Extracto
factor de crecimiento tipo insulina 1 receptor (IGF1R) es un receptor transmembrana que se activa por semejante a la insulina factor de crecimiento 1 (IGF-1) y por una hormona relacionada llamada IGF-2. Pertenece a la gran clase de receptores de tirosina quinasa y juega un papel importante en la etiología del cáncer colorrectal y la progresión. En este estudio, hemos utilizado análisis bioinformáticas para buscar miRNAs que potencialmente se dirigen a IGF1R. Se identificaron los sitios diana específicos para el miR-143 y miR-145 (MIR-143/145) en la región 3 'no traducida (3'-UTR) del gen IGF1 R. Estos miRNAs son miembros de un grupo de miRNAs que se ha informado que exhiben una actividad supresora de tumores. En consonancia con los análisis bioinformáticos, identificamos una correlación inversa entre el miR-143/145 niveles y los niveles de proteína de IGF1R en tejidos de cáncer colorrectal. Mediante la sobreexpresión de miR-143/145 en Caco2, HT29 y células de cáncer colorrectal SW480, nos validada experimentalmente que el miR-143/145 reconoce directamente la 3'-UTR de la transcripción IGF1R y regula la expresión de IGF1R. Por otra parte, las consecuencias biológicas de la focalización de IGF1R por miR-143/145 se examinaron mediante ensayos de proliferación celular
en
in vitro
. Hemos demostrado que la represión de IGF1R por miR-143/145 suprime la proliferación de células Caco2. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia de un papel de la agrupación de miR-143/145, acompañaron un supresor tumoral en el cáncer colorrectal a través de la inhibición de la traducción de IGF1R
Visto:. Su J, Liang H, W Yao, Wang N, Zhang S, Yan X, et al. (2014) miR-143 y miR-145 Regular IGF1R para suprimir la proliferación celular en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (12): e114420. doi: 10.1371 /journal.pone.0114420
Editor: Cecilia Williams, Universidad de Houston, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de mayo de 2014; Aceptado: 10 de noviembre de 2014; Publicado: 4 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas del Programa Nacional de Investigación Básica de China (973 programas) (núm 2014CB542300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 81101330, 31271378 y 81250044.) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (núms BK2011013 y BK2012014.)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en el mundo, y es más frecuente en los países desarrollados [1]. Se estima que la incidencia media bruta de cáncer colorrectal en el sudeste asiático para ambos sexos fue 6,95 /100.000 habitantes en 2008 y la incidencia aumenta con la edad [2]. A nivel molecular, el cáncer colorrectal surge de una serie de alteraciones genéticas y epigenéticas que inactivan los genes supresores de tumor y activan oncogenes [3]. Sin embargo, los mecanismos básicos subyacentes iniciación del cáncer colorrectal y la progresión siguen siendo en gran medida desconocido.
similar a la insulina factor de crecimiento 1 receptor (IGF1R), un receptor de tirosina quinasa de IGF-1 e IGF-2, se sobreexpresa frecuentemente en tumores y ha sido bien documentado en cultivo celular, estudios en animales y seres humanos para desempeñar un papel en la transformación maligna, la progresión, la protección de la apoptosis, y la metástasis [4], [5]. La familia de receptores de IGF se compone de tres proteínas transmembrana, y el gen IGF1R se encuentra en el cromosoma 15q26, que codifica un único polipéptido de 1367 aminoácidos que se expresa constitutivamente en la mayoría de las células [5]. activación IGF1R conduce a la autofosforilación de tirosinas 1131, 1135 y 1136 en el dominio quinasa, seguido por la fosforilación de tirosinas yuxtamembrana y serinas carboxi-terminal [6]. Esto es seguido por el reclutamiento de los intermedios de conexión específicos, incluyendo la insulina-receptor sustrato-1 (IRS-1), Shc y proteínas 14-3-3 [7], [8]. Estas moléculas vinculan el IGF1R a diversas vías de señalización, lo que permite la inducción de crecimiento, la transformación, la diferenciación y la protección contra la apoptosis [9]. Al IGF-1 de unión, IGF1R activa el /cascada de PI3K Akt, que promueve G1 a S progresión del ciclo celular y eleva la proliferación celular [10], [11]. IGF1R se sobreexpresa durante la carcinogénesis colorrectal, con la más alta expresión observada en las células proliferantes en la base de las criptas colónicas [11], [12]. Sin embargo, el papel de IGF1R en el cáncer colorrectal que queda por esclarecer.
