Extracto
Un número creciente de informes han demostrado que diversos microRNAs están implicados en la tumorigénesis y la progresión tumoral. Se realizó este estudio para identificar nuevos miRNAs que pueden estar implicados en el cáncer de pulmón y el estudio de sus funciones. Hemos probado la expresión de 450 miRNAs en los tejidos tumorales de pulmón y los tejidos no cancerosos adyacentes. Se encontró que los genes miARN-545 era menos abundante en tejidos pulmonares cancerosos que en los tejidos no cancerosos adyacentes. Nuestros estudios posteriores mostraron que el miR-545 suprime la proliferación celular
in vitro
y
in vivo
. También se encontró que miR-545 causó la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 y la apoptosis celular inducida en células de cáncer de pulmón por la orientación de ciclina D1 y CDK4 genes. Los efectos de la ciclina D1 y CDK4 abajo regulados por miR-545 fueron similares a los causados por siRNAs de ciclina D1 y CDK4, y la sobreexpresión de ciclina D1 y CDK4 podría abolir la inhibición inducida por miR-545 de la proliferación celular. En conclusión, miR-545 suprime la proliferación celular mediante la inhibición de la expresión de ciclina D1 y CDK4. Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el papel de miR-545 en el desarrollo del cáncer de pulmón e indican la posible aplicación de miR-545 en la terapia del cáncer
Visto:. Du B, Wang Z, X Zhang, Feng S , Wang G, Él J, et al. (2014) microARN-545 suprime la proliferación celular por la orientación ciclina D1 y CDK4 en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (2): e88022. doi: 10.1371 /journal.pone.0088022
Editor: Liang Hu-Qu, Universidad de Sun Yat-sen, China
Recibido: 12 Agosto, 2013; Aceptado: 2 Enero 2014; Publicado: 5 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 30870535 y 90913017), el Proyecto de combinación de la provincia de Guangdong y el Ministerio de Educación (nº 2009B090300080 y 2011B090400478), el Introducido R & amp innovador; D Equipo del Programa de la provincia de Guangdong (n . 201001Y0104789252) y el Programa de China (Nº 2012AA022501 863). Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Shipeng Feng es empleado de Guangzhou RiboBioCo, Ltd. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes que son aproximadamente 22 nucleótidos de longitud [1], [2], y miRNAs pueden suprimir la expresión de genes postranscripcional mediante la unión a las regiones 3 'no traducidas (3'UTRs) de mRNAs, que induce la traslación inhibición o ARNm diana degradación [3].
ciclina D1 y CDK4 trabajan juntos en el mismo complejo de regular el /la transición del ciclo celular G1 S. Estudios anteriores han demostrado que la ciclina D1 y CDK4 son más abundantes en los tejidos de tumor de pulmón que en los tejidos pulmonares normales [4], [5]. Un creciente cuerpo de evidencia apoya un papel central para la ciclina D1 y CDK4 en la promoción de la proliferación de células cancerosas. Oliver et al. informaron ciclina D1 como un "elemento fundamental" de la transformación maligna en el cáncer de pulmón [6]. Por consiguiente, el silenciamiento de ciclina D1 con oligonucleótidos antisentido puede inhibir la proliferación de no pequeñas células de cáncer de pulmón de células [7]. Estos estudios indican que la ciclina D1 y CDK4 pueden ser genes importantes para la proliferación de células de cáncer de pulmón.
