Extracto
motilidad de las células del cáncer dependiente de calcio es la regulación de un fenómeno clave de la invasión y la metástasis. Quinasa de adhesión focal (FAK) juega un papel importante en la adhesión celular y la metástasis de varios tipos de cáncer. La relación entre la suplementación dietética de cáncer de calcio y de colon ha sido ampliamente investigado. Sin embargo, el efecto de la suplementación de calcio en la calpaína-FAK-motilidad (Ca
2 +) no se entiende claramente. Hemos tratado de identificar el mecanismo de la FAK hendidura a través de Ca
2 + lactato unido (CALA), su señalización aguas abajo y su papel en la motilidad de las células de cáncer de colon humano. Se encontró que el tratamiento de células HCT116 y HT-29 con CaLa aumentaron inmediatamente la intracelular de Ca
2 + (ICA
2 +) los niveles durante un período prolongado de tiempo. Ca
2 + afluencia inducida por la escisión de FAK FAK en un N-terminal (dominio FERM) de una manera dependiente de la dosis. Fosforilada FAK (p-FAK) también se escindió en su p-N-terminal de FAK. CaLa aumentó las células de cáncer de colon motilidad. Calpeptina, un inhibidor de la calpaína, invirtió los efectos de Cala de FAK y la escisión pFAK en ambas líneas celulares de cáncer. La FAK escindido se transloca en el núcleo y modula la estabilidad de p53 a través de la ubiquitinación MDM2-asociado. inducida-Cala Ca
2 + afluencia aumenta la motilidad de las células de cáncer de colon fue mediado por la actividad calpaína través de FAK y pFAK desestabilización de la proteína. En conclusión, estos resultados sugieren que una cuidadosa consideración puede ser dada en la decisión de la dieta Ca
2 + suplementación al paciente sometido a tratamiento para el cáncer metastásico
Visto:. Sundaramoorthy P, Sim JJ, Jang YS, Mishra SK, Jeong KY, Mander P, et al. (2015) modulación de los niveles de calcio intracelular de lactato de calcio afecta Colon Cancer Cell motilidad través de calpaína dependiente del calcio. PLoS ONE 10 (1): e0116984. doi: 10.1371 /journal.pone.0116984
Editor Académico: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 31 de julio de 2014; Aceptado: 17 de diciembre de 2014; Publicado: 28 Enero 2015
Derechos de Autor © 2015 Sundaramoorthy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Gachon Instituto de Investigación Farmacéutica Fondo de Ciencias de 2013, la Universidad de Gachon, República de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Declaran existen los autores intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es la tercera causa de muerte por cáncer en todo el mundo, lo que representa más de 600.000 muertes cada año con aumento de la incidencia. La inducción carcinogénica en el colon se produce a través de una secuencia de eventos que conducen a la metástasis implica varias proteínas oncogénicas. Quinasa de adhesión focal (FAK) desempeña un papel crítico en la progresión del cáncer de colon y es un importante proteína oncogénica implicado en la proliferación celular, la supervivencia y la motilidad [1,2]. La calpaína es una proteasa cisteína bien conservado activado por el aumento intracelular de Ca
2 + (ICA
2 +). Se localiza en la adhesión focal, y potencialmente induce la escisión de las proteínas de adhesión focal. Comparativamente, los tumores metastásicos contienen altos niveles de calpaína que los tumores no metastásicos. La calpaína mediada por la degradación de FAK es crítica para la motilidad en células de cáncer de colon humano [3]. Parece ser que la función de la calpaína en la adhesión celular y la motilidad limita su capacidad para escindir componentes de complejos de coordinación, que a su vez puede aumentar el volumen de negocios adherencia y la progresión tumoral funcionalmente importantes [4,5].