Durante la última década, una nueva clase de pequeñas moléculas de ARN conocidas como microRNAs (miRNAs) ha emergido como importantes reguladores de la iniciación y progresión de la humana tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal [13] - [15]. miRNAs son pequeños ($ ~ $ 22 nucleótidos de largo), de una sola cadena de ARN no codificante moléculas que regulan negativamente la expresión de genes mediante la unión a la región 3 'no traducida (3'-UTR) de las moléculas de ARNm diana, lo que resulta en ya sea la degradación de la transcripción o inhibición de la traducción [16] - [18]. Muchos miRNAs trabajan en conjunto con los otros para la expresión de proteínas de sintonía fina a nivel mundial. Por lo tanto, los miRNAs juegan un papel importante en la regulación de genes post-transcripcional. Es importante destacar que estudios recientes indican que la desregulación de miRNAs se asocia con tumores malignos humanos y sugieren un papel causal de miRNAs en la etiología del cáncer [19]. miRNAs presumiblemente desempeñan un papel en el cáncer, ya que pueden afectar a la traducción y la estabilidad de oncogenes específicos o supresores tumorales, lo que finalmente influyen fisiología celular [19], [20]. Por ejemplo, el miR-143 y miR-145 (MIR-143/145), que se encuentra en un clúster dentro de la región cromosómica 5q32-33, están regulados a la baja en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal [21], [22] . miR-143 y miR-145 se ha demostrado que poseen actividad anti-tumorigénico, incluyendo la participación en diversos procesos relacionados con el cáncer, como la proliferación, la invasión y la migración [23].
A pesar de que la desregulación de IGF1R y miRNAs se asocia con la tumorigénesis en el cáncer colorrectal humano, poco se sabe acerca de miRNAs que actúan sobre IGF1R. En este estudio, se encontró que IGF1R estaba regulado directamente por el miR-143 y miR-145 en células de cáncer colorrectal. Por otra parte, hemos demostrado que el miR-143/145 puede inhibir la expresión de IGF1R para suprimir la proliferación de células de cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
tejido humano
tejidos de cáncer colorrectal y tejidos cancerosos adyacentes apareados fueron obtenidas de pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Anhui (Hefei, china). Tanto los tumores y tejidos no cancerosos se sometieron a análisis histológico para la confirmación del diagnóstico. El tipo patológico de cada cáncer fue identificado como adenocarcinoma. consentimiento por escrito fue proporcionado por todos los pacientes o sus tutores, y el Comité de Ética de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui aprobó todos los aspectos de este estudio. Los fragmentos de tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido en el momento de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C. Las características clínicas de los pacientes se enumeran en la Tabla S1in Archivo S1.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano Caco2, HT29 y SW480 se adquirieron de Shanghai Institute of Cell Biology, chino Academia de Ciencias (Shanghai, china). células Caco2 se cultivaron en DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco) en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2; células HT29 y SW480 se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco) en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2.
aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de las células cultivadas y los tejidos utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los ensayos para cuantificar miRNAs maduros se realizaron con sondas TaqMan microARN (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 g de ARN total fue transcrito de forma inversa a cDNA utilizando AMV transcriptasa (Takara, Dalian, China) y un cebador tallo-bucle RT inversa, y se utilizó una décima parte de cDNA por reacción qPCR (Applied Biosystems). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min y 85 ° C durante 5 min. PCR en tiempo real se realizó con un kit TaqMan PCR y una (Applied Biosystems) Biosystems del sistema de detección de secuencias Applied 7300. Las reacciones se incubaron en una placa óptica de 96 pocillos a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. Después de las reacciones eran completas, el ciclo umbral (C
T) Los datos se determinaron utilizando los ajustes de umbral fijos, y la media C
T se determinó a partir PCR por triplicado. Un método C
T comparativo se utilizó para comparar cada condición de que las reacciones de control. U6 snRNA se utilizó como un control interno, y la cantidad relativa de los genes miARN normalizado a U6 se calculó con la ecuación 2
, en el que -ΔΔCT ΔΔC
T = (C
T miRNA-C
T U6)
focalización (C
T miARN-C
T U6)
control.