miRNAs están involucrados en la proliferación celular [8], la diferenciación [9], y la apoptosis [10], y la expresión de los genes miARN aberrante es vinculada a la formación de tumores y la progresión [11] - [14]. Muchos estudios han demostrado que miRNAs pueden funcionar como oncogenes o genes supresores de tumores en el cáncer de pulmón. Por ejemplo, el grupo de miR-17-92 se sobreexpresa en células de cáncer de pulmón y promueve la proliferación celular en una línea celular de cáncer de pulmón [15]. Por otra parte, los oligonucleótidos antisentido complementarios a miR-17-5p y miR-20a, que son miembros de la agrupación de miR-17-92, pueden inducir la apoptosis de las células [16]. Sin embargo, let-7 funciones miARN como un gen supresor de tumor en el cáncer de pulmón y es menos abundante en las células de cáncer de pulmón que en las células pulmonares normales [17]. La sobreexpresión de let-7 suprime el crecimiento celular en varias líneas de cáncer de pulmón de células y xenoinjertos en ratones inmunodeficientes [18]. miR-34a es otro importante supresor de tumores de miARN. miR-34a se underexpressed en los tejidos tumorales primarios de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) en comparación con los tejidos normales emparejados [19]. Además miR-34a puede inhibir la proliferación de células NSCLC [20]. miR-210 se sobreexpresa en fases avanzadas de NSCLC y participa en la alteración de la viabilidad celular en la línea celular A549 de adenocarcinoma de pulmón [21]. nivel de miR-23 es elevado en los sueros de pacientes con CPNM en comparación con los de sujetos sanos [22]. Estos informes revelan que varios miRNAs están involucrados en la regulación de cáncer de pulmón.
El objetivo de este estudio fue identificar nuevos miRNAs asociados con el cáncer de pulmón y para dilucidar sus funciones. Hemos utilizado ensayos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) para estudiar el perfil de miARN en el cáncer de pulmón, y los resultados revelaron que el miR-545 se underexpressed en los tejidos tumorales de pulmón en comparación con los tejidos del pulmón no cancerosas adyacentes. Encontramos que el miR-545 suprime la proliferación celular apuntando directamente ciclina D1 y CDK4 genes en líneas celulares de cáncer de pulmón. Nuestros resultados indican que el miR-545 funciona como un supresor tumoral en el cáncer de pulmón.
Resultados
miR-545 se encuentra disminuida en cáncer de pulmón humano tejidos
Se comparó la expresión de 450 miRNAs entre los tejidos de cáncer de pulmón y los tejidos del pulmón no cancerosas adyacentes de 15 pacientes, y se encontró que 31 miRNAs se underexpressed (P & lt; 0,05, veces el cambio y lt; 0,5) en los tejidos de cáncer de pulmón en comparación con los tejidos del pulmón no cancerosas adyacentes (Fig . S1, Mesa de S1 y S2).
Para confirmar la expresión de miR-545, probamos el miR-545 expresión en otros 10 pacientes. Encontramos que el miR-545 niveles en tejidos de cáncer de pulmón eran menos del 50% de los que están en los tejidos del pulmón no cancerosas adyacentes en 14 de los 25 pacientes, mientras que el miR-545 niveles en tejidos de cáncer de pulmón eran más del doble de las de no adyacentes tejidos cancerosos de pulmón en 2 de los 25 pacientes (Fig. 1a). El análisis de varios conjuntos de tejidos pulmonares no canceroso cancerosas y adyacentes comparables indicó que miR-545 fue menos abundante en tejidos de cáncer de pulmón que en los tejidos no cancerosos adyacentes (Fig. 1B). Esto sugiere que miR-545 se underexpressed en tumores de pulmón y podría funcionar como un supresor de tumores
.
(a) relativa miR-545 expresión en 25 tejidos tumorales de cáncer de pulmón emparejados y tejidos no cancerosos adyacentes. (B) La expresión de miR-545 en tejidos de cáncer de pulmón en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes. 5S rRNA se utilizó como control interno. Los datos fueron analizados utilizando el método 2
-ΔΔCt. *, P & lt;. 0.05 (prueba de Wilcoxon) guía empresas
miR-545 inhibe la proliferación celular in vitro e in vivo
Para identificar miRNAs que podrían estar involucradas en la proliferación celular, se utilizó el CCK-8 kit para estudiar la viabilidad de las células A549 transfectadas con cada uno de los 31 miRNAs. Hemos encontrado que las células A549 transfectadas con miR-545 tenían la viabilidad celular más baja (Fig. 2).