La ACI
2 + ion es una importante molécula de señalización que modula numerosos procesos celulares en la fisiología cáncer, incluyendo la motilidad celular. La ACI
2 + se mantiene a una concentración baja (~ 100 nm) en comparación con el extracelular libre de Ca
2 + (1,2 mM) [6,7]. Los bajos niveles de citoplasmática de Ca
2 + se mantienen a través de una salida activa de las células a través de la membrana plasmática de Ca
2 + ATPasa de la bomba, mientras reticular sarcoendoplasmic Ca
2 + ATPasa elimina Ca
2 + por intercambio de protones . Otros Ca
2 + canales permeables tales como los canales de calcio operados por receptores de almacenado, canales de potencial transitorio (TRP) y la proteína del canal de liberación de calcio activado (CRAC) 1 también están involucrados en la ACI
2 + homeostasis. Remodelación o desregulación de Ica
2 + homeostasis en células de cáncer provoca cambios en la progresión del cáncer [8]. La suplementación dietética de Ca
2 + se sabe que reduce el riesgo de adenomas colorrectales y cáncer [9]. Sin embargo, el impacto de Ca
2 + suplementación de la dieta sigue siendo desconocida en la metástasis del cáncer.
Las células normales tienen una baja concentración de lactato extracelular que oscila entre 0,5 y 2 mm, pero la concentración de las células cancerosas pueden ser tan de hasta 30-40 mm [10]. supervivencia de las células del cáncer requiere de un ambiente intracelular alcalina y ácida medio extracelular [11,12]. transportadores de monocarboxilato (MCT) controlan principalmente el movimiento de intracelular y extracelular ácido láctico [13]. Los niveles elevados de MCT1 se han detectado en mama, colon, gástrico y cáncer de cuello uterino. expresión MCT4 es muy elevado en los cánceres de carcinoma, de cuello uterino y de próstata renales [14]. MCT4 libera lactato en respuesta a la hipoxia, mientras que la captación de lactato en las células tumorales oxigenadas se produce a través MCT1 [15,16]. Lactato actúa como un sustrato para el metabolismo oxidativo en las células tumorales oxigenadas.
En base a la información sobre Ca
2 + suplementación de la dieta en el cáncer metastásico, se determinó la motilidad de las células de cáncer de colon mediante la exposición directa de Ca
2 + atado (CALA). Nos centramos en la vía de las células FAK calpaína para comprender los mecanismos moleculares subyacentes de colon humano motilidad de las células del cáncer.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células
Todas las líneas celulares eran comprado de la American Type Culture Collection (Manassa, VA). cáncer de colon humano líneas de células HCT116, HT-29, y DLD1were cultivaron en medio RPMI 1640. línea de células de colon normal CCD-18Co se cultivó en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina en una atmósfera humidificada a 37 ° C que contiene 5% de CO
2.
Reactivos y anticuerpos
Cala, inhibidor de FAK (TAE226), inhibidor de la calpaína (calpeptina), gripe-03 a.m. fue comprado a Sigma (St. Louis, MO). Los anticuerpos primarios utilizados para el análisis de transferencia Western (FAK, pFAK, calpaína-2, p53, MDM2, pMDM2, α-tubulina, Lamin B, GADPH) y los correspondientes anticuerpos secundarios se adquirieron de Cell Signaling Technology (EE.UU.).
