Extracto
mucinas transmembrana, MUC4 y MUC16 se asocian con la progresión tumoral y el potencial metastásico en pancreática humana adenocarcinoma. Descubrimos que el miR-200c interactúa con secuencias específicas dentro de la secuencia codificante del ARNm MUC4 y MUC16, y evaluó la naturaleza normativa de esta asociación. líneas celulares de cáncer de páncreas S2.028 y T3M-4 transfectadas con miR-200c mostraron un 4.18 y 8.50 doblar hacia abajo regulación de MUC4 ARNm, y 4,68 y 4,82 veces la regulación negativa de MUC16 ARNm en comparación con las células transfectadas de manera simulada, respectivamente. También se observó una reducción significativa de la expresión de la glicoproteína. Estos resultados indican que la sobreexpresión de miR-200c regula mucinas MUC4 y MUC16 en células de cáncer pancreático por la orientación directamente la secuencia codificante de mRNA de cada uno, lo que resulta en niveles reducidos de MUC4 y MUC16 mRNA y proteína. Estos datos sugieren que, además de la regulación de las proteínas que modulan la EMT, las influencias miR-200C expresión de mucinas de la superficie celular en el cáncer de páncreas
Visto:. Radhakrishnan P, Mohr AM, PM Grandgenett, Steele MM, Batra SK, Hollingsworth MA (2013) microARN-200c modula la expresión de MUC4 y MUC16 atacando directamente a sus secuencias de codificación en el cáncer de páncreas humano. PLoS ONE 8 (10): e73356. doi: 10.1371 /journal.pone.0073356
Editor: Klaus Roemer, Universidad de la Escuela de Medicina Sarre, Alemania |
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: July 19, 2013; Publicado: 25 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Radhakrishnan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de las siguientes subvenciones del Instituto Nacional del cáncer: SPORE (1P50CA127297), Early Detection Research Network (5U01CA111294), la Alianza de Glycobiologist para la Detección de cáncer y el riesgo de cáncer (5U01CA128437), tumor microambiente de red (CA163120 U54), y R01CA57362 . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miRNA) son pequeñas (~ 20-22 nucleótidos) ARNs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la interacción con cualquiera 'no traducida (3' UTR 3) o la región codificante del ARNm diana. Expresión de productos génicos específicos se ven afectados por la degradación del ARNm de los genes miARN inducida o inhibición de la traducción [1]. Alterada la expresión de miRNAs en los resultados de cáncer en las funciones de promoción de supresores de tumores y de tumores. Por ejemplo, el miR-155, miR-17-5p y miR-21 han conocido las actividades oncogénicas [2,3], mientras que, el miR-15a, miR-16-1, let-7 y miR-145 funcionan como supresores de tumores [ ,,,0],4-9]. Se ha demostrado que el miR-200c se expresa diferencialmente en el cáncer de páncreas, donde la alta expresión se asocia con una mejor supervivencia y baja expresión se asocia con una peor supervivencia [10]. La sobreexpresión de miR-200c inhibe la invasión de células cancerosas por factores moduladores importantes de la EMT [10]. La expresión ectópica de miR-200c induce mayores niveles de E-cadherina en mama y células de cáncer pancreático a través de la orientación directa del factor de transcripción 8 (TCF8 /ZEB1), un regulador negativo de la E-cadherina [11-14]. Por lo tanto, las células con altos niveles de miR-200c tienen un fenotipo mesenquimal más epitelial y menos que pueda afectar la metástasis. Recientemente, la sobreexpresión de miR-200c ha demostrado inhibir la progresión del tumor de melanoma y la resistencia a los medicamentos [15]
.
La expresión aberrante de glicoproteínas de mucina se asocia con la progresión del cáncer de páncreas a la metástasis. Las mucinas transmembrana, MUC4 y MUC16, se sobreexpresa de forma aberrante en muchos adenocarcinomas, incluyendo el cáncer de páncreas humano [16-18]. El MUC4 mucina es una glicoproteína grande expresado por las células epiteliales en una variedad de tejidos. MUC4 no se expresa en el páncreas normal, pero se expresa de forma aberrante en un alto porcentaje de lesiones premalignas y malignas pancreáticas [16,19]. MUC4 promueve el crecimiento del cáncer y la metástasis, en parte, a través de la interacción con el HER2 oncoproteína [20,21]. MUC16 (CA125) es un alto glicoproteína mucina peso molecular normalmente se expresa en la superficie ocular, el tracto respiratorio y órganos reproductores que contienen células epiteliales [22]. CA125, un epítopo en MUC16, se utiliza como marcador tumoral para la detección de cáncer de ovario en los sueros de los pacientes [23] y el crecimiento del cáncer de ovario MUC16 influencias y metástasis [24]. El aumento de expresión de MUC16 también se observa en el cáncer pancreático humano [17,18], y hemos demostrado recientemente que hay una mayor expresión en las lesiones metastásicas de pacientes con cáncer de páncreas [25].
