Extracto
La colchicina, un producto natural de
Colchicum autumnae y usados actualmente para el tratamiento de la gota, es un compuesto que inhibe la tubulina objetivo la formación de microtúbulos por atacar a las células que se dividen rápidamente. Esta propiedad tiene orientación tubulina-investigadores principales para investigar el potencial de la colchicina y análogos como posibles terapias contra el cáncer. Un importante estudio realizado sobre un análogo de alocolchicina, ZD 6126, se detuvo en la fase 2 de ensayos clínicos debido a una grave cardio-toxicidad asociada con el tratamiento. Este estudio consiste en el desarrollo y ensayo de nuevos análogos de alocolchicina que tienen propiedades anti-cáncer no es tóxico. Actualmente hemos sintetizado y evaluado las actividades contra el cáncer de dos análogos; N-acetil-O-methylcolchinol (NSC 51046 o SNEM), que es estructuralmente similar a ZD 6126, y (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1), que es una nuevo derivado de alocolchicina que es isómera en el anillo a. NSC 51046 se encontró que era no selectivo, ya que induce apoptosis en células de cáncer de páncreas BxPC-3 y PANC-1 y en los fibroblastos humanos normales. Curiosamente, encontramos que Green 1 fue capaz de inducir la autofagia modestamente pro-muerte en estas células de cáncer de páncreas y E6-1 células de leucemia, pero no en fibroblastos humanos normales. A diferencia de la colchicina y NSC 51046, Verde 1 no parece afectar a la polimerización de tubulina que indica que tiene una diana molecular diferente. Green 1 también causadas aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la producción de mitocondrias aisladas de células de cáncer pancreático. Por otra parte,
in vivo
estudios revelaron que Green 1 fue bien tolerado en ratones. Nuestros hallazgos sugieren que un pequeño cambio en la estructura de la colchicina aparentemente ha cambiado el mecanismo de acción y conducir a una mejor selectividad. Esto puede conducir a tratamientos más selectivos en la terapia del cáncer
Visto:. Larocque K, P Ovadje, Djurdjevic S, M Mehdi, Verde J, S Pandey (2014) nuevo análogo de colchicina Induce selectivo Pro-Muerte y autofagia necrosis en células de cáncer humano. PLoS ONE 9 (1): e87064. doi: 10.1371 /journal.pone.0087064
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Agosto, 2013; Aceptado: 19 de diciembre de 2013; Publicado: 23 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Larocque y cols. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El Windsor y Seeds4Hope subvención del Centro de cáncer de la Fundación del Condado de Essex y el programa CRSNG Descubrimiento Grant. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Siyaram Pandey es miembro del consejo editorial de la revista PLoS One. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
En Canadá, se estima que 187, 600 personas se les diagnosticará cáncer y 75, 500 personas morirán de cáncer en 2013 [1]. De la gran cantidad de diferentes tipos de cáncer, el cáncer de páncreas es una de las más mortal, ya que es muy agresivo, resistentes al tratamiento, que progresa rápidamente y tiene una falta de síntomas claros; por lo tanto, se asocia con un mal pronóstico y diagnóstico etapa tardía [2], [3]. Los tratamientos actuales disponibles para el cáncer de páncreas incluyen la cirugía, la radioterapia y varias quimioterapias, incluyendo 5-fluorouracilo y gemcitabina [4]. Por desgracia, la eficacia de estas opciones de tratamiento no es de larga duración y que están asociados con efectos secundarios adversos graves, debido a la orientación no selectiva de las células no cancerosas [5]. Si bien se ha avanzado mucho en muchos tipos de cáncer, los casos de cáncer de páncreas y las muertes siguen en aumento [6]. Es de gran importancia que una alternativa selectiva, más seguro y no tóxico para las opciones de tratamiento actuales se desarrolla para aquellos que sufren de cáncer de páncreas. La leucemia es otro tipo mortal de cáncer que se produce cuando las células madre de la sangre en la médula ósea se transforman en células anormales. Se estima que se diagnosticarán 5.800 canadienses en 2013, causando la muerte de 2.600. Aunque las opciones de tratamiento disponibles, todavía hay una necesidad de desarrollar una alternativa más eficaz y más seguro.
