambos EGFR y MET, la hipótesis de que la inhibición de mTOR, incluso como un agente de monoterapia, puede bloquear el EGFR y MET mediada por la señalización de forma simultánea y superar la resistencia provocada por HGF EGFR-TKI. En el presente estudio, se examinó si la clínicamente aprobado inhibidores de mTOR, temsirolimus y everolimus, eludir provocada por HGF resistencia a EGFR-TKI en
EGFR
células de cáncer de pulmón mutantes utilizando
in vitro
y
in vivo y modelos, y se evalúan mecanismos subyacentes.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células y reactivos
EGFR
mutante de células de adenocarcinoma de pulmón humano líneas de PC-9 (del E746_A750) y HCC827, con deleciones en
EGFR
exón 19, fueron adquiridos de Immuno-Biological Laboratories Co. (Takasaki, Gunma, Japón) y la American Type Culture Collection (Manassas, VA ), respectivamente. Humana
HGF
-Gene transfectantes (PC-9 /HGF) y control de vectores se establecieron células (PC-9 /Vec) como se ha descrito anteriormente [10]. Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y antibióticos. Todas las células se hicieron pasar por menos de 3 meses antes de la renovación de las existencias congeladas, de principios del pasaje. Las células fueron evaluados regularmente para detectar micoplasmas mediante el uso de kits de detección de Mycoplasma MycoAlert (Lonza, Rockland, ME). Las líneas celulares se autentican en el laboratorio del Instituto Nacional de Innovación Biomédica (Osaka, Japón) mediante el análisis de repetición en tándem corto. Erlotinib, everolimus, y temsirolimus se obtuvieron de Selleck Químicos (Houston, TX). HGF recombinante humano se preparó como se describe anteriormente [10].
Producción de HGF y VEGF en sobrenadantes de cultivo celular
Las células (2 × 10
5) se cultivaron en 2 ml de medio con 10% de FBS durante 24 h, se lavaron con PBS y se incubaron durante 48 h en medio con 10% de FBS. En algunos experimentos, se añadió HGF para el medio. Los medios de cultivo se recogieron y se centrifugaron, y los sobrenadantes se almacenaron a -70 ° C hasta su análisis. Las concentraciones de HGF y VEGF fueron determinadas por immunis HGF EIA (Instituto de Inmunología, Tokio, Japón) y Quantikine VEGF ELISA (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN), respectivamente, de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Todas las muestras se procesaron por duplicado. La intensidad del color se midió a 450 nm usando un lector de placas espectrofotométrico. las concentraciones de factor de crecimiento se determinaron por comparación con las curvas de calibración. Los límites de detección para HGF y VEGF eran 100 pg /ml y 31 pg /ml, respectivamente.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se midió por el método de reducción del colorante MTT. Las células tumorales, en placas a 2 × 10
3/100 l RPMI 1640 más 10% de FBS /pocillo en placas de 96 pocillos, se incubaron durante 24 h. Entonces, erlotinib, temsirolimus, everolimus, y /o HGF se añadieron a cada pocillo, y la incubación se continuó durante 72 h adicionales. La viabilidad celular se midió con una solución de MTT (2 mg /ml; Sigma, St. Louis, MO), como se describe anteriormente [10]. Cada experimento se realizó con muestras por triplicado.