Termodinámica de ión metálico divalente de unión a ácido láctico
para medir las isotermas de unión para la interacción del metal bivalente de iones Ca
2 + en ácido láctico, calorimetría de titulación isotérmica (ITC) los experimentos se realizaron utilizando una Microcal 200 de titulación isotérmica microcalorımetro (Microcal, Inc., Northampton, MA). La recogida de datos, análisis, y el trazado se realizaron con el paquete de software de origen basado en Windows (versión 7.0; suministrado por Microcal). El microcalorımetro de valoración contenía células de la muestra y de referencia en posesión de un recinto adiabático. La celda de referencia se llenó con agua destilada. titulaciones típicos involucrados inyección de 1,5 l de 5 mM de Ca
2 + ion (utilizando un inyector controlado por ordenador) en la celda de muestra (lleno de 0,5 mM de ácido láctico a pH 7,0). Las muestras se inyectaron a intervalos de 2 minutos para asegurar que las curvas de valoración habían vuelto a la línea base antes de la siguiente inyección. La velocidad de agitación de la jeringa se fijó a 1.000 rpm. La absorción o liberación de calor durante cada inyección se midió utilizando el calorímetro. isotermas de titulación para las interacciones de unión que comprenden el calor diferencial de los flujos de las diferentes inyecciones. Estos valores fueron integrados para determinar el cambio de entalpía asociada con cada inyección. cambios de calor causada por la inyección de cada ion metálico en agua destilada fueron insignificantes. Los datos de dilución se restará de los datos de la muestra y los puntos de datos malos fueron eliminados. El ajuste de datos se realizó utilizando el software de Origen (versión 7.0) y el proceso de adaptación se tituló hasta que se obtuvo el mejor ajuste determinado por el método de minimización de chi-cuadrado. Montaje de las isotermas de unión de esta manera los datos proporcionados en la constante de unión (Ka), el cambio de entalpía (H), y la estequiometría de unión (N). La unión energía libre de Gibbs (? G) se calcula a partir del cambio de entalpía (H) y la constante de unión (Ka) usando la ecuación:? G = = RTlnKa ΔHTΔS, donde R es la constante de los gases y T es la absoluta la temperatura en grados Kelvin [17]. Mientras tanto, de la estequiometría (n) de las diferentes interacciones se determina a partir del Uno conjunto de sitios de modelos.
Medición de Ica
2 + concentración
citosólico libre de Ca
2 + concentraciones de iones se midieron usando un microscopio confocal de escaneo láser (Leica, Heidelberg, Alemania). HCT116 cultivadas y células HT-29 fueron cargados con 10 M Fluo-3 /AM y 1μl 25% de Pluronic F-127 (disuelto en DMSO) y se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C. Después de cargar las sondas de fluorescencia, se añadió 2,5 mM de Cala y la imagen fue adquirida. Fluo-3 /AM fue excitado a 488 nm y la fluorescencia emitida se midió a 515 nm. Intracelular de Ca
2 + dosis se expresan como cocientes /F0 F, donde F0 es la intensidad de fluorescencia inicial (análisis de software Image J).
cicatrización de heridas ensayo
Para el ensayo de curación de heridas, se utilizó inserción de cultivo ibidi que consiste en dos depósitos separados por una pared de 500 micras de espesor. Las células se sembraron en dos cámaras (100 l de 4 × 10
5 células /ml) ibidi inserto de cultivo. Después de 24 h de incubación, la cámara se retira suavemente la creación de un espacio de ~ 500 micras. Las células se dejaron migrar a las áreas al descubierto durante 6 h. La imágenes de células vivas se realizó utilizando el JuLi Br, analizador de células vivas (NanoEnTek Inc, Corea del Sur).
Western blot
lisados celulares se prepararon y una cantidad igual de proteína se separaron por SDS PAGE y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas como se describe anteriormente [18,19,20]. Los anticuerpos primarios específicos seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP fueron utilizados para la detección de proteínas específicas utilizando el sistema ECL (AbClon) para la detección de la señal.
Análisis de inmunofluorescencia
HCT116 y células HT-29 fueron tratadas con CaLa durante 12 h. Las células se fijaron en etanol al 100% frío durante 20-30 min a-20 ° C, se permeabilizaron con 0,3% Triton X100 en PBS durante 15 min a temperatura ambiente, y se lavaron en serie en PBS. Las células se bloquearon con 3% de suero de caballo en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con PBS. Las células fueron incubadas con el anticuerpo FAK (1: 800) con 3% de suero de caballo en PBS a 4 ° C durante la noche. Las células se lavaron con PBS y posteriormente se incubaron con Alexa-488 anticuerpo secundario conjugado durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron sellados con medio de montaje que contiene DAPI (Vectashield, Vector Laboratories). Las imágenes fueron capturadas utilizando microscopía de escaneo láser confocal (CLSM, Nikon A1 +, Japón).