viabilidad de las células A549 se midió por CCK-8 a las 72 h después de la transfección con cada uno de los genes miARN. Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. Carolina del Norte, control sin diana; *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0.01 (prueba de la t de Student)
Para confirmar que el miR-545 se puede suprimir la proliferación celular, se realizó el ensayo de viabilidad celular con tres líneas celulares. células A549 y H460 transfectadas con miR-545 imita mostraron menor viabilidad celular de las transfectadas con un control sin diana (Figura 3A y 3B.); sin embargo, HFL1 fibroblastos de pulmón transfectadas con un inhibidor de miR-545 mostraron una proliferación celular más eficiente en comparación con las transfectadas con un inhibidor de control (Fig. 3C).
transfección con miR-545 imita suprime la viabilidad de (a ) células A549 y (b) las células H460. (C) transfección con un inhibidor de miR-545 aumenta la viabilidad de las células HFL1. imágenes (d) del tumor en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo. (e) Los volúmenes y (f) los pesos de los tumores en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0.01 (prueba de la t de Student)
A continuación utiliza un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón para probar el efecto de miR-545 en la progresión tumoral. Las células A549 fueron pre-tratadas con miR-545 imita o un control sin diana y posteriormente se inyectaron en ratones desnudos atímicos. El volumen del tumor en los ratones que recibieron células pre-tratadas con miR-545 imita fue significativamente (P & lt; 0,05) menor que en los ratones que recibieron las células tratadas con un control sin diana. Estas diferencias se observaron en el volumen y peso en los tumores recogidos de ratones sacrificados en el día 48 (Fig. 3D, 3E y 3F). Los resultados muestran que miR-545 puede inhibir significativamente el crecimiento de células de cáncer de pulmón en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo.
miR-545 induce la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 Fase
Un ensayo EdU revelaron que tanto las células A549 y H460 transfectadas con miR-545 imita incorporan menos EdU que las transfectadas con un control sin diana (Fig. 4A-C). En contraste, las células transfectadas HFL1 con el inhibidor de miR-545 incorporado más EdU que las transfectadas con el inhibidor de control (Fig. 4D). Estos resultados sugieren que miR-545 puede inhibir la síntesis de ADN. Para investigar más el mecanismo de regulación (s) de miR-545, se realizó un ensayo de ciclo celular. Una mayor proporción de A549 y H460 transfectadas con miR-545 imita estaban en la fase G0 /G1 en comparación con las transfectadas con un control sin diana (Fig. 4E y 4F). Por el contrario, una proporción más pequeña de las células transfectadas con un HFL1 miR-545 inhibidor estaban en la fase G0 /G1 en comparación con las transfectadas con un control inhibidor anti-miARN (Fig. 4G). Estos resultados demuestran que miR-545 detiene el ciclo celular en la fase G0 /G1, inhibiendo así la síntesis de ADN y la proliferación celular. Por otra parte, se encontró que miR-545 indujo apoptosis de las células y la muerte en A549 y células H460 (Fig. 4H y 4I).
(a) EdU incorporación en las células A549 medidos por microscopía láser confocal. La transfección con el miR-545 inhibe la síntesis de ADN en (b) células A549 y (c) las células H460. (D) La transfección de células HFL1 con inhibidor de miR-545 aumenta la síntesis de ADN. La transfección con miR-545 aumenta el porcentaje de células en la fase G0 /G1 en (e) células A549 y (f) células H460 (g) Transfección de células HFL1 con miR-545 reduce el porcentaje de células en la fase G0 /G1 . miR-545 induce la apoptosis en las células (H) A549 y (i) H460. Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. Carolina del Norte, no-miARN objetivo de control; *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0.01 (prueba de la t de Student)
miR-545 se dirige directamente a la ciclina D1 y CDK4
Se utilizó el software TargetScan para predecir los posibles objetivos de miR-545 . Entre cientos de objetivos previsto, elegimos CASP8AP2, DDX58, ciclina D1, MAF, CDK4 y PRKCE como los supuestos objetivos, ya que podrían estar involucrados en el ciclo celular o apoptosis. Hemos clonado los 3'UTRs de estos genes en el plásmido pmirGlo y examinamos si miR-545 puede suprimir la expresión de estos genes por el ensayo de luciferasa. El ensayo de luciferasa mostró que miR-545 imita inhibieron la actividad de dos construcciones de reportero que contenían el 3'UTR de cualquiera de ciclina D1 o CDK4 (Fig. 5A). Por otra parte, para comprobar si la ciclina D1 y CDK4 son blancos directos de miR-545, la mutación de sitio de unión predicha de miR-545 en la 3'UTRs de ambos genes. Se encontró que el miR-545 no inhibió la actividad de reportero construcciones que contenían los 3'UTRs mutantes (Fig. 5B).