Para cuantificar IGF1R y el ARNm de GAPDH, 1 g de ARN total fue inverso-transcrito a cDNA utilizando oligo d (T) 18 cebadores (Takara) y Thermoscript transcriptasa inversa (Invitrogen). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 42 ° C durante 60 min y 70 ° C durante 10 min. a continuación, PCR en tiempo real se realizó con el producto de RT, tinte verde SYBR (Invitrogen) y cebadores específicos para IGF1R y GAPDH. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: IGF1R (sentido): 5 'GCCAAGCTAAACCGGCTAAA-3'; IGF1R (antisentido): 5'-TATCCTGTTTTGGCCTGGACATA-3 '; GAPDH (sentido): 5'-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 '; y GAPDH (antisentido): 5'-CGCTCATTGCCGATAGTG-3 '. Las reacciones se incubaron a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1 min. Después de que las reacciones eran completas, la C
valores de T se determinó mediante el establecimiento de un umbral fijo. La cantidad relativa de mRNA IGF1R se normalizó a GAPDH.
Mirna sobreexpresión
miRNA sobreexpresión se consiguió mediante la transfección de células con un miRNA mimic, un dúplex de ARN oligonucleótido sintético imitando el precursor miRNA. Las moléculas de ARN sintéticos, incluyendo pre-miR-143, pre-miR-145 y un ARN control negativo revueltos (pre-miR-control), fueron adquiridos de GenePharma (Shanghai, China). Caco2, HT29 y SW480 se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en el día siguiente, cuando las células fueron aproximadamente 70% de confluencia. Para los experimentos de sobreexpresión de los genes miARN, 100 pmol de pre-miR-143, 100 pmol de pre-miR-145 o 50 pmol de los dos pre-miR-143 y miR-pre-145 se utilizaron. A las 6 h después de la transfección, el medio para las células Caco2 se cambió a DMEM suplementado con suero bovino fetal al 2%, y el medio para las células HT29 y SW480 se cambió a medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 2%. Las células se recogieron a las 24 h o 48 h después de la transfección para el aislamiento de RNA total o la proteína, respectivamente.
Plásmido construcción y ensayo de siRNA de interferencia
Un plásmido de expresión de mamífero (Preceiver-M02 -IGF1R) especialmente diseñado para expresar el marco de longitud completa de lectura abierta (ORF) de IGF1 R humano sin miR-143/145 que responde 3'-UTR se adquirió de GeneCopoeia (Germantown, MD, EE.UU.). Un plásmido vacío sirvió como control negativo. El siRNA (sentido: 5'-GCGGCUGGAAACUCUUCUATT-3 '; antisentido: 5'-UAGAAGAGUUUCCAGCCGCTT-3') dirigidos a IGF1 R humano fue diseñado y sintetizado por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Un siRNA revueltos (Invitrogen) se incluyó como un control negativo. El plásmido sobreexpresión o siRNA fueron transfectadas en células Caco2 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se aisló el ARN total o proteína 24 h o 48 h después de la transfección. los niveles de mRNA IGF1R y de expresión de proteínas se evaluaron mediante RT-PCR cuantitativa y transferencia Western.