Los análisis estadísticos
Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD). La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
El ácido láctico se une a los iones de calcio con alta afinidad
Se analizaron las propiedades termodinámicas de Cala e interacciones de unión entre Ca
2 + y ácido láctico mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC). datos ITC representativos relativos a la unión de ácido láctico a Ca
2 + a pH 7,0 se muestra en la Fig. 1. Otros detalles, incluyendo las constantes calculadas de asociación y de entalpía y entropía de las asociaciones se enumeran en la Tabla 1. Los resultados muestran que el ácido láctico se une a Ca
2 + con K
d 6,2 × 10
-5 M, una condición termodinámicamente adecuado para formar la sal Cala. Nuestros cálculos termodinámicos mostraron que una molécula de lactato se une a 0,361 Ca
2 + iones, a pesar de que la molécula de dos lactato se une a uno de Ca
2 + iones en teoría. Los datos de ITC demuestra la posibilidad de que el ácido láctico extracelular en forma de lactato puede formar sal CaLa, que puede existir como una forma soluble bajo la concentración límite de solubilidad acuosa (7,9 g /100 ml). Estos datos también sugieren que CaLa se puede utilizar para administrar el calcio intracelular, que puede disociarse bajo entorno variable.
tres isotermas representativos se muestran que ilustra la unión como una función del pH a 37 ° C. Paneles superior e inferior muestran los resultados de la valoración colorimétrica de 1,5 l de Ca 5 mM
2 + y 0,5 mM mezcla de ácido láctico en 5 mM Tris HCl a pH 7,0. Para cada titulación, los datos brutos se muestran en el panel superior y datos integrados de calor se muestran en el panel inferior.
administración CaLa aumentó iCa
2 + niveles
Se evaluó el efecto de la administración cala situada en células de cáncer de colon y se analizaron los niveles de Ica disociado
2 +. células HCT116 y HT-29 fueron tratadas con 2,5 mM CaLa que mostró una notable diferencia a 0 y 600 segundos en ambas líneas celulares. La validación experimental se llevó a cabo mediante el uso de ionomicina, un ionóforo usado para elevar iCa
2 + niveles. Ionomicina (10 M) aumentó drásticamente iCA
2 + en los primeros segundos, seguido de una disminución gradual en ambas líneas celulares (Fig. 2). Aunque ionomicina planteado iCa
2 + niveles, estos resultados sugieren que ionomicina no es estable en líneas celulares de cáncer de colon. Sin embargo, en las células HCT116, CaLa aumentó gradualmente iCa
2 + a su nivel máximo a 480 segundos y luego se estabilizó (Fig. 2A). células HT-29 llegaron al máximo iCa
2 + concentración entre 50 y 100 segundos, y luego se estabilizaron (Fig. 2B). Estos resultados sugieren que CaLa aumentó iCa
2 + niveles y mantenido esos niveles durante un período prolongado de tiempo.
HCT116 cultivadas (A) y células HT-29 (B) fueron tratados con fluorescencia Fluo-03 a.m. sondas como se describe en materiales y métodos. Las células se incubaron posteriormente con CaLa 2,5 mM y 10 mM ionomicina en DMSO (control). La imagen fue adquirida en un punto de 0 segundos como inicial y 600 segundos como máximo utilizando láser confocal de barrido microscopio (Leica, Heidelberg, Alemania) el tiempo. La imagen de fluorescencia de Ca
2 + se convierte en intensidad de fluorescencia y se representa como el indicado F /F0 (software de análisis de imagen J). F0 es la intensidad inicial de la fluorescencia.