De particular importancia para la supervivencia de las células cancerosas es su capacidad para evadir la muerte celular programada (PCD). Específicamente, las células cancerosas son capaces de saltarse apoptosis, PCD tipo I, implicado en la regulación y el desarrollo homeostático. La apoptosis actúa para evitar que las células dañadas y mutadas de la proliferación y la acumulación de [7]. La autofagia, PCD tipo II, que es un proceso catabólico que implica la descomposición de los componentes celulares dañados y también puede proporcionar energía durante momentos de estrés, también se ha implicado en la supervivencia de las células cancerosas. Este proceso de descomposición de los componentes celulares dañados proporciona a las células con materiales que se pueden utilizar para generar energía hasta que se elimine el factor estresante [8], [9]. Debido a este proceso, la autofagia se ha considerado ser sólo un mecanismo de pro-supervivencia; Recientemente, sin embargo, los investigadores han encontrado que la exposición prolongada a factores de estrés puede conducir a la autofagia prolongado y, posteriormente, la muerte celular [10], [11]. Debido a este doble propósito, hay una pregunta en cuanto a si es más beneficioso para inhibir o inducir la autofagia con el fin de causar la muerte de las células cancerosas, y los investigadores están explorando actualmente ambas avenidas. Por último, la necrosis es una forma de muerte celular patológica que es causada por la exposición a la infección, toxinas o trauma [12], [13]. Recientemente, se ha encontrado que la necrosis, como la apoptosis, también se pueden programar y su inducción puede ser otra estrategia en la terapia del cáncer [14], [15]. Con la investigación en la inducción de muerte celular, los investigadores están cada vez más centrado en la búsqueda de compuestos y productos, con objetivos específicos para el cáncer, que pueden conducir a la inducción de programas de muerte celular en las células cancerosas de manera selectiva, sin la inducción de muerte celular en las células no cancerosas, por lo tanto Sin pasar por algunos de los efectos tóxicos asociados con las terapias actuales contra el cáncer.
la colchicina es un compuesto natural que puede ser aislado de cualquiera de
Colchicum autumnale gratis (azafrán silvestre) o
Gloriosa superba gratis ( lirio de gloria), ambos de los cuales pertenecen a la familia de las liliáceas [16]. La colchicina no es desconocido para el mundo de la medicina, ya que se ha utilizado en el tratamiento de la gota y se ha investigado en muchas otras condiciones, incluyendo la fiebre mediterránea familiar [17], la cirrosis [18] y el síndrome de Sweet [19]. Más recientemente, allocolchicines (derivados de colchicina) y otros análogos han demostrado algunos efectos interesantes en las células cancerosas. Esto se debe en gran medida a la capacidad de alocolchicina para detener la mitosis inhibiendo la polimerización de la tubulina en microtúbulos [16], lo que dificulta el progreso de las células a través del ciclo celular y conduce a la inducción de la apoptosis. Esta inhibición de la formación de microtúbulos es especialmente útil en la terapia del cáncer porque las células cancerosas proliferan rápidamente y sin control. Un derivado de alocolchicina, ZD 6126, que es un profármaco de N-acetilcolquinol, tenía algunos resultados interesantes, ya que fue capaz de alterar el citoesqueleto de las células endoteliales del tumor y causar apoptosis (Fig. 1) [20], [21]. ZD 6126 provocó necrosis de células tumorales en
in vivo
modelos de ratón de pulmón humano (Calu-6), colorrectal (LoVo y HT-29), próstata (PC-3), de ovario (SKOV-3), y (MDA-MB-231) los tumores de mama [22]. Por desgracia, este compuesto se detuvo en la fase 2 de ensayos clínicos como resultado de cardio-toxicidad asociada en los seres humanos [23]. No es sorprendente que este derivado y otros derivados eran tóxicos debido a la tubulina y los microtúbulos son esenciales para el ciclo celular no sólo en las células cancerosas, sino también en células no cancerosas; Por lo tanto, este objetivo no selectiva es una de las razones por las que las células no cancerosas son susceptibles a la apoptosis inducida por agentes de tubulina de orientación, dando lugar a los efectos secundarios observados [24].