reportero de luciferasa ensayo
Todo el 3'-UTR de IGF1R humano se amplificó por PCR utilizando ADN genómico humano como una plantilla. Los productos de PCR se insertaron entonces en el plásmido p-MIR-reportero (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La inserción se confirmó que era correcta mediante secuenciación de ADN. Para probar la especificidad de unión, las secuencias que interactúan con la secuencia de semillas de miR-143 y miR-145 se mutaron (de UUGGGAG a AACCCUC para el sitio de unión de miR-143 y desde UUGGGAG a AACCCUC para el sitio de unión de miR-145), y la IGF1R mutante 3'-UTR se insertó en un plásmido indicador de luciferasa equivalente. Para los ensayos de reportero de luciferasa, Caco2, las células HT29 y SW480 se sembraron en placas de 24 pocillos y se co-transfectaron con 0,8 g de luciérnaga del plásmido informador de luciferasa, 0,8 g de β-galactosidasa (β-gal) plásmido de expresión (Ambion), y la igualdad de cantidades (20 pmol) de miR-143/145 imitador o un ARN control negativo revueltos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El plásmido β-gal fue utilizado como control de la eficiencia de la transfección. Las células se recogieron 24 h después de la transfección y se analizaron para la actividad de luciferasa usando un kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
aislamiento de proteínas y Western blotting
Las células o tejidos se lisaron en un tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% NP-40, desoxicolato de sodio 0,25% y EDTA 1 mM, pH 8,0) con un cóctel inhibidor de la proteasa recién añadido (Roche) durante 30 min en hielo y se centrifugaron a 16.000 × g a 4 ° C durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína se calculó con un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE (Bio-Rad). Después de la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad) y luego se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 h. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante 12 h. Después de tres lavados en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las membranas se incubaron con el sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico (Pierce). La misma membrana también se sondeó con un anticuerpo GAPDH para servir como control de carga. anticuerpos IGF1R y GAPDH se adquirieron de Cell Signaling (# 3018) y Santa Cruz Biotechnology (sc-25778), respectivamente.
proliferación de las células de ensayo
células Caco2 se sembraron a 5 x 10
4 células por pocillo en placas de 96 pocillos y incubadas durante la noche en DMEM suplementado con 10% FBS. Las células se recogieron a las 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección. Después de la transfección, se añadió 10 l de Cell Counting Kit-8 (# c0038, Beyotime) en el pocillo de ensayo correspondiente y se incubó durante 1 h. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm.
EdU Ensayo de proliferación
Para evaluar la proliferación celular, las células Caco2 se sembraron en placas de 24 pocillos. Las células se incubaron en condiciones estándar en medio completo. La transfección de las células se llevó a cabo el día siguiente como se describe anteriormente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se detectó la proliferación de células utilizando la incorporación de 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU) con la célula EdU Ensayo de proliferación de Kit (Ribobio, Guangzhou, China). Brevemente, las células fueron incubadas con 50 mM EdU durante 3 h antes de la fijación, permeabilización y tinción EdU, que se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (Sigma) a una concentración de 1 mg /ml durante 10 min. La proporción de células que incorporan EdU se determinó por microscopía de fluorescencia.
El análisis estadístico
Todas las imágenes de transferencia y Ensayo de proliferación occidentales son representativos de al menos tres experimentos independientes. Cuantitativos ensayos de RT-PCR y reportero de la luciferasa se realizaron por triplicado, y cada experimento individual se repitió varias veces. Los resultados se presentan como la media ± SE de al menos tres experimentos independientes. Se consideraron las diferencias observadas estadísticamente significativas a p & lt;. 0,05 mediante la prueba t de Student
Resultados
Identificación de conserva de miR-143 y miR-145 sitios diana dentro de la 3'-UTR de IGF1R
Tres algoritmos computacionales, incluyendo TargetScan [24] y RNAhydrid [25], se utilizaron en combinación para identificar miRNAs potenciales que se dirigen a IGF1R. Los tres algoritmos predijeron el miR-143 y miR-145 como reguladores de IGF1R. Las interacciones predichas entre miR-143/145 y los sitios diana dentro de la 3'-UTR de IGF1R se ilustran en la Figura 1A. Se observó una hibridación predicha entre tanto el miR-143 y miR-145 y la 3'-UTR de IGF1R. Aunque los dos sitios diana dentro de la 3'-UTR de IGF1R estaban cerca uno del otro, los sitios eran no solapantes. No era perfecta complementariedad entre la región de la semilla (la secuencia central que abarca los primeros 2-8 bases de la madurez miARN) y los objetivos afines. Los valores de energía libre mínima de las hibridaciones entre miR-143 y IGF1R y entre miR-145 y IGF1R eran -19,8 y -24,8 kcal /mol, respectivamente, que son bien dentro del rango de auténticos pares miARN objetivo. Además, las secuencias de unión de miR-143/145 en el IGF1R 3'-UTR son altamente conservadas entre las especies. Por lo tanto, el miR-143 y miR-145 fueron seleccionados como candidatos para la verificación experimental.