(a) miR-545 inhibió la actividad de la luciferasa que contiene la UTR 3 'de la ciclina D1 o gen CDK4. plásmidos que contienen pmirGlo de tipo salvaje (WT) 3'UTRs del CASP8AP2, DDX58, ciclina D1, MAF, CDK4, o gen PRKCE se co-transfectaron en células A549 con los miARN de control o miR-545. La actividad de luciferasa se midió 48 h después de la transfección. El índice normalizado de la actividad luciferasa se calculó como (Rluc
miR-545 /Luc
miR-545) /(Rluc
Carolina del Norte /Luc
Carolina del Norte). (B) miR-545 no inhibió la actividad de los constructos de luciferasa que contienen el mutado (Mut) 3'UTR de la ciclina D1 o gen CDK4. (C) La abundancia de ciclina D1 y CDK4 proteínas se analizaron en A549, células H460, y HFL1 por Western Blot después de los tratamientos de transfección. (D) Los niveles de ciclina D1 y CDK4 proteínas se cuantificaron utilizando el software ImageJ. β-actina se utilizó como control interno. Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001 (prueba de la t de Student)
También examinó la expresión de la ciclina D1 genes endógenos y CDK4 tanto en el mRNA y los niveles de proteína.. Se encontró que el miR-545 redujo el nivel de CDK4 mRNA en células A549, pero no afectó el nivel de ciclina D1 mRNA (Fig. S2). Sin embargo, se observó que las células A549 y H460 transfectadas con miR-545 tenían niveles más bajos de ambos de ciclina D1 y CDK4 proteínas que las transfectadas con un control sin diana (Fig. 5C y 5D). Además, las células transfectadas con HFL1 inhibidor de miR-545 tenían niveles más altos de ambas de ciclina D1 y CDK4 proteínas que las transfectadas con inhibidores de la NC (Fig. 5C y 5D).
miR-545 suprime la proliferación del tumor por la orientación Ciclina D1 y cdk4
para examinar si el miR-545 inhibe la viabilidad celular por la orientación ciclina D1 y CDK4, hemos utilizado los siRNA para inhibir la expresión de ciclina D1 y CDK4 genes; los resultados fueron similares a los descritos anteriormente para miR-545. Por ejemplo, el uso de siRNAs para silenciar o bien ciclina D1 o CDK4 redujo la viabilidad de las células A549 (Fig. 6A). La supresión de ARNsi mediada de la ciclina D1 y CDK4 genes causó la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 (Fig. 6B), inhibido EdU incorporación (Fig. 6C y 6D) y la apoptosis inducida en células A549 (Fig. 6E). Además, la sobreexpresión de ciclina D1 y /o genes CDK4 podría derogar significativamente la inhibición inducida por el miR-545 de crecimiento de las células A549 (Fig. 6F). Tomados en conjunto, estos resultados revelan que las ciclinas D1 y CDK4 genes son blancos directos de miR-545.
(a) miR-545 imita y siRNAs viabilidad celular A549 inhibido a las 72 h después de la transfección. (B) El ciclo celular detenido en la fase G0 /G1 después de la transfección de las células A549 con miR-545 y la orientación siRNAs ciclina D1 y CDK4. miR-545 y siRNA inducen la inhibición de la síntesis de ADN tal como se determina por el ensayo de incorporación de EdU usando (c) la microscopía láser confocal y (d) la citometría de flujo. (E) subexpresión de la ciclina D1 y CDK4 induce la apoptosis celular en células A549. (F) La sobreexpresión de ciclina D1 y CDK4 suprime la inhibición causada por el miR-545. Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001. Se utilizó la prueba t de Student para (a) - (e); un modelo lineal se utilizó para (f).