A continuación se presenta la actividad anticancerígena de los derivados sintéticos de alocolchicina; N-acetil-O-methylcolchinol (NSC 51046 o SNEM), que es estructuralmente similar a ZD 6126, y (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1), que es una nuevo derivado de alocolchicina que es isómera en el anillo a (Fig. 1). En este estudio, se presenta los mecanismos diferenciales de los dos derivados alocolchicina contra la leucemia y el cáncer de páncreas células causados por ligeras modificaciones de su estructura química. NSC 51046 claramente indujo apoptosis no selectiva en las células de cáncer de páncreas (PANC-1 y BxPC-3) y fibroblastos fetales no cancerosas (NFF), mientras que el verde 1 causó la autofagia pro-muerte y necrosis selectiva en las células de cáncer de páncreas (PANC-1 ) y la leucemia aguda de células T (Jurkat E6-1 o), si bien tienen poco efecto sobre los fibroblastos humanos no cancerosos (NHF). Además, a diferencia de la colchicina, ZD 6126 y NSC 51046, Verde 1 no parece apuntar tubulina y tiene una diana molecular diferente. Es muy interesante que un pequeño cambio en la estructura de alocolchicina ha cambiado el mecanismo de acción y conducir a una mejor selectividad cáncer. Estos hallazgos podrían conducir al desarrollo de mejores productos quimioterapéuticos, más selectivos para el tratamiento del cáncer.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Las líneas celulares de cáncer humano que se utilizaron en este estudio fueron el carcinoma de páncreas epitheloid (PANC-1; Cat. No. CRL-1469), adenocarcinoma pancreático (BxPC-3; Cat. No. CRL-1687) y la leucemia aguda de células T, clonar E6-1 (Jurkat; TIB-152 ), todos los cuales fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las líneas de células normales utilizados en este estudio fueron los fibroblastos humanos normales (Fondo Nacional de Salud; Nº Cat. AG09309) y fibroblastos fetales normales (NFF; Cat. Nº AG0443), que ambos fueron adquiridos de Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ . células PANC-1 se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá) y 10 mg /ml de gentamicina ( Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá). células BxPC-3 y Jurkat se cultivaron en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, ON, Canadá), suplementado con 10% FBS (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá) y 10 mg /ml de gentamicina (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá). Fondo Nacional de Salud y las células NFF fueron cultivadas en medio esencial mínimo con sales equilibradas de Earle (MEM /EBSS), (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) suplementado con FBS al 15% no aminoácidos esenciales (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá) y 10 mg /ml de gentamicina (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá). Todas las líneas de células fueron cultivadas y mantenidas en un científico CO Forma
2 incubadora equipada con un filtro HEPA (Forma Scientific Inc., Marietta, Ohio) a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO
2
derivados de p> alocolchicina, N-acetil-O-methylcolchinol (NSC 51046) y (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1) se utilizaron como los compuestos clave para este estudio [25]. Las células fueron tratadas con concentraciones crecientes y las duraciones de NSC 51046 y Verde 1, reconstituidas en dimetilsulfóxido (Me
2Entonces). Antes del tratamiento, los compuestos concentrados madre se diluyeron adicionalmente en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Además de alocolchicina derivados, colchicina (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) se utilizó para comparar los efectos de los derivados de alocolchicina a la eficacia mecánica ya conocida de colchicina. Paclitaxel (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) y Paraquat (PQ), (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) se utilizaron como controles positivos en varios experimentos.
Evaluación de la eficacia de verde 1 y NSC 51046
WST-1 ensayo.