(A) Descripción esquemática de los dúplex hipotéticos formados por las interacciones entre los sitios de unión en la IGF1R 3'-UTR (arriba ) y miR-143/145 (abajo). El valor predicho energía libre de cada híbrido se indica. Los sitios de reconocimiento de la semilla se denotan, y todos los nucleótidos de estas regiones están altamente conservadas a través de varias especies, incluyendo humanos, de ratón y de rata. (B) Análisis de RT-PCR cuantitativa de miR-143 y miR-145 niveles en seis pares de tejido de cáncer colorrectal (C) y muestras de tejido no canceroso (P). (C y D) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína de IGF1R en seis pares de muestras C y P. C: imagen representativa; D: el análisis cuantitativo. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Identificación de una correlación inversa entre el miR-143/145 niveles y los niveles de proteína de IGF1R en tejidos de cáncer colorrectal
El interés en el clúster de miR-143/145 y IGF1R también fue apoyada por la reciente identificación de estos dos miRNAs como supresores de tumores candidato [26] y IGF1R como un oncogén en el cáncer colorrectal [8]. A continuación se investigó si los niveles de miR-143/145 se correlaciona inversamente con la expresión de la proteína IGF1 R en tejidos de cáncer colorrectal. Después de determinar los niveles de miR-143/145 y los niveles de proteína de IGF1R en seis pares de tejidos de cáncer colorrectal y los tejidos no cancerosos correspondientes, demostramos que-145 miR niveles de miR-143 y fueron regulados a la baja constantemente en tejidos de cáncer colorrectal (Figura 1B) , mientras que los niveles de proteína de IGF1R eran mucho más altos en los tejidos de cáncer colorrectal (Figura 1C y 1D). Estos resultados indicaron que el miR-143/145 niveles de expresión se correlacionan inversamente con la expresión de proteínas de IGF1R en tejidos de cáncer colorrectal humano.
Validación de IGF1R como objetivo directo de miR-143/145
La correlación entre el miR-143/145 y IGF1R se examinó mediante la evaluación de la expresión de IGF1R en las líneas celulares de cáncer colorrectal humano Caco2, HT29 y SW480 después de la sobreexpresión de miR-143/145. En estos experimentos, la sobreexpresión se consiguió mediante la transfección de Caco2, HT29 y las células SW480 con pre-miR-143 y /o pre-miR-145, que son oligonucleótidos de ARN sintéticos que imitan los precursores de miR-143 y miR-145. La sobreexpresión eficiente de miR-143/145 se muestra en la Figura 2A, 2F y 2K. Como se preveía, la sobreexpresión de miR-143 y /o miR-145 suprimió significativamente los niveles de proteína IGF1R en Caco2, HT29 y las células SW480 (Figura 2B, 2C; 2G, 2H y 2L, 2M). Para determinar el nivel de regulación en la que el miR-143/145 influenciados expresión de IGF1R, repetimos los experimentos anteriores y examinó la expresión del ARNm de IGF1R después de la transfección. La sobreexpresión de MIR-143/145 no afectó IGF1R la estabilidad del mRNA (Figura 2D, 2I y 2N). Estos resultados demostraron que miR-143/145 regula específicamente la expresión de IGF1R en el nivel post-transcripcional, que es el mecanismo más común para miRNAs animales.