Presentamos aquí que miR 200c interactúa con secuencias específicas dentro de la secuencia de codificación de MUC4 y MUC16 mRNAs y regula sus niveles de expresión. De la expresión de mucinas transmembrana y la pérdida de miR-200c están altamente relacionados con características de las metástasis de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo
células de cáncer pancreático humano Capan-1 (American Type Culture Collection, ATCC), S2.007, S2.013, S2.020, S2.028 [26], HPAF (generoso regalo de RS Metzgar, Departamento de Microbiología e Inmunología, Duke University Medical Center, Durham. Carolina del Norte), y T3M-4 (especie de regalo de Tetsuro Okabe, Universidad de Tokio, Japón) fueron cultivadas en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), complementado con un 10% de suero bovino fetal (Valle Biomedical Inc., Winchester, VA, EE.UU.), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 unidades /ml de penicilina (Mediatech Inc., Manassas, VA, EE.UU.) y se incubó a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado.
aislamiento microARN y análisis PCR en tiempo real (RT-PCR) de miR-200c
miARN se extrajeron de las células de cáncer de páncreas usando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion, Carlsbad, CA, EE.UU.). La expresión de miR-200c se cuantificó usando el kit de ensayo TaqMan microARN (ABI, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
miARN-200c sobreexpresión en S2.028 y 4 T3M líneas celulares de cáncer pancreático
los oligonucleótidos de la transcripción primaria de miR-200c se clonaron en p
Silenciador
4,1-CMV plásmido (Ambion, Carlsbad, CA, EE.UU.) (Tabla S1) para establecer un vector de expresión estable. Las células se sembraron a 75 x10
3 células por pocillo (placa de 12 pocillos) el día antes de la transfección, y 1 g de plásmido se transfectó en las células el día siguiente utilizando Lipofectamine LTX con reactivo PLUS (Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se colocan bajo selección con G418 (200μg /ml) 48 horas después de la transfección. Los clones fueron recogidos posteriormente y analizados para la expresión de miR-200c en la línea celular S2.028 (clon 7), mientras que una población seleccionada policlonal se utilizó para la línea celular T3M-4. Las células transfectadas con la secuencia codificada que contiene el vector del kit (Ambion, Carlsbad, CA, EE.UU.) sirvieron como control negativo. La expresión de miR-200c se cuantificó usando el kit de ensayo TaqMan microARN (ABI, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. U6 rRNA se utilizó como control interno. El factor de cambio en la expresión se calculó utilizando la 2
-ΔΔCt método [27].
azul de metileno Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se ensayó usando un colorante azul de metileno como celular descrito anteriormente [28]. S2.028 y células que expresan T3M-4 de control y miR-200C se contaron y se sembraron en placas a 2.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y 200 l de volumen total de, ocho réplicas para cada marco de tiempo. En cada punto de tiempo (24, 48, 72 y 96 horas) los medios se retiraron y las células se lavaron una vez con 150 l de PBS de Dulbecco y se fijaron con 150 l 10% de formalina durante 30 minutos a temperatura ambiente. La formalina se eliminó y las células se tiñeron durante 2 horas con 80 l de 1% de azul de metileno (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.) diluido con tampón de borato 0,01 M, pH 8,5. Las células se lavaron con 150 l de tampón de borato 0,01, pH 8,5, cuatro veces. El azul de metileno se extrajo con 100 l de 0,1 N HCl /etanol (1: 1) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia a 650 nm se determinó mediante análisis espectrofotométrico. De dos vías ANOVA se utilizó para analizar la diferencia estadística entre los grupos. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
-PCR en tiempo real (RT-PCR) análisis de la expresión de mucina
El ARN total fue aislado de S2.028 y T3M de 4 células por medio de Reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc mediante el uso de kit Verso cDNA (Thermo, Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Análisis de los niveles de MUC1, MUC4, MUC16 y ARNm de GAPDH se llevaron a cabo con SYBR Green PCR Master Mix (ABI, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los siguientes cebadores se utilizaron para la RT-PCR: MUC1, F-5-CTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTG-3; R-5- TGAACCGGGGCTGTGG CTGG-3; MUC4, F-5-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3; R-5-ATGGTGCCGTTGTAATT TGTTGT-3; MUC16, F-5-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA-3; R-5-ACCAGTGGGCAT TCCAGAAAGAGA-3; GAPDH, F-5-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3; R-5-ACCAA ATCCGTTGACTCCGACCTT-3. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado. Las diferencias en la expresión de genes de mucina, expresados como factores de cambio, se calcularon utilizando la 2
-ΔΔCt método que usa GAPDH como control interno.