Para medir la viabilidad celular, WST-1 de tinte ([2- (4-yodofenol) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4- disulfofenil) -2
H
-tetrazolium, se utilizó Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Este colorante se reduce a formazán en presencia de enzimas metabólicas, que son indicativos de actividad metabólica activa en las células viables. La cantidad de formazán se puede medir a través de la absorbancia a 450 nm. Igual número de células se sembraron en placas de 96 pocillos (PANC-1:4,000 células /pocillo; FHN: 4.000 células /pocillo), con un volumen total de 100 mL. Después de la unión, las células se trataron con concentraciones crecientes de verde 1 o NSC 51046. En el punto de tiempo deseado, se añadió el colorante de WST-1 a cada pocillo y se incubó durante 4 horas a 37 ° C. El uso de un Wallac Victor
3 ™ 1420 Multilabel Contador (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canadá), se midieron los valores de absorbancia a 450 nm. Los valores de absorbancia de las células tratadas se expresan como un porcentaje de los valores de absorbancia del control.
ensayo de exclusión de azul tripán.
Para cuantificar el porcentaje de células muertas, azul tripán de células tinte impermeable se incubó con las células tratadas [26]. Una mezcla 01:01 de suspensión de células y de tripano colorante azul (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) se pipeteó en un hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA) y el número de células (células muertas teñidas células azules y viables permanecieron sin teñir) se cuantificaron manualmente. El número de células muertas se expresó como un porcentaje del número total de células. Los resultados fueron analizados utilizando GraphPad Prism 6.0 y se presenta como la media ± DE de dos experimentos independientes.
Hoechst tinción
Con el fin de visualizar la morfología nuclear y la inducción de la apoptosis, Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) se utilizó para teñir los núcleos. Después del tratamiento, ya sea con verde 1 o NSC 51046, las células se incubaron con 10 M de la Hoechst 33342 tinte durante 10 minutos a 37 ° C. Las imágenes se obtuvieron usando una Leica DM IRB invertido microscopio de fluorescencia (Wetzlar, Alemania) a 400 aumentos.
Anexina V Ensayo de unión
Con el fin de determinar si NSC 51046 y colchicina fueron inducción de la apoptosis, una se utilizó anexina V ensayo de unión. Después del tratamiento, se recogieron las células PANC-1, se lavaron en PBS y se resuspendieron en 50 l de Anexina V tampón de unión (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM
2, ph 7,4). Las células fueron incubadas con Anexina V-488 AlexaFluor Conjugado (1:20) (Invitrogen, Canadá), 10 mM colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.) y 1 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, EN , Canadá) durante 15 minutos a 37 ° C. Las imágenes fueron tomadas con una ampliación de 400X utilizando el microscopio Leica DMI6000 fluorescente (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) |
MDC Ensayo
Para detectar la autofagia, monodansylcadaverine (MDC;. Sigma-Aldrich, ON, Canadá ) se utilizó. MDC se incorpora en vacuolas autofágicas, produciendo una mancha punteada que es observable a través de microscopía de fluorescencia. Las células se cultivaron en cubreobjetos y, después de la incubación durante la noche, se trataron con dosis variables de verde 1. Tras el tratamiento, las células se incubaron con una concentración final de 0,1 mM MDC (diluido en PBS) durante 35 minutos a 37 ° C. Para confirmación adicional de la pérdida de integridad de la membrana celular y la inducción de la muerte celular, las células fueron contra-teñidas con la membrana celular tinción nuclear impermeable, yoduro de propidio a 1 mg /ml (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) para confirmar la inducción de la muerte celular. Las imágenes se obtuvieron utilizando una Leica DM IRB invertido microscopio de fluorescencia (Wetzlar, Alemania) a 400 aumentos.
celular lisado Preparación
Tras el tratamiento con períodos de tiempo 5 M verdes 1 para el vario, las células fueron recogió, se lavó en PBS y se incubaron en tampón NP40 0,1% (Tris HCl 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM) durante 25 minutos en hielo (vórtex cada 5 minutos, durante 15 segundos). La muestra se centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. El sobrenadante (que contiene el material celular lisada) se almacena a -20 ° C hasta su uso.