Discusión
Nuestro estudio muestra que el miR-545 se underexpressed en tumores de cáncer de pulmón, y miR-545 se ha informado de que se underexpressed en el carcinoma gástrico [23]. Por otra parte, el miR-545 inhibe la proliferación de células de cáncer de pulmón, tanto
in vitro
y
in vivo
. Estos resultados indican miR-545 podría funcionar como un supresor tumoral en el cáncer de pulmón.
Más investigación revela que la ciclina D1 y CDK4 genes son blancos directos de miR-545. miR-545 inhibe la ciclina D1 y la expresión génica mediante el reconocimiento de CDK4 secuencias en sus 3'UTRs. Por otra parte, la sobreexpresión de ciclina D1 y CDK4 puede suprimir la inhibición de la proliferación causada por el miR-545 imita. Estos datos sugieren que miR-545 inhibe la proliferación celular por la orientación directamente ciclina D1 y CDK4. Estudios anteriores indican que la expresión de la ciclina D1 y CDK4 en tejidos de cáncer de pulmón humano es sustancialmente mayor que en los tejidos pulmonares normales [7], [8]. Nuestros resultados indican que la sobreexpresión de ciclina D1 y CDK4 en tejidos de cáncer de pulmón puede resultar en parte de la disminución en la expresión de miR-545.
En conclusión, los resultados de perfiles de miARN muestran que el miR-545 es menos abundante en el cáncer de pulmón humano tejidos que en los tejidos del pulmón no cancerosas adyacentes. miR-545 inhibe la proliferación de células de cáncer de pulmón mediante la represión de la expresión de ciclina D1 y CDK4 genes. Una mejor comprensión de miR-545 desregulación en células de cáncer de pulmón contribuye a nuestra comprensión de los mecanismos moleculares responsables del cáncer de pulmón. Por otra parte, el miR-545 podría ser un objetivo potencial para el tratamiento terapéutico del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, y todos protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la primer hospital Afiliado de Guangzhou Medical College. Todos los materiales humanos se utilizan de acuerdo con las políticas de la Junta de Revisión Institucional. La propuesta de estudio en animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Instituto de Guangzhou de la Biomedicina y Salud (IACUC 2.012.010). Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas institucionales para los experimentos con animales.
Líneas Celulares
El pulmón humano cáncer de líneas de células A549 (ATCC) y NCI-H460 (H460, ATCC) se obtuvieron del Laboratorio del Dr. Duanqing Pei en los Institutos de Guangzhou de la Biomedicina y Salud y se cultivaron en medio RPMI-1640 (1640, Gibco, NY, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone, UT, EE.UU.). La línea normal de las células de fibroblastos de pulmón HFL1 se adquirió de la Academia de Ciencias de China Banco de Células de Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, China) y se cultivó en medio F-12K (Jinuo, Hangzhou, China) suplementado con 10% de SFB. Todas las células se cultivaron en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
Las muestras de tejido obtenidas de los pacientes de cáncer de pulmón
Las dos muestras de tejido pulmonar no cancerosa cancerosas y adyacentes se obtuvieron del Instituto de Guangzhou de Enfermedades respiratorias, que se asocia con el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Guangzhou (Guangzhou, china). Quirúrgicamente muestras retiradas se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Las características relevantes de los sujetos estudiados se muestran en la Tabla S3.
La transfección
Todos los siRNAs, imita miARN, e inhibidores de miRNA se adquirieron de Guangzhou RiboBio (RiboBio, Guangzhou, China) y se transfectaron en células usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies, CA, EE.UU.) según lo recomendado por el fabricante. Las células fueron transfectadas con imita e inhibidores de miARN a una concentración de 50 nM. Las secuencias de siRNAs son las siguientes: si-ciclina D1 sentido, 5'-UGG AAU AGC UUC UGG AAU UdTdT-3 ', antisentido, 3'-dTdAA CCU UAU CGA AGA CCU UAA-5'; sentido si-CDK4, 5'-CAG CCG AAA CGA UCA AGG AdTdT-3 ', antisentido, 3'-dTdTG UCG GCU UUG CUA GUU CCU-5'.