Cala modulada estabilidad FAK
Estudios recientes indican que la sobreexpresión de la FAK oncogén está asociado con la carcinogénesis de diversas células humanas de cáncer [21,22]. La ACI
2 + calpaína activa, que degrada la FAK y mejora la motilidad de las células del cáncer [3,4,5,9]. Habiendo observado que aumenta CaLa iCA
2 + niveles en líneas celulares de cáncer de colon, se investigó el efecto de Cala en la estabilidad de la FAK en estas células. Se examinó la expresión de FAK y pFAK en el colon normal (CCD-18Co) y líneas celulares de cáncer de colon (Fig. 3A). Los resultados mostraron que las células CCD-18Co tienen expresión nominal de FAK y los niveles más bajos de lo tanto pFAK en comparación con líneas celulares de cáncer de colon que expresan altos niveles de FAK y pFAK. Cada línea celular de cáncer de colon mostró diferentes niveles de expresión de FAK y pFAK. células CCD-18Co mostraron un nivel normal de pFAK. células HT-29 y DLD-1 mostraron niveles más altos de pFAK en comparación con HCT116. Por lo tanto, nos centramos en HCT116 y células HT-29 pautas para futuros estudios relacionados con la estabilidad de la proteína FAK. Además, se realizó un análisis dependiente de la dosis para los efectos de Cala en HCT116 y HT-29 células (Fig. 3B). Las células se trataron con diferentes concentraciones de CaLa durante 12 h y se evaluó la FAK escisión. La longitud total de la FAK y pFAK es un 125 kDa. CaLa escinde FAK en un 90 kDa proteína N-FAK (dominio FERM) con concentraciones crecientes que tiene la actividad más alta en 2,5 mM. Del mismo modo, pFAK se escindió en su p-N-FAK en una forma dependiente de la dosis con actividad óptima a 2,5 mM de Cala (Fig. 3B). Estos resultados indican que CaLa desestabiliza FAK y pFAK y causa la escisión de ambas proteínas en células de cáncer de colon
.
(A) expresiones FAK se analizaron en la línea celular epitelial de colon normal CCD-18Co y diferentes líneas de células de cáncer de colon ( HCT116, HT-29 y DLD1). HCT116 y HT-29 (B) fueron tratados con diferentes concentraciones de Cala durante 12 h. Western Blot realizado a partir de lisados de células mostró que CaLa indujo FAK y pFAK la escisión de una manera dependiente de la dosis.
desestabilización mediante la actividad de FAK caplain por Cala
Los estudios recientes indican que la FAK y su forma fosforilada son importantes para la rotación de adhesión focal. FAK es escindido por la calpaína, un Ca
2 + proteasa dependiente, que desempeña un papel fundamental en la dinámica de adhesión focal en células móviles [4]. Calpaína está implicada en varios aspectos clave de la adhesión de células de cáncer, la migración y la metástasis [23]. Desde CaLa aumentó Ca
2 + afluencia y se escindió FAK, lo que determina los efectos de Cala en la calpaína en HCT116 y células HT-29 (Fig. 4). Los resultados muestran que Cala causado la escisión dependiente del tiempo de proteínas FAK y pFAK pero no hubo ningún efecto sobre los niveles de calpaína-2 en ambas líneas celulares. Para confirmar los resultados, se utilizó calpeptina, un activador de Rho quinasa y un inhibidor de la calpaína que es parte de una familia de cisteína proteasas dependientes del calcio. Calpeptina (20 M) invirtió los efectos de Cala de FAK y la escisión pFAK en ambas líneas celulares sin efectos sobre los niveles de proteína calpaína-2 (Fig. 4). Estos datos sugieren que CaLa aumento de Ca
2 + actividad calpaína de afluencia y pero no sus niveles de proteína. Se sabe que escinde FAK media la degradación de p53 a través de la translocación nuclear de N-FAK. Las células tratadas con CaLa mostraron disminución de los niveles de p53, que fue revertido por calpeptina. Calpeptina inhibe la calpaína-2, evitando que la escisión de FAK, la atenuación de la degradación de p53. Estos resultados establecen que la escisión inducida por FAK-cala mejorado la degradación de p53 y calpaína-2 actividad, pero sin efectos en los niveles de proteína calpaína.