Western Blot
Las muestras de proteína se separaron usando SDS-PAGE. proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon con 5% w /v de leche TBST (Tris-solución salina tamponada con Tween-20) solución. Las membranas se probaron con anticuerpos primarios en el 2% w /v de leche TBST durante la noche a 4 ° C para la cadena asociada a los microtúbulos luz protein1 3 (LC3) en conejo (1:500) (Novus Productos Biológicos, Cat. Nº NB100- 2220, Littleton, CO, EE.UU.); β-actina se crió en ratón (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat No. SC-81178, CA, EE.UU..); Beclin-1 en conejo (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. No. SC-11427, CA, EE.UU.). Después de la incubación, las membranas se lavaron en TBST y se incubaron un anti-ratón (1:2000) o un anti-anticuerpo secundario de conejo (1:2000) peroxidasa de rábano conjugada (Abcam, Cat No. ab6728 & amp;. Ab6802, Cambridge, MA , EE.UU.) en 2% w /v TBST leche durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavados en TBST, las bandas se visualizaron con reactivo de quimioluminiscencia (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) y densitometría se realizó utilizando el software ImageJ.
Ensayo de la polimerización de tubulina
Para observar el efecto de alocolchicina se utilizaron derivados de la polimerización de tubulina, un kit de ensayo de polimerización de tubulina (citoesqueleto Inc. Cat. No. BK006P). Una placa de 96 pocillos se pre-calienta a 37 ° C durante 30 minutos antes de comenzar el ensayo. Los pocillos de control recibieron tampón tubulina general (80 mM TUBOS pH 6,9, MgCl 2 mM
2, EGTA 0,5 mM), y los otros pocillos recibieron tampón general de la tubulina y, o bien verde 1, NSC 51046 o colchicina (Sigma-Aldrich, ON, Canadá). Todos los pocillos (incluyendo control) se incubaron con 3 mg /ml de tubulina en tampón de polimerización de tubulina (80 mM TUBOS pH 6,9, MgCl 2 mM
2, EGTA 0,5 mM, GTP 1 mM y 10,2% de glicerol). El valor de DO
340 se midió cada minuto durante una hora. curvas de polimerización se generaron utilizando GraphPad Prism 6.0. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
Aislamiento mitocondrial y Medición de especies reactivas del oxígeno (ROS) Producción
Las mitocondrias se aislaron a partir de células PANC-1 no tratados para investigar el efecto de la Verde 1 de ROS la producción y la posibilidad de la mitocondria como un objetivo de verde 1. las células fueron lavadas primero dos veces en PBS frío, se resuspendieron en tampón hipotónico (EDTA 1 mM, 5 mM de Tris-HCl, manitol 210 mM, sacarosa 70 mM, 10 mM Leu- pep, 10 mM Pep-a, 100 mM PMSF), se homogeneizó, después se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C para sedimentar la fracción nuclear. El sobrenadante se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. El sobrenadante citosólico fue dispuesto y el pellet (que contiene mitocondrias) se resuspendió en tampón de reacción frío y se trató con 250 paraquat mu M (PQ) como control positivo, 2,5 M Verde 1 o 10 mM colchicina. Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR), junto con peroxidasa de rábano picante se utilizó para medir la producción de ROS mitocondrial. Las mitocondrias que fueron aisladas como se mencionó anteriormente se resuspendieron en tampón hipotónico frío y se añadieron 20 g de proteína a cada pocillo en una placa de color negro de 96 pocillos opaca. Se midió la fluorescencia (Ex. 560 nm y Em. 590 nm) cada 5 minutos durante 5 horas utilizando un espectrofluorímetro (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las lecturas se analizaron utilizando GraphPad Prism 6.0 y se expresaron como unidades de fluorescencia relativa (RFU) por microgramo de proteína y representan los datos obtenidos a partir de tres experimentos independientes.