El análisis por inmunotransferencia de mucinas
electroforesis en gel
SDS-agarosa se utilizó para analizar la expresión de mucina tal como se describe anteriormente [29]. Las células que expresan miR-200c o un control mezclado se recogieron y la proteína se extrajo usando NP-40 tampón de lisis celular (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH 8,0) suplementado con inhibidores de proteasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los lisados celulares (50-100 mg proteínas) se resolvieron en SDS (0,1%) - agarosa (2%) electroforesis en gel y transferidos a una membrana de PVDF. Las membranas fueron bloqueadas en el 5% sin grasa leche en polvo en solución salina tamponada con Tris (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl) con 0,1% de Tween 20, pH 7,4. Las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: MUC1 (AR20.5-IgG de ratón, de Quest PharmaTech Inc, Edmonton, Alberta, CA), MUC4 (8G7- IgG de ratón, de regalo del doctor Surinder K Batra, Departamento de Bioquímica y biología molecular, UNMC), MUC16 (AR9.6R333 IgG de ratón, de Quest PharmaTech Inc, Edmonton, Alberta, CA) y α-tubulina (IgG de ratón, el banco de hibridoma estudios del Desarrollo, Iowa, EE.UU.) (1: 1000 diluciones con 5% sin -fat leche en polvo en TBS-T), durante la noche a temperatura ambiente. Las membranas fueron posteriormente lavadas (3 × 10 min) con TBS-T a temperatura ambiente y se sondaron con 1: 5000 diluido HRP de cabra anti ratón conjugado anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente y se lavó 3 x 10 min con TBS-T. La señal se detectó con el Super señal
® sustrato West Pico quimioluminiscente (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Una cuantificación densitométrica de las bandas de proteínas MUC4 y MUC16 se llevaron a cabo utilizando el programa ImageJ (NIH). El factor de cambio en la intensidad de la banda de proteína (unidades arbitrarias por ciento) se calcula dividiendo la densidad de la proteína de miR-200c células que expresan la proteína por la densidad de las células de control de vectores. La detección de alfa tubulina se utilizó como control de carga.
Vector construye
ORF regiones de ARNm MUC16 y MUC4 que se prevé para interactuar con el miR-200c se sintetizaron y se inserta en PMIR-INFORME
TM miARN sistema de expresión del indicador del vector (ABI, Carlsbad, CA, EE.UU.), utilizando los sitios de restricción SpeI y HindIII (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). secuencias de tipo salvaje y mutante MUC4 y MUC16 /miR-200C interacciones fueron sintetizados y utilizados en este estudio (Tabla S1). Las mutaciones dentro de posibles sitios de unión de miR-200C fueron generados por la sustitución de nucleótidos de la secuencia de tipo salvaje para inhibir la unión de miR-200c. La inserción y orientación del fragmento se confirmó mediante análisis de secuencia. Los plásmidos se designaron PMIR-INFORME
TM-salvaje (MUC16 y MUC4 en peso) y PMIR-INFORME
TM-mutante (MUC16 y MUC4 tm) (Tabla S1).