Los anticuerpos y transferencia
alícuotas de proteínas occidentales (25 g cada uno) fueron resueltas por SDS electroforesis en gel de poliacrilamida (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad). Después de lavar 4 veces, las membranas se incubaron con el bloqueo de uno (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japón) durante 1 h a temperatura ambiente (RT) y durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios a ß-actina (13E5), Met (25H2), fosfo-MET (anti-p-MET, Y1234 /Y1235; 3D7), p-EGFR (Y1068), AKT o p-AKT (S473), mTOR, p-mTOR (S2448), p70S6K, pp70S6K ( T389), 4E-BP1, P4E-BP1 (T37 /46) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), EGFR humano (1 mg /ml), humano /ratón /ERK1 rata /ERK2 (0,2 mg /ml), y p-ERK1 /ERK2 (T202 /Y204; 0,1 mg /ml) (R & amp; D Systems). Después de 3 lavados, las membranas se incubaron durante 1 h a TA con rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de especies específicas. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato, una mejorada sustrato quimioluminiscente (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
estudios de xenoinjertos en ratones SCID
Las suspensiones de PC-9 /Vec y -9 células PC /HGF (5 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones macho de 5 semanas de edad con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (Clea, Tokio, Japón). Después de 7 días, los ratones se asignaron al azar a ningún tratamiento (grupo control), erlotinib oral (20 mg /kg /día), o temsirolimus intravenoso (50 mg /kg /semana en agua). El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana, y se calculó el volumen del tumor (mm
3) como [(ancho)
2 × longitud] /2. Todos los experimentos con animales cumplían con las directrices para el Instituto de Animales Experimentales, Advanced Science Research Center, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón (aprobación no. AP-081088).
Análisis histológicos
Para el la detección de la proliferación de células tumorales (Ki-67), las secciones 5-m de espesor se desparafinaron en xileno, rehidratada en la disminución de las concentraciones de etanol, y antígeno recuperado. Para la detección de las células endoteliales (CD31), las secciones congeladas 5-micras de espesor de los tumores de xenoinjerto se fijaron con acetona fría y se lavaron con PBS. Entonces, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación en 3% acuoso H
2O
2 para 10 min. Tras el tratamiento con suero normal de caballo 5%, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios a Ki-67 (MIB-1) (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca), y el ratón CD31 (MEC13.3) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ ). Después de sondeo con anticuerpos secundarios biotinilados específicos de especie, las secciones se incubaron durante 30 min con el complejo de peroxidasa de avidina-biotina (ABC) usando un kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El DAB (3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro) sistema líquido (Dako Cytomation) se utilizó para detectar la inmunotinción. La omisión de los anticuerpos primarios sirvió como control negativo. Se seleccionaron las 5 áreas que contienen el mayor número de células teñidas dentro de una sección para la cuantificación histológica por la luz o microscopía de fluorescencia a 400 aumentos. Todos los resultados fueron evaluados de forma independiente por dos investigadores (2 D.I. y T.N.).
El análisis estadístico
Entre el grupo de las comparaciones fueron evaluadas por
t-
Student pruebas de dos colas. Todos los análisis se realizaron utilizando GraphPad Software. Un
P
valor & lt; 0,01 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
inhibidores de mTOR suprimen la viabilidad de
EGFR mutantes
células de cáncer de pulmón en presencia de HGF.
PC-9 y HCC827 son líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano con deleciones del exón 19 en
EGFR
, lo que resulta en la activación constitutiva de esta proteína. Estas líneas celulares eran sensibles a erlotinib, mientras que la resistencia erlotinib HGF inducida (Fig. 1). El tratamiento con inhibidor de mTOR (temsirolimus o everolimus) sola visiblemente suprimió la viabilidad de estas líneas celulares. En estas condiciones experimentales, el HGF no disminuyó la sensibilidad de estas líneas celulares a cualquiera de los fármacos. Estos resultados sugieren que los inhibidores de mTOR pueden controlar eficazmente el crecimiento de
EGFR
células de cáncer de pulmón mutantes, independientemente de la presencia de HGF que induciría EGFR-TKI resistencia.
PC-9 o HCC827 células se incubaron con o sin erlotinib, temsirolimus, o everolimus, en presencia o ausencia de HGF (20 ng /ml) durante 72 h. Entonces, la viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. Las barras muestran SD. Los datos mostrados son representativos de 5 experimentos independientes con resultados similares.