(A, F y K) Análisis cuantitativo de RT-PCR de MIR -143/145 niveles en Caco2, HT29 y células SW480 tratadas con un control mezclado, pre-miR-143, pre-miR-145 o ambos pre-miR-143 y miR-pre-145. (B, C; G, H, y L, M) análisis de transferencia de Western de los niveles de proteína de IGF1R en células Caco2 tratados con un control mezclado, pre-miR-143, pre-miR-145 o ambos pre-miR-143 y pre -miR-145. B, G y L: imagen representativa; C, H y M: análisis cuantitativo. (D, I y N) Análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de mRNA en IGF1R Caco2, HT29 y las células SW480 tratadas con un control mezclado, pre-miR-143, pre-miR-145 o ambos pre-miR-143 y pre- miR-145. (E, J y O) Reconocimiento directo del IGF1R 3'-UTR de miR-143/145. Caco2, las células HT29 y SW480 fueron co-transfectadas con los reporteros de luciferasa de luciérnaga que contienen ya sea de tipo salvaje (WT) o mutante (MUT) miR-143/145 sitios de unión en la IGF1R 3'-UTR y un control mezclado, pre-miR 143, pre-miR-145 o ambos pre-miR-143 y miR-pre-145. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se analizaron utilizando un kit de ensayo de luciferasa. Los resultados se muestran como la relación de la actividad de luciferasa de luciérnaga en las células transfectadas con 145 miR-143 /a la actividad en las células de control. * P & lt; 0,05; ** P & lt;.
0,01
Para determinar si los efectos reguladores negativos de MIR-143/145 con la expresión de IGF1R estaban mediados por la unión de MIR-143/145 a los sitios objetivo previsto en el 3 '-UTR del ARNm IGF1R, la longitud total 3'-UTR de IGF1R que contiene los dos predijo miR-143/145 sitios de unión se insertó aguas abajo del gen de luciferasa de luciérnaga en un plásmido reportero. El plásmido resultante se transfectó en Caco2, HT29 y las células SW480, junto con un plásmido de control de transfección (β-gal) y, o bien pre-miR-143/145 o revueltos ARN control negativo. Como era de esperar, la actividad luciferasa se redujo notablemente en las células transfectadas con pre-miR-143 y /o pre-miR-145 (Figura 2E, 2J y 2O). Por otra parte, hemos introducido mutaciones puntuales en los sitios complementarios correspondientes en la 3'-UTR de IGF1R para eliminar los miR-143/145 sitios de unión previsto. Este reportero luciferasa mutado no se vio afectada por la sobreexpresión de miR-143/145 (Figura 2E, 2J y 2O). Este hallazgo sugiere que los sitios de unión miARN contribuyeron en gran medida a la miARN: mRNA interacción mediada que la represión post-transcripcional de la expresión de IGF1R. En conclusión, nuestros resultados demuestran que el miR-143/145 reconoce directamente y se une a la 3'-UTR de la transcripción del ARNm IGF1R para suprimir la expresión de IGF1R en células de cáncer colorrectal.
miR-143 y miR-145 puede suprime la proliferación de células de cáncer colorrectal
a continuación se centró en el estudio de las funciones de los MIR-143/145 en la regulación de IGF1R. Debido IGF1R es esencial para la regulación de la proliferación y la progresión del ciclo celular, se evaluaron los efectos de miR-143/145 sobre la proliferación de células de cáncer colorrectal utilizando un ensayo de CCK-8. En apoyo de la idea de que la función de miR-143 /145. cáncer suprimida miRNAs clave [26], las células Caco2, HT29 y SW480 transfectadas con la proliferación de pre-miR-143/145 mostraron suprimida (Figura 3A, 3E y 3I). Además, se evaluó el papel de IGF1R sobre la proliferación celular. Para derribar IGF1R, un siRNA dirigidos IGF1R se diseñó y se transfectó en Caco2, HT29 y las células SW480. Para sobreexpresar IGF1R, un plásmido que expresa el ORF IGF1R se transfectó en Caco2, HT29 y las células SW480. La sobreexpresión eficiente o desmontables de IGF1R se muestran en la Figura S1 S1 en Archivo. De acuerdo con estudios anteriores que muestran que IGF1R promueve la proliferación celular [27], las células Caco2, HT29 y SW480 transfectadas con el plásmido IGF1R sobreexpresión proliferado a una velocidad significativamente más alta (Figura 3C, 3G y 3K), mientras que knockdown IGF1R con siRNA la proliferación suprimió de forma significativa (Figura 3B, 3F y 3J). Por lo tanto, el efecto antiproliferativo de IGF1R caída fue similar a la de miR-143/145 sobreexpresión. Además, se construyó un IGF1R resistente a miR-143/145 plásmido sobreexpresión (por eliminación de su 3'-UTR). En comparación con las células transfectadas con pre-miR-143/145, las células transfectadas con pre-miR-143/145 y el plásmido IGF1R sobreexpresión exhibido significativamente mayores tasas de proliferación (Figura 3D, 3H y 3L), lo que sugiere que miR-143/145 IGF1R -resistant rescató la supresión de IGF1R por el miR-143/145 y atenúa el efecto antiproliferativo de miR-143/145.