HCT116 y las células HT-29 fueron tratadas con CaLa 2,5 mM en combinación con el inhibidor de la calpaína ( calpetin 20 mM) en la forma dependiente del tiempo indicado. Western blot datos demuestran que el inhibidor de la calpaína, calpeptina, reduce la escisión de FAK y pFAK así como la degradación de p53.
escindido FAK transloca núcleo
Los estudios mostraron que la translocación nuclear de la FAK promovido la supervivencia celular a través de la degradación de p53 mejorada en condiciones de estrés celular [24,25]. CaLa inducida escisión de FAK en una proteína de 90-kDa, que se transloca en el núcleo. Higo. 5 representa el análisis de transferencia de Western de todo, citoplasmática y nuclear fracciones de las células tratadas con Cala y su inmunocitoquímica. Todo el lisado de células y la fracción citoplasmática de ambas líneas celulares tratadas con CaLa mostraron FAK y escinden FAK. fracciones nucleares de las células no tratadas tenían niveles bajos de FAK pero el tratamiento con CaLa aumentaron FAK y escinden los niveles de FAK en fracciones nucleares (Fig. 5a). Las translocaciones nucleares de N-FAK en HCT116 y HT-29 (Fig. 5 B y C) se visualizaron después de la incubación con el anticuerpo primario anti-FAK seguido por tinción con Alexa-488 anticuerpo secundario conjugado. La microscopía confocal de células de control mostraron DAPI núcleos teñidos y sin teñido con Alexa-488 FAK. Sin embargo, la imagen confocal de células tratadas-cala mostró translocación de Alexa-488 manchado N-FAK en los núcleos teñidos con DAPI. Estos resultados indican claramente que CaLa mM 2,5 escinde FAK longitud completa que transloca en el núcleo.
Translocación de N-FAK se analizó por transferencia de western (A) e inmunocitoquímica (B-C). células HCT116 y HT-29 fueron la cabeza en una cámara de 8 pocillos y se trataron con CaLa 2,5 mM durante 12 h. La translocación se analizó por microscopía confocal. WE, la extracción de células enteras; CE, la extracción citoplasmática; NE, extracción nuclear; translocado N-FAK se indica mediante una flecha. Barra de escala:. 2,5 M
Cala aumentó la motilidad de las células de cáncer de colon
Desde FAK se sabe que juega un papel crítico en la adhesión, migración, proliferación y diferenciación en células de cáncer [ ,,,0],1,2], se estudiaron los efectos de Cala en estas propiedades celulares en las células de cáncer de colon. Se realizó el ensayo de herida de curación en las células HCT116 tratados con CaLa solo o en combinación con calpeptina (Fig. 6). Los resultados demuestran que CaLa (2,5 mM) aumentó la motilidad de las células HCT116. Calpeptina solo no parecen cambiar la motilidad. Curiosamente, se ha demostrado que la aplicación de calpeptina (20 M) en combinación con CaLa redujo el efecto de Cala y la migración celular inhibida (Fig. 6 A-B). Además, se observó que TAE226 (inhibidor de FAK) disminuyó significativamente la motilidad celular. Estos resultados sugieren que el Ca
2 + afluencia media la degradación de la FAK través de la actividad de la calpaína. TAE226 mostró efectos antitumorales en células de cáncer de colon. Se redujo el tamaño de los tumores diseminados y una supervivencia prolongada en ratones portadores de tumores [26]. Con el fin de confirmar nuestras observaciones, hemos realizado un análisis comparativo de los niveles de FAK y pFAK en HCT116 y HT-29 utilizando TAE226 (Fig. 6C). TAE226 (2,5 M) inhibió la expresión pFAK de una manera dependiente del tiempo no inhibió la FAK total. Cala-inducida FAK y pFAK escisión aumento de la motilidad en comparación con TAE226, que suprime la actividad pFAK y disminución de la motilidad de las células cancerosas.
ensayo de cicatrización de la herida se realizó en las células HCT116. Las células se trataron con CaLa, y la propiedad de cicatrización de heridas se analizó 0-6 h después de la herida (A), y los valores medios de área de la herida se analizaron mediante gráfico de líneas múltiples (B). Las células HCT116 y HT-29 fueron tratados con 2,5 mM de Cala en el tiempo-dependiente inducida FAK y la escisión pFAK (C). inhibidor pFAK (TAE226 2,5 M) redujo los niveles de pFAK como se detectó por Western blot.