Transfección y ensayos de luciferasa células
cáncer de páncreas (S2.028 y T3M-4) se cultivaron en una placa de 6 pocillos y se transfectaron transitoriamente a 60-80% de confluencia con los plásmidos indicados anteriormente usando el Lipofectamine
reactivo TM 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. La actividad de luciferasa se midió mediante el uso de sistemas de ensayo indicador de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.), 48 h después de la transfección. Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un lector de placas de 96 pocillos (Polar Star Optima lector de microplacas, Offenburg, Alemania). Todos los valores se presentan como media ± SEM de unidades relativas de luciferasa (RLU) a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Una prueba t no pareada (dos colas) se realizó para el análisis estadístico utilizando el programa GraphPad PRISM versión 5.0. Las diferencias con un valor de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
miR-200c:. Perfiles de expresión y sobreexpresión en líneas celulares de cáncer de páncreas
Hemos investigado la expresión de miR-200c en 7 el cáncer de páncreas líneas celulares por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Como se muestra en la Figura 1A, 5 líneas celulares de cáncer pancreático, incluyendo Capan-1, S2.007, S2.013, S2.028, y T3M-4, expresan niveles más altos de miR-200c que las células S2.020 y HPAF.
(a) La expresión de miR-200c en siete células del cáncer pancreático se determinaron mediante PCR en tiempo real. Cada muestra se realizó por cuadruplicado y las barras de error representan SD. S2.028 (B) y T3M-4 células (C) que expresan establemente el transcrito primario de miR-200c se evaluaron para la expresión de miR-200c por PCR en tiempo real. Cada medición se llevó a cabo por triplicado. Estos valores se normalizaron con el control interno U6 rRNA. El aumento en los niveles de transcripción veces más de control de vectores se expresan como media ± S. D. El valor p se determinó usando la prueba t de Student. Las diferencias con un valor de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
La secuencia madura de miR-200c fue sintetizado y clonado en un vector de expresión como se describió anteriormente (p
Silenciador
4,1-CMV-miR-200c) , y de forma estable se expresa en las células y S2.028 T3M-4. Análisis cuantitativo de RT-PCR de la expresión de miR-200c en las células S2.028-miR-200c mostró un aumento de 3,68 veces y las células T3M-4-miR-200c mostró un aumento de 2,6 veces en los niveles de madurez de miR-200C en comparación con las células control transfectadas vector (Figura 1B y 1C). Se confirmó que la forma madura recombinante de miR-200c era activa mediante la observación de regulación a la baja de la expresión de ZEB1, un objetivo conocido por miR-200c, en ambos S2.028 y T3M-4 células (Figura S1).
también se examinaron los cambios en las propiedades de proliferación celular de miR-200c que expresan las células de cáncer de páncreas S2.028 y T3M-4. Se observó una reducción significativa en la tasa de crecimiento de S2.028 miR-200c a las 72 y 96 horas (*** p & lt; 0,0001) en comparación con las células control vector S2.028 (Figura S2A). Sin embargo, no se observó ningún cambio cuando T3M 4-miR-200c se comparó con las células control vectorial en cualquier punto de la prueba del tiempo (Figura S2 B).
MUC4 y MUC16 expresión es reprimida por el miR-200c
Se evaluó la capacidad de miR-200c para regular las mucinas unidas a la membrana mediante la expresión de miR-200c (p
Silenciador
4,1-CMV-miR-200c) en líneas celulares de cáncer de páncreas S2.028 y T3M-4. Hubo una reducción dramática de la proteína en las células MUC4 S2.028-miR200c (1,7 veces) y T3M-4-miR-200c (4,46 veces) con respecto a las células control (Figura 2A y 2B). De manera similar, hubo una reducción significativa en la proteína de MUC16 (isoformas alto y bajo peso molecular) en S2.028-miR200c (18,1 y 5,9 veces, respectivamente) y T3M-4-miR-200c (5,2 y 6,1 veces, respectivamente) en comparación con las células las células de control (Figura 3A y 3B).
lisados a partir de (a) S2.028 y (B) T3M-4-miR-200c y las respectivas células transfectadas de control del vector se separaron en electroforesis en gel de SDS-agarosa, sometidos a Western blot utilizando un anticuerpo anti-MUC4 (paneles de la izquierda) y las señales se cuantificaron por densitometría y se analizaron utilizando el programa ImageJ (paneles de la derecha). El miR-200c células que expresan mostró una reducción significativa de la proteína MUC4 comparación con las células de control en (A) S2.028 y T3M-4 células (B). La detección de alfa tubulina se utilizó como control de carga.