Ensayo de proliferación celular
la proliferación celular se midió usando el kit Cell Counting 8 reactivo (CCK-8, DOJINDO, Kyushu, Japón) o reactivo CellTiter-Glo (Promega, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
EdU Ensayo de proliferación celular
Incorporación del análogo de timidina 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU) en el ADN durante la replicación del ADN se puede utilizar para medir las células sometidas a la replicación del ADN. El porcentaje de células que incorporan EdU se evaluó utilizando la imagen de EdU Cell-Luz detectar kit siguiendo las instrucciones del fabricante (RiboBio, Guangzhou, China).
Ciclo Celular Ensayo
Las células se recogieron 72 h después transfección y alojamiento fija en el 70% de etanol enfriado con hielo. Después de la fijación, las células se trataron con 500 ng /l de RNasa A durante 30 min y posteriormente se tiñeron con 50 ng /l de yoduro de propidio (PI) para 20 min. Las células se cuantificaron utilizando células activadas por fluorescencia (FACS, BD, Nueva Jersey, EE.UU.), y los datos se analizaron mediante el software FlowJo (Árbol Star, OR, EE.UU.).
apoptosis de las células de ensayo
análisis de la apoptosis celular se realizó con el kit de detección de PE Anexina V apoptosis I (BD, NJ, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se analizaron las células mediante FACS (BD, Nueva Jersey, EE.UU.).
ARN extracción y QRT-PCR
ARN total fue extraído de las líneas celulares y muestras de tejidos utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. Síntesis de cDNA utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega, WI, EE.UU.) se realizó como se sugiere por el fabricante, y se utilizaron cebadores aleatorios (Takara, Shiga, Japón) para el ARNm. Los ensayos de QRT-PCR se realizaron con el kit SYBR Green RealMasterMix (Tiangen, Beijing, China) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa y QRT-PCR para los genes miARN se realizaron con el miARN QRT-PCR Primer Set Bulge-Loop (RiboBio, Guangzhou, China). El análisis de datos se realizó utilizando el 2
-ΔΔCt método [24]. Los siguientes cebadores se utilizaron para el análisis: la ciclina D1 cebador directo, 5'-CAA ATG GAG CTG CTC CTG GTG-3 ', cebador inverso, 5'-CTT CGA TCT GCT CCT GGC AGG-3'; CDK4 cebador directo, 5'-TGC AAC TTG CAT CGT TCA CCG AG-3 ', cebador inverso, 5'-TGC CCA ACT GGT CGG CTT CA-3'; actina cebador directo, 5'-CAT CTC CTC CCT GGC GCT GT-3 ', cebador inverso, 5'-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3'; y 5S rRNA cebador directo, 5'-ACG GCC ATA CCA CCC TGA AC-3 ', cebador inverso, 5'-GGC GGT CTC CCA TCC AAG TA-3'.
Construcción de plásmidos
los 3'UTRs de ciclina D1 y CDK4 genes fueron clonados en el plásmido pmirGlo (Promega, WI, EE.UU.) entre el
Xho I y
Xba I
sitios utilizando los siguientes cebadores: ciclina D1 de tipo salvaje 3'UTR cebador directo, 5'-ATA TCT CGA GCA GGT GCT CCC CTG ACA GTC CCT-3 ', cebador inverso, 5'-TAA AGA TCT TGG AAA CAT CCG GGT TAC ATG TTG GT-3'; CDK4 de tipo salvaje 3'UTR cebador directo, 5'-ATA TCT CGA GGC AAT GGA GTG TCG GCC ATG GAA-3 ', el cebador inverso, 5'-TAA AGA TCT TTG ACA CAG AGT CTT GCT CTG TTG CCC A-3' .
los plásmidos que contienen pmirGlo mutado ciclina D1 o CDK4 3'UTR se construyeron utilizando la KOD-plus mutagénesis kit (Toyobo, Osaka, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
la lectura abierto expresión de vectores marco pReceiver_M02_cyclin D1, pReceiver_M02_CDK4, y los pReceiver_M02 vector de control fueron adquiridos de la FulenGen Corporation (GeneCopoeia, MD, EE.UU.). Todas las secuencias insertadas o mutadas se confirmaron por secuenciación.