escindido con FAK mediada por la degradación de p53 a través de ubiquitinación dependiente MDM2
Los estudios previos indicaron que la estructura de FERM -FAK puede trasladar en el núcleo y modular la estabilidad de la proteína p53 a través de MDM2 [25]. Por lo tanto, se investigó el mecanismo de p53 en la regulación de Cala. CaLa solo indujo la escisión de FAK y pFAK. El tratamiento de MG132 con CaLa recuperó paradójicamente la FAK y pFAK de escisión (Fig. 7). El tratamiento de células con p53 inhibe CaLa niveles mientras MG132 recuperado los niveles de p53. El tratamiento de MG132 en combinación con CaLa recuperó el efecto de Cala en la degradación de p53 proteosomal. Además, se observó que MDM2 y los niveles de proteína PMDM2 no cambiaron por los tratamientos con CaLa, MG132 o ambos. Por lo tanto, estos resultados sugieren que MG132 recuperó p53 de cala a través de la ubiquitinación MDM2-asociado.
HCT116 y las células HT-29 fueron tratadas con CaLa 2,5 mM en combinación con un inhibidor de proteasomal (MG132 10 M) durante 10 h. Western blot se realizó a partir de lisados de células y proteínas se detectaron como se describe en los métodos.
Discusión
Este estudio demuestra que la inducida por el lactato de calcio Ca
2 + afluencia aumenta la motilidad de cáncer de colon células a través de la desestabilización de las proteínas FAK y pFAK. Este estudio demuestra el efecto de Ica
2 + sobre la vía de la motilidad de células-FAK calpaína. la escisión mediada-cala de la FAK y pFAK fue arbitrada través de la actividad de la calpaína, que aumentó la motilidad de las células de cáncer de colon. La FAK escindido transloca en el núcleo y la degradación de p53 mejorada así como la actividad de la calpaína. El efecto de lactato extracelular se informó en varios estudios sobre la motilidad de las células cancerosas. Una diferencia importante entre el presente estudio y en estudios previos sobre el lactato es la entidad química.
Transportadores
monocarboxylate (MCT) generalmente median afluencia de lactato y flujo de salida y que los niveles elevados de MCT1 se han detectado en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon [dieciséis]. liberación de lactato en las células hipóxicas está mediada a través de MCT4, mientras que la captación de lactato en las células tumorales oxigenadas está mediada a través de MCT1 [15,16]. Parece ser que la propia cala está siendo transportado al citoplasma, por lo tanto, el aumento de iCA
2 + y las concentraciones de lactato se observan coincidentemente. Sin embargo, no se ha identificado el mecanismo de transporte específico. Los presentes resultados mostraron que la baja concentración de Cala mediada la motilidad FAK-dependiente en células de cáncer de colon. Estudios anteriores indicaron que el lactato de sodio se utiliza en concentraciones tan altas como 20 mM [10]. Se observó que esta alta gama en los tumores malignos y metastásicos de grandes tamaños. Las altas concentraciones de lactato en los tumores se correlacionaron con una alta incidencia de metástasis a distancia y otros comportamientos malignos de células del cáncer [27]. Por lo tanto, hemos utilizado bajas concentraciones de lactato para evitar la metástasis del cáncer. Por el tratamiento de células con concentraciones bajas de Cala, Ca
2 + afluencia aumentó y se mantuvo durante un período prolongado de tiempo, lo que aumentó la actividad de la calpaína. La calpaína tiol proteasa intracelular cataliza la proteolisis limitada de varias proteínas estructurales y enzimas de adhesión focal de señalización en las células adherentes. Las calpaínas están involucrados en varios aspectos clave de la migración, incluida la adhesión y difusión. La inhibición farmacológica de las calpaínas reduce la migración celular mediada por la integrina [23]. Estudios recientes proporcionan apoyo adicional a la calpaína como un importante modulador de la motilidad celular a través de su capacidad para regular la dinámica de adhesión focal. La calpaína mediada por la degradación de FAK es crítica para la motilidad en células de cáncer de colon humano [3]. Los altos niveles de expresión de FAK se han asociado con un aumento de la invasividad de los tumores malignos. Sin embargo, los mecanismos de activación de FAK, escote, y la desregulación de la motilidad, no están claras. Eventos de señalización corriente abajo de la activación de FAK y la escisión pueden contribuir a la motilidad de células de carcinoma de colon humano.