(A, e e I) se realizaron ensayos de viabilidad CCK-8 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección de Caco2 (a), HT29 (e) y células SW480 (I) con un control mezclado, pre-miR-143, pre-miR-145 o ambos pre-miR-143 y pre -miR-145. (B, F y J) células ensayos de viabilidad se realizaron 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección de Caco2 (B), HT29 (F) y SW480 (J) 8 CCK-ya sea con un control mezclado siRNA o un IGF1R siRNA. (C, G y K) células ensayos de viabilidad se realizaron 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección de Caco2 (C), HT29 (G) y SW480 (K) 8 CCK-ya sea con un vector de control o una sobreexpresión IGF1R vector. (D, H y L) de CCK-8 ensayos de viabilidad se realizaron 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección de Caco2 (D), HT29 (H) y SW480 (L) de las células ya sea con un control mezclado, pre-MIR -143 /145 o ambos pre-MIR-143/145 y el vector de sobreexpresión de IGF1R. * P & lt; 0,05; ** P & lt;.
0,01
A fin de probar el efecto biológico de IGF1R orientados por el miR-143/145 con el crecimiento de células de cáncer colorrectal, el efecto de MIR-143/145 y IGF1R en la célula proliferación se examinó con un ensayo EdU, un método de detección inmunoquímica que mide la incorporación análogo de nucleótido en el ADN recién replicado. Consistente con los resultados del ensayo de CCK-8, el porcentaje de células EdU-positivas fue significativamente menor en las células transfectadas con pre-miR-143/145 (Figura 4A y 4B). De manera similar, se observaron significativamente más células EdU-positivas en las células con sobreexpresión de IGF1R, mientras que las células transfectadas IGF1R-siRNA mostraron el efecto opuesto sobre la proliferación celular (Figura 4C y 4D). Estos resultados demostraron una vez más que la disminución de los niveles de IGF1R produjeron el mismo fenotipo observado por el miR-143/145 sobreexpresión. Para examinar más a fondo la relación funcional entre el miR-143/145 y IGF1R, Caco2 células se transfectaron simultáneamente con pre-MIR-143/145 y el plásmido de sobreexpresión de IGF1R. Como era de esperar, la sobreexpresión de IGF1R rescatado dramáticamente el efecto supresor de miR-143/145 sobre la proliferación celular (Figura 4E y 4F). Tomados en conjunto, los resultados demuestran que el miR-143/145 suprimir la proliferación de células silenciando IGF1R.