Nuestro estudio anterior demostró que, en pacientes con CPNM, el HGF se detecta principalmente en las células cancerosas con resistencia adquirida a EGFR-TKI, lo que sugiere que la producción de HGF por estas células se produce principalmente a través de un mecanismo autocrino. Para explorar más a fondo el efecto de los inhibidores de mTOR en la producción autocrina HGF, generamos estables
HGF
-Gene transfectantes en células PC-9 (PC-9 /HGF). células /HGF secretadas altas concentraciones de HGF (28 ± 1 ng /48 h) 9 PC-, mientras que las concentraciones de HGF secretadas por PC-9- y control PC-9 /células transfectadas con el vector Vec estaban por debajo del límite de detección. Además, 9 de PC-células /HGF se volvieron resistentes a erlotinib (Fig. 2). Se encontró que temsirolimus o everolimus reducen visiblemente la viabilidad de ambas /células HGF PC-9 /Vec y PC-9 en la misma medida, mientras que la combinación de inhibidor de mTOR más erlotinib no tuvo ningún efecto en 9 PC-células Vec /en presencia de HGF, lo que indica que los inhibidores de mTOR no sensibilizan aún más estas células a erlotinib
in vitro
(Fig. S1). Golpear abajo de mTOR por siRNA resultó en la inhibición de la viabilidad de PC-9 /Vec y células /HGF 9 PC-por 30% (Fig S2 B), lo que indica que la viabilidad celular inhibida por temsirolimus incluso en presencia de HGF se debe a mTOR inhibición. También se realizó citometría de flujo utilizando anexina V y encontramos que temsirolimus no indujo la apoptosis discernible en 9-PC /células HGF (Fig. S3) PC-9 /Vec o. Estos hallazgos indican que los inhibidores de mTOR, cuando se utilizan como agentes únicos, suprimen el crecimiento de
EGFR mutantes
células de cáncer de pulmón a través de la inhibición de la proliferación en lugar de la inducción de la apoptosis.
PC-9 /Vec y PC células -9 /HGF se incubaron con erlotinib (a), temsirolimus (B), o everolimus (C) durante 72 h. Entonces, la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT. Las barras muestran SD. (D) células PC-9 /Vec y PC-9 /HGF se trataron con o sin erlotinib (0,3 M), temsirolimus (0,3 M), o everolimus (0,3 M) durante 4 h. Los lisados celulares se recogieron y se sometieron a transferencia de Western. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares.
inhibidores de mTOR suprimen p70S6K y 4EBP1 fosforilación incluso en presencia de HGF
Para explorar el mecanismo molecular por el cual los inhibidores de mTOR suprimido la viabilidad celular, incluso en presencia de HGF, se analizó la expresión de la proteína y la fosforilación estado de EGFR, MET, y sus moléculas de abajo (ERK1 /2, vía PI3K /AKT, p70S6K, y 4EBP1) en PC-9 /Vec y PC- 9 células /HGF por transferencia de western (Fig. 2D). Vec células PC-9 /expresan EGFR y proteínas MET, mientras que sólo el EGFR fue visiblemente fosforilada. Erlotinib inhibió notablemente la fosforilación de EGFR, así como aguas abajo ERK1 /2 y AKT, pero marginalmente inhibe la fosforilación p70S6K. Si bien ninguno de temsirolimus ni everolimus afectaron la fosforilación de EGFR, MET, ERK1 /2 o AKT, que inhiben la fosforilación de p70S6K y 4EBP1, las moléculas de abajo de la mTOR.