Cala pueden modular el potencial migratorio de las células tumorales oxigenadas, que existen alrededor de los vasos tumorales. En el tejido tumoral, la vascularización se limita a suministrar oxígeno y nutrientes tales como glucosa y glutamina. tumores hipóxicos parecen estar pobremente diferenciado pero hipoxia juega un papel directo en el mantenimiento de las células madre del cáncer [29]. tumores hipóxicos tienden a producir un gradiente de lactato, que es utilizado por las células tumorales oxigenadas través MCT1 mediada por el transporte, por lo que las células tumorales hipóxicas pueden utilizar la glucosa. Este fenómeno se conoce como el servicio de transporte de lactato intercelular. En consecuencia, se podría suponer que en el entorno extracelular que rodea las células hipóxicas se acumula gradualmente lactato en su forma libre. Sin embargo, las células oxigenadas fueron suministrados por calcio a través de la fuente de sangre, lactato se importó a través de MCT1, la reducción de la concentración de lactato extracelular y su microambiente contiene menos de lactato y en su mayoría unido al calcio [31]. Nuestros resultados implican que las células oxigenadas son menos móviles en comparación con las células hipóxicas y que la metástasis implica células hipóxicas en lugar de células oxigenadas. La existencia y la cantidad de Cala en un microambiente tumoral extracelular podrían ser un factor determinante para la metástasis a través de la modulación de la FAK. Además, CaLa, posiblemente, puede controlar la motilidad celular y el metabolismo energético. La proteína supresora tumoral p53 previene la progresión del cáncer a través de numerosos mecanismos incluyendo la apoptosis y la detención del ciclo celular. Existe un vínculo bien caracterizada entre el metabolismo y la regulación genética de p53, p53, donde regula el equilibrio energético de la célula entre la glucólisis y la fosforilación oxidativa [30,31]. Del mismo modo, nuestros resultados muestran que CaLa puede causar la degradación proteosomal de p53 (Fig. 4) a través de la translocación nuclear de FERM-FAK y ubiquitinación MDM2 mediada por (Fig. 7).
El presente estudio investigó el impacto de suplementario Ca
2 + en los mecanismos moleculares de cáncer de colon metastásico. La importancia de Cala en la modulación de la fisiología de las células del cáncer de colon no se limita a los estudios básicos, sino también tener un impacto en los resultados de nutrición clínica. Ca
2 + juega varios papeles en la progresión del cáncer, incluyendo el aumento de apoptosis o inhibición de la proliferación en el colon. Además, Ca
2 + vinculante a las sales biliares, el aumento en las dietas de alto contenido de grasa, se han asociado con la carcinogénesis de colon [28]. Cala-FAK indujo la escisión y el aumento de la motilidad celular de las células HCT116 crea una suposición de que los pacientes con cáncer de colon metastásico necesitan más cuidado al considerar Ca
2 + suplementación dietética. Puesto que el calcio extracelular puede ser ionizado con lactato, se lleva a Ca
2 + afluencia causando un aumento en la escisión de FAK y la motilidad de las células cancerosas.
Conclusiones
En el presente estudio aclara que CaLa aumento de la motilidad de Las células de cáncer de colon por la actividad de la calpaína través de desestabilizaciones de proteínas FAK y pFAK. La entidad concentración y química de Cala puede ser factor contribuyente para la motilidad de las células del cáncer de colon. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que los efectos de la motilidad en el cáncer de colon pueden estar relacionados con el uso de Ca
2 + suplementación dietética. Incluso una baja concentración de Ca
2 + puede causar aumento de la motilidad celular.