Dual-Luciferase Assay
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos 1 día antes de la transfección. Los imita miARN (50 nM) y plásmido (5 ng /l) se co-transfectaron en células A549. A las 48 h después de la transfección, se midió la actividad de luciferasa usando el Glo Dual-kit de ensayo de luciferasa (Promega, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
fueron cosechadas Western Blotting
Las células y se resuspendió en tampón SDS (Beyotime, Shanghai, china) para la preparación de extractos de proteína total. Brevemente, el extracto de proteína total se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12% y se transfirieron a un Immobilon-P membrana de transferencia de fluoruro de polivinilideno (Millipore, MA, EE.UU.). La membrana se incubó a temperatura ambiente en 5% de albúmina de suero bovino (BSA) preparados con tampón TBS-T durante 2 h. La membrana se incubó con anticuerpo primario diluido 1:1,000 con 1% de BSA a 4 ° C durante la noche. Al día siguiente, la membrana se incubó con secundario peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo diluido 1:5,000 con 1% de BSA a 4 ° C durante 6 h. La membrana se visualizó después de la incubación en el sustrato de HRP (BeyoECL además de A /B, Beyotime, Shanghai, China). Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron anti-ciclina D1 (sc-8396, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-CDK4 (sc-260, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-β-actina (A2066, Sigma, MO, EE.UU.), conjugado con HRP anti-ratón IgG (sc-2005, Santa Cruz, CA, EE.UU.), y HRP-conjugado anti-IgG de conejo (sc-2004, Santa Cruz, CA, EE.UU.).
tumorales
a las 6 horas después de la transfección de miR-545 imita o controlar miARN, se recogieron las células A549 y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 1 × 10
6 células /ml y se inyectado en cualquiera de los lados del flanco posterior de la misma /c atímicos ratones desnudos BALB (5-6 semanas de edad) con 100 l de suspensión celular. El crecimiento del tumor se midió cada 4 días. El volumen del tumor (V) se controló mediante la medición de la longitud (L) y el ancho (W) del tumor con calibradores y se calculó utilizando la fórmula V = (L x W
2) /2 [25].
Análisis
estadística
los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD). P & lt; 0,05 se consideró significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 16.0 (Chicago, IL). Se utilizó la prueba de la t de Student para analizar la significación entre los dos grupos. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) fue utilizado para probar la significación entre más de dos grupos. El análisis de la expresión de miRNAs en la muestra clínica se realizó mediante el test de Wilcoxon.
Apoyo a la Información
Figura S1. Mirna expresión
en tejidos de cáncer de pulmón y los tejidos no cancerosos adyacentes. Las expresiones de miRNAs se miden con QRT-PCR. 5S rRNA se utilizó como control interno. El mapa de calor representa la sobreexpresión (rojo) y disminución en la expresión (verde) de miRNAs. los datos que faltan se representa con el color gris
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s001 gratis (TIF)
figura S2.
ciclina D1 y CDK4 ARNm se midieron mediante qRT-PCR. β-actina se utilizó como control interno. Los datos se presentan como media ± S.D. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001 (prueba de la t de Student)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s002 gratis (TIF)
Tabla S1. .
La expresión de miRNAs en el tejido de cáncer de pulmón y los tejidos del pulmón no cancerosas
doi: 10.1371 /journal.pone.0088022.s003 gratis (DOC) sobre Table S2.
expresión relativa de 450 miRNAs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s004 gratis (XLS) sobre Table S3.
Las características de los pacientes con cáncer de pulmón clínicos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s005 gratis (DOC)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos con el Dr. Pei Duaquing por el don de las líneas celulares A549 y H460.