En 9 PC-células /HGF, era MET también fosforilados, presumiblemente debido a HGF que se produjo de una manera autocrina. Erlotinib inhibe la fosforilación de EGFR, pero no inhibió notablemente la fosforilación de MET, AKT, p70S6K, o 4EBP1. Si bien ninguno de temsirolimus ni everolimus inhiben la fosforilación de EGFR, MET, ERK1 /2, o AKT, que inhibió notablemente la fosforilación de p70S6K y 4EBP1. Estos resultados indican que los inhibidores de mTOR suprimen la fosforilación de las moléculas de aguas abajo de mTOR, independientemente de la presencia de HGF.
inhibición de mTOR suprime el crecimiento inducida por HGF de los tumores resistentes a erlotinib
in vivo
Seguidamente, evaluó si los inhibidores de mTOR controlarían el crecimiento de
EGFR
células de cáncer de pulmón provocado mutantes con HGF-EGFR-TKI-resistencia
in vivo
. La administración oral de erlotinib suprime el crecimiento de PC-9 /VEC-tumores, pero no en los tumores PC-9 /HGF, lo que indica la resistencia de los tumores PC-9 /HGF al erlotinib
in vivo gratis (Fig. 3A). Por otra parte, la administración intravenosa de temsirolimus suprime el crecimiento de ambas PC 9-tumores /Vec y 9 PC-tumores /HGF. Estos resultados indican que la inhibición de mTOR puede ser útil para controlar el crecimiento de tumores resistentes inducida por HGF
in vivo
.
(A) ratones SCID que lleva PC-9 /Vec o PC-9 /se administraron los tumores de HGF 25 mg /kg una vez al día o erlotinib se midió 50 mg /kg una vez al temsirolimus semana de día 8 a día 20. el volumen del tumor usando calibres en los días indicados. La media de los volúmenes tumorales ± SE se muestran para grupos de 5 ratones. * P & lt; 0.01 (ANOVA de una vía). Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos independientes con resultados similares. (B) los ratones SCID con PC-9 /Vec o PC-9 tumores /HGF se administraron 25 mg /kg una vez al día erlotinib durante 4 días o 50 mg /kg una vez temsirolimus de día 8. Cuatro horas después de la administración final de erlotinib, los tumores eran cosechadas, y los niveles relativos de proteínas en los lisados tumorales se determinaron por Western Blot.
se evaluó además los mecanismos moleculares por los cuales temsirolimus inhibió el crecimiento de PC-9 /HGF-tumores. Los análisis de transferencia de Western reveló que erlotinib marcadamente inhibida la fosforilación de EGFR, ERK1 /2 y AKT, y ligeramente suprimió la fosforilación de p70S6K en PC-9 /VEC-tumores (Fig. 3B). Mientras erlotinib fosforilación de EGFR notablemente inhibida, sólo inhibió ligeramente ERK1 /2 y la fosforilación p70S6K, mientras que no inhibió la fosforilación de AKT en PC-9 /HGF tumores. Por otro lado, aunque temsirolimus no afectaron notablemente la fosforilación de EGFR o ERK1 /2 en ambos PC-9 tumores /Vec y 9 PC-tumores /HGF, que la fosforilación p70S6K notablemente inhibido, lo que sugiere el modo de acción de este fármaco como un inhibidor de mTOR.
Curiosamente, temsirolimus inhibió ligeramente la fosforilación de Akt en tumores /HGF 9-PC, pero aumentó la fosforilación de AKT en las células PC-9 /HGF
in vitro
condición en la (Fig. 2D). Para aclarar la causa de esta discrepancia, se analizó el curso del tiempo de tratamiento con inhibidores de mTOR en la fosforilación de AKT
in vivo gratis (figura S4). Hemos encontrado que de acuerdo con los resultados de
in vitro
experimentos, la fosforilación de Akt en los tumores se incrementó 4 h después del tratamiento temsirolimus. Pero entonces, el nivel de fosforilación de AKT se redujo y se inhibió ligeramente a las 96 h después del tratamiento, de acuerdo con los resultados mostrados en la Fig. 3B. Por lo tanto, la discrepancia de los resultados entre Fig. 2D y Fig. 3B eran debido a la diferencia de las muestras de tiempo se cosecharon.