In Vivo
Evaluación de (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1)
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo canadiense para el manejo de estos animales y aprobados por la Universidad de Cuidado de animales de Windsor Comité. viejos ratones CD-1 nu /nu machos de seis semanas se obtuvieron de Charles River Laboratories y se alojaron en condiciones de laboratorio constantes de un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad, de acuerdo con los protocolos de los animales expuestos en la Universidad de Windsor Ética de Investigación de reunion AUPP #: 10-17. Tras la aclimatación, los ratones se dividieron en dos grupos principales, un grupo se inyectaron por vía subcutánea en los flancos derecho e traseras izquierda con Me
2SO en PBS (10 l en 200 l de PBS), mientras que el segundo grupo recibió inyecciones subcutáneas de verde 1 (10 mg /kg /día para un volumen total de 10 l verde 1/200 l de PBS) tres veces a la semana durante un período de un mes. Para evaluar la toxicidad mientras que los ratones estaban vivos, los pesos corporales se midieron tres veces por semana durante la duración del estudio. Tras el período de estudio, los animales se sacrificaron y se obtuvieron sus órganos y tejidos (hígado, riñones y corazón) y se almacenan en 10% de formaldehído para el análisis inmunohistoquímico y toxicológica
hematoxilina & amp.; Eosina (H & amp; E) tinción
órganos de los ratones fueron fijadas en formol al 10%, después de lo cual se cryosectioned en 10 micras secciones y se colocan en un SuperFrost /Plus portaobjetos de microscopio (Fisherbrand, Fisher Scientific). Secciones de órganos se tiñeron de acuerdo con un estándar de H & amp; Protocolo E [27].
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media (desviación estándar). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de ANOVA de 2 vías con el software GraphPad Prism 6.0.
Resultados
efecto de los derivados alocolchicina sobre la viabilidad de las células del cáncer de
A los efectos de este estudio, la viabilidad de las células de cáncer de páncreas (PANC-1) se midió, después del tratamiento con verde 1 o NSC 51046, utilizando el ensayo de viabilidad celular WST-1. Tras una incubación de 4 horas con el colorante WST-1, la absorbancia se leyó a 450 nm. En paralelo, se usaron fibroblastos humanos normales no cancerosas (FHN) como el homólogo celular normal en este estudio para determinar la selectividad de los compuestos a las células cancerosas. Nuestros resultados muestran que tanto NSC 51046 y verde 1 fueron capaces de reducir la viabilidad de las células PANC-1. Sin embargo, se observó que Green 1 fue selectiva a las células cancerosas, ya que la viabilidad de las células PANC-1 se redujo modestamente mientras que la viabilidad de FHN no se vio afectado. Por otro lado, el tratamiento con NSC 51046 condujo a la reducción de la viabilidad en las células, tanto cancerosas y no cancerosas (Fig. 2A). Además, Verde 1 tratamiento disminuyó la proliferación de células de leucemia de células T humanas y la disminución de la integridad de la membrana celular, como se evidencia por el aumento de células positivas de azul de tripano observados después del tratamiento (Fig. 2B). En conjunto, estos resultados indican que Green 1 es selectiva hacia las células cancerosas.
(A) células de cáncer de páncreas (PANC-1) y fibroblastos humanos normales (FHN) fueron tratados con concentraciones crecientes de verde 1 y NSC 51046 y después del tratamiento en los puntos de tiempo indicados, las células se incubaron con medio de viabilidad-1 WST celular durante 4 horas. La absorbancia se leyó a 450 nm y los resultados se expresaron como un porcentaje del control. Los valores se expresan como media ± SD de quadruplicates; (I) PANC-1 tratados con NSC 51046 (Interacción entre cada concentración: **** p & lt; 0,0001; control frente a factor de columna: **** p & lt; 0,0001); (Ii) NHF trató con NSC 51046 (Interacción entre cada concentración: **** p & lt; 0,0001; control frente a factor de columna: **** p & lt; 0,0001); (Iii) PANC-1 tratada con verde 1 (Interacción entre cada concentración: p = 0,9955; control frente a factor de columna: **** p & lt; 0,0001); (Iv) NHF tratada con verde 1 (Interacción entre cada concentración: p = 0,3642; control frente a factor de columna: * p = 0,0370) (B) después del tratamiento de células de leucemia de células T aguda humana (Jurkat) con Green 1, un azul de tripano con exclusión de ensayo se llevó a cabo. Las células se tiñeron con colorante impermeable membrana celular con azul de tripano y se obtuvieron los números de células positivas con azul de tripano usando un hemocitómetro. Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas de azul de tripano, lo que indica las células muertas con las membranas celulares no intactos. Los valores se expresan como media ± DE de dos experimentos independientes.