Las células fluorescentes rojos están en la fase S de la mitosis, y las células fluorescentes azules representan todas las células. (A y B) El ensayo de proliferación EdU se realizó 48 horas después de la transfección de células Caco2 con un control mezclado, pre-miR-143, pre-miR-145 o ambos pre-miR-143 y miR-pre-145. A: imagen representativa; B: proporción de células Caco2 EDU-positivos. (C y D) El ensayo de proliferación de EdU se realizó 48 h después de la transfección de células Caco2 con un control mezclado siRNA, IGF1R siRNA, vector de control o el vector IGF1R sobreexpresión. C: imagen representativa; D: relación de células Caco2 EDU-positivos. (E y F) El ensayo de proliferación de EdU se realizó 48 h después de la transfección de células Caco2 con un control más control de vector revueltos, un control mezclado más IFG1R sobreexpresión vector, pre miR-143-/145, más el control de vectores, o pre-MIR -143 /145 plus IFG1R vector de sobreexpresión. E: imagen representativa; F: proporción de células Caco2 EDU-positivos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Discusión
Durante las últimas décadas, los grandes avances en nuestra comprensión de la biología del cáncer colorrectal han dado lugar a la mejora de las técnicas de diagnóstico y pronóstico y para el desarrollo de nuevos terapias dirigidas. Sin embargo, la eficacia de nuevos tratamientos sigue siendo limitado por una combinación de resistencia al fármaco y por nuestro entendimiento limitado de vías de señalización de células tumorales. Recientemente, un importante papel para IGF1R en la génesis y progresión del cáncer colorrectal se ha convertido en [28] - [30]. Por lo tanto, IGF1R ofrece una diana molecular particularmente prometedor para la terapia de cáncer colorrectal. Sin embargo, se sabe muy poco acerca de la regulación de la expresión de IGF1R en el cáncer colorrectal. Por lo tanto, los mecanismos moleculares que subyacen a las vías de regulación de IGF1R necesitan ser completamente aclarada.
En este estudio, que predijo IGF1R a ser un objetivo de miR-143 y miR-145, que son un conjunto de miRNAs que han sido reportada en muchos estudios para ser regulados a la baja y para funcionar como supresores de tumores en la mayoría de los tipos de cáncer [21], [22]. Después de medir los niveles de expresión de miR-143/145 y IGF1R en el tejido de cáncer colorrectal humano y tejido no canceroso emparejado, se detectó una correlación inversa entre el miR-143/145 niveles y los niveles de proteína de IGF1R. Por otra parte, mediante la sobreexpresión de miR-143/145 en células Caco2, nos validada experimentalmente que el miR-143/145 IGF1R traducción directamente inhibida. Por último, puso de manifiesto que el miR-143/145 expresión de IGF1R inhibido y por lo tanto suprimen la proliferación de células de cáncer colorrectal
en
in vitro
. Los resultados delinean una red de regulación novedosa que emplea el miR-143/145 y IGF1R para afinar la proliferación celular. También nos presentó pruebas de que la restauración de la expresión de IGF1R puede revertir la proliferación de células de miR-143/145-suprimida. Curiosamente, se ha demostrado previamente que miR-145 puede apuntar sustrato-1 del receptor de insulina (IRS-1) y IGF1R en células de cáncer de colon [31] - [33]. Sin embargo, mientras que un IRS-1 resistentes a miR-145 puede rescatar células de cáncer de colon de la inhibición del crecimiento inducida por el miR-145, un IGF1R resistente a miR-145 no para rescatar células de cáncer de colon de la inhibición del crecimiento [33]. Esto no está de acuerdo con nuestros hallazgos. Parece que si miR-145 puede apuntar IGF1R para regular el crecimiento celular depende de los tipos de células y tumores. En circunstancias diferentes, miR-145 puede ejercer diferentes funciones. Sin embargo, los resultados de nuestro y otros destacan que el miR-143/145 puede actuar como supresor de tumores-miRNAs, y que la focalización de IGF1R puede ser un mecanismo por el que el miR-143/145 clúster ejerce su función supresora de tumores. Por lo tanto, la modulación de IGF1R por miR-143/145 puede explicar por qué la regulación a la baja de miR-143/145 durante la carcinogénesis colorrectal puede promover la progresión del cáncer.
miRNAs que se encuentran cerca en el genoma (menos de 10 kb) se considerará que pertenecen a un solo grupo. grupos miARN se transcriben de forma coordinada como unidades polycistronic que se procesan para producir los miembros individuales miARN, que resultan en la co-expresión de los miRNAs.