suprime la inhibición de mTOR angiogénesis
in vivo
proliferación de células tumorales también examinados (Ki-67) y la angiogénesis (CD31) por inmunohistoquímica. tratamiento Erlotinib inhibe notablemente la proliferación de células tumorales y la angiogénesis en PC-9 xenoinjertos /Vec, mientras que erlotinib no afectó a la proliferación celular o la angiogénesis de manera significativa en xenoinjertos /HGF (Fig. 4) PC-9. Por el contrario, temsirolimus marcadamente inhibida la proliferación celular y la angiogénesis tanto en PC-9 tumores /HGF PC-9 /Vec y. Estos hallazgos sugieren que temsirolimus inhibe el crecimiento de 9 PC-tumores /HGF (al menos en parte) mediante la inhibición de la angiogénesis
.
ratones SCID con PC-9 /Vec o PC-9 tumores /HGF se administró como se describe en la Fig. 3B. Cuatro horas después de la administración final del erlotinib, se recogieron los tumores, y la proliferación de células tumorales (A, B: Ki-67) y la angiogénesis (C, D: CD31) se determinaron por inmunohistoquímica. B y D muestran la cuantificación de células positivas.
* P & lt; 0,01, (ANOVA de una vía). Las barras muestran SD.
Para profundizar en los mecanismos moleculares por los cuales temsirolimus inhibe la angiogénesis, se analizó su efecto sobre la producción de células tumorales de VEGF, una molécula pro-angiogénicos prominente. Ambos PC-9 y PC-9 /células Vec producen constitutivamente niveles detectables de VEGF, que fue estimulada por HGF (Fig. 5A). Consistente con estas observaciones, las células PC-9 /HGF producen niveles más altos de VEGF de 9 PC-células Vec /PC-9 y. Temsirolimus suprime la producción de VEGF en estas células de cáncer en la presencia o ausencia de HGF. Tumbar de mTOR de siRNA resultó en la inhibición de la producción de VEGF por 9 PC-células /HGF PC-9 /Vec y, al igual que el tratamiento con temsirolimus (figura S2). Estos resultados indican que la producción de VEGF inhibió por temsirolimus incluso en presencia de HGF es debido a la inhibición de mTOR. También se evaluó el efecto directo de temsirolimus en la viabilidad de las células endoteliales
in vitro
. Temsirolimus no inhibió la viabilidad constitutiva de células HMVEC en el medio con 10% de FBS solo (Figura 5B). VEGF y HuMedia-MvG, que contienen EGF y factor de crecimiento fibroblástico-2 (FGF-2), el aumento de la viabilidad de HMVECs. Temsirolimus, a concentraciones de 1 nM y más elevadas, inhibe este aumento de la viabilidad. Estos resultados indican que temsirolimus inhibe la angiogénesis por varios mecanismos. Las células tumorales
(A) se incubaron con o sin HGF (50 ng /ml) en presencia de diferentes concentraciones de temsirolimus para 48 h. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se contó el número de células tumorales. la concentración de VEGF en los sobrenadantes se determinó por ELISA. se muestran los niveles de VEGF corregidos por el número de células tumorales. (B) HMVECs se incubaron en medio RPMI-1640 con FBS al 10% (control), medio RPMI-1640 con FBS 10%, más VEGF, o HuMedia-MvG con diferentes concentraciones de temsirolimus para 72 h. Entonces, la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT. Las barras muestran SD. Los datos mostrados son 2 experimentos independientes con resultados similares.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que los inhibidores de mTOR suprimen el crecimiento de
EGFR mutante
de pulmón las células cancerosas, incluso en presencia de HGF,
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados también indican que los inhibidores de mTOR suprimen la angiogénesis mediante la inhibición de la producción de VEGF y la proliferación endoteliales estimuladas con diversos factores pro-angiogénicos. Estas observaciones sugieren que los inhibidores de mTOR, como agentes monoterapéuticas, son útiles para controlar la progresión de la
EGFR
cáncer de pulmón mutante y la resistencia provocada-HGF a EGFR-TKI.