modos distintos de inducción de muerte celular por derivados de alocolchicina
Para investigar el papel de los derivados alocolchicina sobre la inducción de la muerte celular en las células cancerosas , los núcleos de las células se tiñeron con 10 M de colorante Hoechst 33342 durante 10 minutos después del tratamiento, ya sea con verde 1 o NSC 51046, ya sea para 48 o 96 horas. En las imágenes resultantes (Fig. 3A), se observó que NSC 51046 tratamiento dio lugar a núcleos que mostraban morfología apoptótica, incluyendo formación de ampollas en la célula, la contracción y núcleos condensados de ambos tipos de células de cáncer de páncreas y de los fibroblastos fetales normales no cancerosas (ENFF) , correspondiente a los datos de viabilidad. Sin embargo, el cáncer y las células no cancerosas tratadas con verde 1 no mostraron esta morfología apoptótica, lo que sugiere que Green 1 no induce apoptosis en células de cáncer pancreático. La inducción de apoptosis por NSC 51046 se confirmó mediante un ensayo de unión de Anexina V. Anexina V se une a fosfatidilserina externalizada, que es un marcador de la apoptosis temprana [28]. En las imágenes resultantes (Fig. 3B), se encontró que el tratamiento con ambas dosis de NSC 51046 plomo a la externalización de la fosfatidilserina como se muestra por la tinción fluorescente verde. Además, también se observó que el tratamiento con colchicina inducida por la muerte de las células apoptóticas, ya que dio lugar a la fragmentación nuclear, externalización de la fosfatidilserina y la muerte celular. La falta de morfología apoptótica y la reducción en la viabilidad de células de cáncer pancreático tratados con verde 1 nos llevó a investigar otros modos de muerte celular. Después del tratamiento, las células fueron incubadas con monodansylcadaverine (MDC) para determinar si había inducción de autofagia. Se observó la inducción de la autofagia a las 48 horas en todas las células de cáncer probadas, comparable a la inducción de autofagia por nuestro control positivo para la autofagia pro-supervivencia, Tamoxifen [10] (Fig. 4A). Además, la tinción con yoduro de propidio (PI), reveló que, a diferencia de tamoxifeno, Verde 1 en las células de cáncer tratados fueron positivos para yoduro de propidio y exhibió una forma pro-muerte de la autofagia (Fig. 4A). Esta actividad de verde 1 era específica para las células cancerosas, como FHN tratados con verde 1 no se tiñen positivo para la presencia de vacuolas autofágicas con MDC o muerte celular necrótica con PI, lo que confirma la selectividad de verde 1 a las células cancerosas. Con el fin de confirmar la inducción de la autofagia causado por Green 1, Beclin-1 de expresión y la conversión LC3-I a LC3-II fueron evaluados por análisis de Western blot en células Panc-1 tratados con 5,0 M Verde 1 para diversos intervalos de tiempo (Fig. 4B). β-actina se midió como un control de carga interno. Densitometría se realizó y muestras tratadas durante 3 y 6 horas se compararon con el control temprano, mientras que la muestra tratada durante 48 horas se comparó con el control de 48-horas. Los gráficos resultantes muestran que Green 1 tratamiento provocó un aumento en los niveles Beclin-1 en todos los puntos de tiempo después del tratamiento. niveles LC3-II se incrementaron moderadamente a las 6 horas después del tratamiento con verde 1.