(A) S2.028 y (B) T3M-4-miR200c y respectivos de control de vectores transfectadas lisados de células se separaron por electroforesis en gel de SDS-agarosa y se sometieron a transferencia de Western usando un anticuerpo anti-MUC16 (paneles de la izquierda). intensidad de las bandas se cuantificó por densitometría y se analizó usando el programa ImageJ (paneles de la derecha). Se observaron reducciones significativas de ambos peso MUC16 isoformas de proteínas de alto y bajo peso molecular en miR-200c expresar S2.028 (A) y T3M-4 células (B) que en comparación con las células de control del vector. α-tubulina se utilizó como control de carga.
objetivos de miR-200C transcripcionalmente mucinas unidas a la membrana MUC4 y MUC16
También observaron una reducción significativa de ambos niveles de ARNm MUC4 y MUC16 en miR200c líneas celulares que expresan. transcripciones MUC4 se redujeron 4.18 y 8.50 veces en S2.028-miR200c y T3M-4-miR200c respectivamente (Figura 4A y 4B), en comparación con las células control. MUC16 transcripciones se redujeron 4,68 y 4,82 veces mayor en S2.028-miR200c y T3M-4-miR200c respectivamente, en comparación con las células control (Figura 4C y 4D). Estos hallazgos indican que el miR-200c regula la expresión oncogénica de la transcripción y traducción MUC4 y MUC16.
QRT-PCR análisis de MUC4 (A y B) y MUC16 (C y D) se lleva a cabo el control de vectores y MIR -200C transfectadas S2.028 (A y C) y T3M-4 células (B y D). La expresión relativa de MUC4 y MUC16 se evaluó por el 2
-ΔΔCt método que usa GAPDH como control interno. Las células que expresan miR-200C (S2.028 y T3M-4) mostraron niveles significativamente reducidos de MUC4 mRNAs comparación con las células de control de vector (A y B). La expresión de MUC16 transcripción se redujo en el miR-200c expresar S2.028 y T3M-4 células (C y D). Todas las mediciones se llevaron a cabo por triplicado. El aumento en los niveles de transcripción veces más de control de vectores se expresan como media ± S. D. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Predicción de las secuencias en MUC4 y MUC16
Potencial de miR-200c orientadas a regiones en el MUC4 unión de miR-200c y transcripciones MUC16 se identificaron utilizando el servidor web de destino predicción RegRNA microARN (http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). RegRNA miARN predicción objetivo identificado alta probabilidad de miR-200c unión a secuencias de codificación de MUC4 entre pares de bases 820 a 842 (Exon-1) (Figura 5A) (Figura S3) y diez regiones diferentes, incluyendo nueve exones diferentes dentro de la secuencia de mRNA MUC16 (Figura 5B) (Figura S3). Estos datos nos llevó a determinar si el miR-200c podría dirigirse directamente MUC4 y MUC16 transcripciones dentro de las regiones traducidas.
Posible miR-200c dirige a algunas regiones en MUC4 y MUC16 se identificaron utilizando el servidor web RegRNA MicroARN objetivo de predicción ( http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). A, RegRNA miARN predicción de destino muestra que miR-200c se une entre los pares de bases 820-842 en el primer exón de MUC4. B, En MUC16 ARNm, el miR-200c se predice de obligar a nueve exones diferentes, incluyendo E1, E3, E19, E39, E44, E49, E54, E64 y E73. Los números indican la región de los ARNm que interactúan con el miR-200c.