HGF, también llamado factor de dispersión , es una citoquina multifuncional [31]. Estudios recientes mostraron que el HGF está implicado en la carcinogénesis, la invasión /motilidad, EMT, la angiogénesis y la metástasis en el cáncer de pulmón, y por lo tanto se asocia con un mal pronóstico de los pacientes [32]. Hemos informado anteriormente de que el HGF induce EGFR-TKI-resistencia en
EGFR mutantes
células de cáncer de pulmón mediante la restauración de MET /PI3K /AKT vía de señalización [10]. HGF sobreexpresión está implicado no sólo en la resistencia adquirida, sino también resistencia intrínseca a EGFR-TKI [21]. Además, HGF estimula la producción de VEGF por
EGFR
células mutantes de cáncer de pulmón, así como facilita la angiogénesis, promoviendo así la progresión del tumor [24]. HGF sobreexpresión es a menudo co-detectó con el
EGFR
-T790M mutación gatekeeper en tumores resistentes adquiridos [9], [11], [21]. HGF induce resistencia a la irreversible de EGFR-TKI del EGFR y selectivo ITC mutantes [33], que fueron desarrollados para superar T790M mediada por EGFR-TKI resistencia. Los ensayos clínicos recientes con TKI irreversibles monoterapia no lograron demostrar una respuesta objetiva en
EGFR mutantes
pacientes con cáncer de pulmón que eran refractarios al tratamiento con el reversible de EGFR-TKI-gefitinib y erlotinib [34]. Estos hallazgos sugieren que la co-existencia de alteraciones en la señalización de HGF contribuye a la respuesta desfavorable para irreversible de EGFR-TKI en estos pacientes [32]. Además, la presencia de HGF acelera el crecimiento de pre-existentes clones EGFR-TKI-resistentes que albergan
Met
amplificación [35]. Más recientemente, se informó HGF para inducir resistencia a los inhibidores selectivos de ALK en
EML4-ALK
cáncer de pulmón [36] y los inhibidores de BRAF en
BRAF
melanoma mutante [37]. Tal evidencia acumulada indica que el HGF es un objetivo común para superar la resistencia a fármacos dirigidos a tumores oncogenes adicto.
Nuestros resultados también sugieren que los inhibidores de mTOR tienen ventaja de varios mecanismos para suprimir el crecimiento de la resistencia de EGFR-TKI desencadenada por HGF en
EGFR
células de cáncer de pulmón mutantes. Por ejemplo, los inhibidores de estas señales probables de supervivencia bloque de mTOR /p70S6K /4E-BP1 que se dedican por lo general durante la activación de PI3K /AKT en las células cancerosas. El /AKT /mTOR vía PI3K contribuye a la supervivencia de
EGFR
células de cáncer de pulmón mutantes [38], [39]. Hemos informado anteriormente de que esta vía es también crucial para la adquisición de resistencia provocada por HGF a EGFR-TKI en
EGFR mutantes
células de cáncer de pulmón [40]. En el presente estudio, tanto temsirolimus y everolimus parcialmente suprimida la fosforilación de p70S6K y 4E-BP1, así como inhibió la supervivencia de
EGFR
células cancerosas mutantes
in vitro
. Por lo tanto, los inhibidores de mTOR lograr la inhibición del crecimiento mediante la supresión de las dos señales de supervivencia de EGFR y señales de resistencia de MET en células de cáncer.