Tras el tratamiento con cualquiera de las células verdes 1 (A) al cáncer pancreático (BxPC-3 y PANC-1) y humana normal y fibroblastos fetales ( FHN y ENFF) se incubaron con Hoechst 33342 tinte para caracterizar la morfología nuclear y detectar la inducción de la apoptosis. Brillantes colores, núcleos condensados acompañados de cuerpos apoptóticos son indicativos de la apoptosis. las células (B) PANC-1 se incubaron con medio de Anexina V para verificar la inducción de apoptosis causada por NSC 51046. Las células se contratiñeron con Hoechst 33342 tinte y yoduro de propidio (PI) para visualizar la morfología nuclear y la muerte celular. Las imágenes mostradas son representativos de dos experimentos independientes a las 48 horas después del tratamiento con NSC 51046 y colchicina.
(A) células de cáncer de páncreas, las células leucémicas humanas (Jurkat) y se incubaron con FHN Monodansylcadaverine (MDC) para teñir vacuolas autofágicas y yoduro de propidio (PI) para la muerte celular para determinar si la inducción de autofagia condujo a la muerte celular. Bright, tinción punteada es indicativo de la autofagia, como se ve en nuestro control positivo (células tamoxifeno tratados). Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 400X en un microscopio de fluorescencia. análisis (B) transferencia de Western de Beclin-1 expresión y LC3 conversión se llevaron a cabo en células Panc-1 tratados con 5.0 M verdes 1 en diversos puntos temporales. β-actina se midió como un control interno. Las muestras tratadas durante 3 y 6 horas se compararon con el control temprano, mientras que la muestra tratada durante 48 horas se comparó con el control de 48-horas. Los resultados se expresan como media ± DE de dos experimentos independientes para ambas transferencias de Western.
dianas intracelulares de verdes 1 |
La colchicina y algunos de sus derivados son conocidos por inducir la apoptosis en células de cáncer mediante la inhibición de la polimerización de tubulina y que conduce a daños en el ADN, que actúa como una señal para la iniciación del proceso de la apoptosis [29]. Mientras observamos los efectos diferenciales de Verde 1 y NSC 51046 en la inducción de muerte celular, hemos querido investigar más a fondo las posibles dianas intracelulares de Verde 1, en comparación con NSC 51046 y colchicina. En particular, se evaluaron los efectos de la colchicina y sus derivados en la polimerización de tubulina. Verde 1, NSC 51046 o colchicina se incubaron con tubulina purificada a partir de cerebro porcino. El OD
340 se midió cada minuto durante una hora y el gráfico resultante se muestra en la Figura 5A. Nuestros resultados indican que NSC 51046 indujo inhibición tubulina ligero a la dosis más baja, que corresponde a los estudios previos [31], [32]; sin embargo, se observó que una dosis mayor de NSC 51046 causó la polimerización de tubulina rápida, que fue inesperado. Como era de esperar, la colchicina inhibe la polimerización de tubulina. El tratamiento con verde 1 a dosis más altas condujo a un ligero aumento en la polimerización de tubulina, mientras que el verde 1 dosis más baja se mantuvo relativamente cerca de la muestra de control (Fig. 5A). Esto confirma que Green 1 y NSC 51046 tienen mecanismos bioquímicos distintos, como NSC 51046 objetivos la polimerización de tubulina en un grado mucho mayor que en verde 1. Estos resultados sugieren que un simple cambio en las estructuras de estos análogos de alocolchicina ha dado lugar a muy diferentes actividades biológicas en células normales y cancerosas. derivados de colchicina
(a) (verde 1 y NSC 51046) se incubaron con la tubulina porcina durante una hora en una placa de 96 pocillos. Se obtuvo la absorbancia (OD
340 nm) cada minuto durante una hora de incubación. La colchicina se utilizó para la comparación con los derivados. (B) mitocondrias aisladas de células PANC-1 se trataron con verde 1 y la producción de ROS se midió usando sustrato Amplex Red en presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP). Los resultados se compararon para controlar las mitocondrias no tratadas, las mitocondrias tratadas con colchicina y el control positivo, el paraquat (PQ). Las lecturas de fluorescencia se tomaron en intervalos de 5 min durante 4 horas a Ex. 560 nm y Em.590 nm y se expresó como unidades de fluorescencia relativa (RFU).