miR-200c se dirige directamente a las secuencias codificadoras de MUC4 y MUC16
Se evaluó la unión de miR-200c a la putativa secuencia diana por clonación de las regiones que contienen secuencias que codifican MUC4 y MUC16 humanos en el vector reportero PMIR-luciferasa (PMIR-MUC4 y MUC16 en peso). Controles negativos se producen en la que el PMIR-MUC4 y MUC16 secuencias se mutaron en los sitios de unión putativos para miR-200c y las mucinas (PMIR-MUC4 y MUC16 MT) (Figura 6A). células S2.028 y T3M-4 /miR-200C fueron transfectadas transitoriamente con ADN de plásmido que codifica el vector solo, de tipo salvaje MUC4 y MUC16 secuencias en el vector, y de tipo mutante MUC4 y MUC16 secuencias en el vector. Hemos observado que la actividad de informador de luciferasa se suprimió significativamente tanto para células miR-200C T3M-4 transfectadas con la secuencia de tipo salvaje vectores MUC4 y MUC16 en S2.028 y en comparación con las células transfectadas de control del vector (*** p & lt; 0,0001, MUC4-WT , MUC16-peso versus control vectorial) (Figura 6B-E). Sin embargo, las células transfectadas con la secuencia mutante que contiene vectores mostraron un aumento significativamente la actividad de informador de luciferasa (*** p & lt; 0,0001, MUC4-WT vs MUC4-mt; MUC16-WT vs MUC16-mt)., (Figura 6B-E)
(A) de tipo salvaje y secuencias mutadas de MUC4 y MUC16 se clonaron en el vector PMIR-luciferasa (PMIR-MUC4 en peso y MUC16 en peso) y (PMIR-MUC4 MT y MUC16 MT) respectivamente. Vectores que expresan PMIR-Luc, en peso PMIR-MUC4, PMIR-MUC16 en peso, PMIR-MUC4 MT y MT PMIR-MUC16 se transfectaron en S2.028miR-200c (B y D) y las células T3M-4miR-200C (C y E) y la actividad de luciferasa se cuantificó 48 h después de la transfección. Los resultados se expresaron como la actividad de luciferasa relativa (Media ± SEM de tres determinaciones independientes). El valor p se determinó mediante la prueba t de Student (
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado por primera vez que un peso molecular objetivos MIRR-200C alta mucina por las glicoproteínas la orientación de su secuencia de codificación para la degradación o la inhibición de la traducción. en concreto, miR-200c se dirige a secuencias de MUC4 y el exón MUC16 para regular los niveles de ARNm y de proteína para cada una de estas mucinas. Hemos demostrado que miR-200c se expresa diferencialmente en células de cáncer pancreático. Yu et al observaron una tasa de supervivencia significativamente mayor en los pacientes con cáncer de páncreas con mayores niveles de miR-200c en comparación con aquellos con niveles más bajos de miR-200c [10]. el trabajo previo ha demostrado que las células de cáncer pancreático con sobreexpresión de miR-200c exposición reducida invasión y una mayor los niveles de mRNA de la e-cadherina, lo que sugiere que el miR-200c juega un papel inhibitorio en el crecimiento del cáncer de páncreas y la invasión [10]. la sobreexpresión de miR-200c aumentaron la tasa de proliferación en traje-2, PANC-1 y 3 KP cáncer de páncreas las células [10], sin embargo, se observó la proliferación celular reducida de las células que expresan S2.028 miR-200C, lo que sugiere que las propiedades de crecimiento celular regulados diferencialmente por miR-200c son dependientes de contexto. MiR-200c se ha descrito como un potente regulador maestro de epitelial a mesenquimal transición de mama y células de cáncer de ovario a través de la alteración de la expresión de ZEB1 y E-cadherina mediante la unión a 3 'UTRs y la degradación de la conducción o bloqueo de la traducción del ARNm diana [11-14]. La restauración de la expresión de miR-200c en células de cáncer de mama y de ovario muy agresivos redujo significativamente la invasión, la migración y la resistencia a los medicamentos de estos tipos de tumores [30,31]. Estos informes sugieren que la introducción de miR-200c en células cancerosas podría revertir la progresión del tumor y proporcionar una nueva estrategia de tratamiento
La mayoría de los informes muestran que miRNAs se dirigen a la 3'UTR no codificante del ARNm.; Sin embargo, informes recientes han demostrado que los miRNAs pueden también dirigirse contra las secuencias de codificación de genes de mamíferos. Presentamos aquí que los objetivos de miR-200C exón secuencias de codificación de las transcripciones de alto peso molecular glicoproteínas de mucina MUC4 y MUC16 y reduce el ARNm y proteínas expresión. Del mismo modo, Huang et al, informó de que miR-181 se dirige a un gran número de genes de dedo de cinc mediante la unión a sus secuencias de codificación [32] y Duursma et al informaron de que miR-148 dianas de ADN humano metiltransferasa 3b (DNMT3b) ácido amino regiones [codificación ,,,0],33]. Let-7 miARN se dirige a la región de codificación de la enzima de procesamiento de miRNA, Dicer [34]. Murino Nanog, Oct4 y Sox2 genes contienen numerosos sitios de unión en las secuencias de exón que codifica miRNAs presentes en la naturaleza [35]. Estos informes sugieren que los miRNAs se dirigen a las familias de genes específicos dentro de las regiones codificantes.