Otro posible mecanismo es la inhibición de la angiogénesis. Los estudios recientes informaron de que la señalización de mTOR mediada estimula la transcripción HIF-1α, que regula VEGF, a través de 4E-BP1 fosforilación [41]. inhibidores de mTOR suprimen la transcripción HIF-1α y por lo tanto inhiben la producción de VEGF [28], [29], [41] - [43]. Hemos informado anteriormente de que el HGF activa la vía de MET /GAB1 y aumenta la producción de VEGF por
EGFR mutantes
células de cáncer de pulmón [24]. En el presente estudio, hemos confirmado este hallazgo y, demostró que los inhibidores de mTOR suprimen tanto la producción de VEGF constitutiva y la producción de VEGF estimulada por HGF. Por otra parte, se encontró que mientras que los inhibidores de mTOR no afectaron la viabilidad de las células endoteliales no estimuladas, que inhibieron la proliferación endotelial estimulada por varios factores pro-angiogénicos, incluyendo VEGF. mTOR se activa tras el acoplamiento de varios receptores tirosina quinasas, tales como VEGFR-2, EGFR y FGFR-1 [41]; por lo tanto, los inhibidores de mTOR pueden derogar la estimulación causada por múltiples factores pro-angiogénicos en las células endoteliales. Por lo tanto, los inhibidores de mTOR pueden suprimir la angiogénesis por al menos 2 modos de acción. En primer lugar, pueden inhibir la producción de VEGF incluso en presencia de HGF. En segundo lugar, pueden inhibir la proliferación de células endoteliales que es estimulada por varios factores pro-angiogénicos.
Los resultados de los últimos ensayos clínicos con fármacos dirigidos indicar la importancia de la selección de los pacientes. Por ejemplo, la tasa de respuesta de gefitinib era sólo el 10-20% en no seleccionada NSCLC [44], pero era aproximadamente 80% en
EGFR
mutación positiva NSCLC [43]. La supervivencia libre de progresión de
EGFR
pacientes con cáncer de pulmón mutantes también era mucho más larga que la de los pacientes con CPNM no seleccionados [45]. Si bien se han desarrollado un gran número de inhibidores de mTOR y están siendo evaluados en ensayos clínicos en cáncer de pulmón, ninguno de sirolimus, temsirolimus, everolimus o, en su uso como agentes monoterapéuticas, muestran una eficacia clínica en no seleccionado NSCLC [46] [47]. Por otra parte, estudios recientes de los inhibidores de mTOR en combinación con EGFR-TKI tampoco mostraron beneficio clínico en CPNM no seleccionados [46], [48] - [50]. Nuestro estudio es preclínica, y hemos demostrado que los inhibidores de mTOR mostraron una eficacia considerable en células de cáncer de pulmón con la resistencia mediada por HGF a la resistencia a EGFR-TKI tanto
in vitro
y
in vivo
. Dong et al. también informó de la actividad anti-tumor de los inhibidores de mTOR contra EGFR-TKI resistente
EGFR
células de cáncer de pulmón mutante con la mutación T790M gatekeeper [51]. Ambas mutaciones gatekeeper HGF y T790M se detectan con frecuencia en tumores resistentes EGFR-TKI, donde contribuyen a la resistencia. Por lo tanto, estas observaciones ilustran la necesidad de ensayos clínicos con inhibidores de mTOR en
pacientes EGFR
mutante de cáncer de pulmón que se convierten en refractario a gefitinib y erlotinib. Además, dado que el HGF confiere resistencia a fármacos dirigidos en varios tipos de tumores, se necesitan ensayos clínicos de los inhibidores de mTOR.
Apoyo a la Información
Figura S1. Los inhibidores de mTOR
no sensibilizan más
EGFR
células de cáncer de pulmón mutantes al erlotinib
in vitro
. células Vec PC-9 /se incubaron con o sin temsirolimus (A) o everolimus (B), en presencia o ausencia de HGF (20 ng /ml) y erlotinib (0,3 M) durante 72 h. Entonces, la viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. Las barras muestran SD. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062104.s001 gratis (TIF)
figura S2.
de la precipitación de mTOR inhibe el crecimiento celular y la producción de VEGF. Las células tumorales fueron transfectadas con mTOR o ARNsi de control para 24 h y (A) los lisados celulares se recogieron y se sometieron a transferencia de Western.