Reglamento de MUC4 y MUC16 por miR-200c puede ser a través de efectos en cualquier transcripción o traducción. En ambas células líneas estudiadas aquí, los niveles de proteína MUC16 se redujeron en un grado mayor que MUC4. Esto aumentó la orientación de MUC16 por miR-200c puede ser debido a la presencia de diez regiones de unión a miR-200c diferentes en el ARNm MUC16 en comparación con la región de unión individual en la secuencia de MUC4 de codificación, aumentando la posibilidad de que el número de sitios de segmentación en una transcripción influye en la sensibilidad de esa transcripción a la regulación de los genes miARN
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Recientemente, Ponnusamy et al informaron de que la sobreexpresión de resultados MUC4 en transición epitelial a mesenquimal a través de regulación a la baja de e-cadherina y el aumento de la migración de células de cáncer y la invasión en el cáncer de ovario las células [36]. Estos resultados son consistentes con nuestro estudio, lo que demuestra que la sobreexpresión de la mesenquimal epitelial promoción de miR-200c abajo regula ZEB1 y MUC4 en células de cáncer pancreático.
MUC16 es altamente sobreexpresado en el cáncer de ovario y moderadamente sobreexpresada en el cáncer de páncreas , pero el papel de MUC16 en la progresión del cáncer de páncreas no ha sido ampliamente estudiado. El nivel significativamente reducido de MUC16 observa en miR-200c células que sobreexpresan, junto con el papel bien documentado de miR-200c en múltiples etapas de la progresión del cáncer sugiere que MUC16 puede tener un papel en el crecimiento de células de cáncer de páncreas y metástasis. Estos estudios indican que la regulación de mucinas y regulación a la baja de miR-200c mejorar las propiedades malignas de células de cáncer y por lo tanto inducir el crecimiento del cáncer de páncreas y metástasis.
Varios estudios han demostrado que la expresión aberrante y el aumento de MUC4 y MUC16 se produce durante la progresión del cáncer de páncreas a la metástasis [17-19,25]. Recientemente, Mohr et al mostraron expresión miR-200c se redujo en los tejidos tumorales primarios de páncreas en comparación con algunos sitios de metástasis [37]. Estos resultados apoyan la hipótesis general de que las fluctuaciones en el miR-200c contribuyen a la regulación de la expresión de MUC4 y MUC16 durante la progresión tumoral y las metástasis de páncreas.
En conclusión, nuestro estudio presenta la primera evidencia de que MUC4 y MUC16 están regulados a el nivel post-transcripcional de los genes miARN, MIR-200c, que se dirige directamente a MUC4 y MUC16 dentro de sus regiones codificantes de aminoácidos. Estos resultados indican que el miR-200c puede tener un papel inhibitorio en el crecimiento potencial de cáncer de páncreas y metástasis y los estudios adicionales son necesarios para delinear la relación normativa entre las mucinas unidas a la membrana y miR-200c.
Apoyo a la figura Información
S1. El análisis
QRT-PCR de ZEB1. La sobreexpresión de miR-200c redujo significativamente la expresión de ZEB1 en ambos (A) y S2.028 T3M-4 células (B). El aumento en los niveles de transcripción veces más de control de vectores se expresan como media ± S. D. Un valor de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativa
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s001 gratis (EPS)
figura S2. Ensayo de proliferación celular
. S2.028 (A) y T3M-4 (B) (miR-200c y el control de vectores) la proliferación de células a diferentes puntos de tiempo se midieron mediante el ensayo de azul de metileno. De dos vías ANOVA se utilizó para obtener la significación estadística (***, p & lt; 0,001; ns, no significativo)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s002 gratis (EPS)
Figura S3 .
Predicción de miR-200c en los sitios de unión a mucinas. Los sitios potenciales de miR-200C de unión en las mucinas unidas a la membrana (MUC4 y MUC16) transcripciones se identificaron utilizando el servidor web RegRNA MicroARN predictor objetivo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s003
(EPS)
Tabla S1. List de oligonucleótidos utilizados para la expresión de miR-200c y el sistema de ensayo de luciferasa.
doi: 10.1371 /journal.pone.0073356.s004 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. David Kelly para la asistencia técnica de expertos en el ensayo de luciferasa
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