Extracto
Antecedentes
Mutaciones en la inestabilidad de microsatélites (MSI-alto alto) los cánceres colorrectales son una fuente potencial de neo-antígenos diana. Muchas transcripciones sin sentido están sujetos a una rápida degradación debido a la desintegración mediada por el antisentido (NMD), pero las transcripciones sin sentido con un CMS en el último exón o cerca del último exón-exón cruce tener una resistencia intrínseca a la descomposición mediada por el antisentido (NMD). transcripciones NMD-resistentes son, por tanto, una fuente probable de las proteínas mutantes expresados en los tumores MSI-alto.
Métodos
El uso de anticuerpos frente a la conservada N-terminales de las proteínas mutantes predichos, hemos analizado MSI-alto líneas celulares de cáncer colorrectal para ejemplos de proteínas mutantes expresadas naturalmente surgen de mutaciones de cambio de microsatélites de codificación (cMS) por inmunoprecipitación y Western Blot experimentos. Detectado bandas de proteínas mutantes de transcripciones NMD-resistentes fueron validados por la caída de genes específicos de ARN corto de interferencia (siRNA). Una búsqueda en todo el genoma se realizó para identificar CMS-que contienen genes susceptibles de generar NMD resistentes a las transcripciones que podrían codificar para antigénico expresado proteínas mutantes en el cáncer de colon MSI-alto. Estos genes fueron seleccionados para las mutaciones de la CMS en las líneas celulares de cáncer de colon MSI-alta.
Resultados
No se detectaron bandas de proteínas mutantes de peso molecular esperado en líneas de células mutadas MSI-alto para NMD-resistentes transcripciones (CREBBP, EP300, TTK), pero no las transcripciones NMD-sensibles (BAX, CASP5, MSH3). Expresión de la CREBBP mutante y proteínas EP300 fue confirmada por siRNA desmontables. Se encontraron cinco-cojinete de CMS genes identificados a partir de la búsqueda en todo el genoma y sin mutación de datos (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, Fbxl3 y RGS12) existente a mutar en al menos 5 de los 11 (45%) de las líneas celulares MSI-alto probado.
Conclusión
transcripciones NMD-resistentes pueden dar lugar a proteínas mutantes expresados en células de cáncer de colon MSI-alta. proteínas mutantes si se expresa comúnmente en los cánceres MSI-alto primarios de colon, derivados de MSI podrían ser útiles como dianas inmunológicas específicas del cáncer en una vacuna dirigidas a los tumores de colon MSI-alto
Visto:. Williams DS, Ave MJ, Jorissen RN , Yu YL, Walker M, Zhang HH, et al. Las mutaciones resistentes (2010) Tonterías mediada decaimiento son una fuente de proteínas mutantes expresados en líneas celulares de cáncer de colon con inestabilidad de microsatélites. PLoS ONE 5 (12): e16012. doi: 10.1371 /journal.pone.0016012
Editor: C. B. Ben Ko, Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 24 Agosto, 2010; Aceptado: 3 de diciembre de 2010; Publicado: 31 de diciembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Williams et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue parcialmente financiado por NHMRC Programa de subvención número 487922. el apoyo financiero para este trabajo también fue proporcionada por un CASS (Contribución a la Beca de Australia & amp; Ciencia) Fundación Ciencia y Medicina Grant (DSW, AWB, ECN), el Consejo Victoria cáncer (ES) y un Real Colegio de patólogos de Australasia Kitamura /Memorial Award Kanematsu y donación de asistencia técnica (DSW). Este trabajo también fue apoyado por fondos del Programa de Apoyo a la Infraestructura de operaciones notificado por el Gobierno de Victoria, Australia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aproximadamente el 15% de los cánceres colorrectales, gástricos y endometriales tiene defectuosa desajuste de reparación del ADN y la inestabilidad de microsatélites de alto nivel (MSI-alta) [1], [2]. La mayoría de los tumores MSI-Alto Resultado de hipermetilación esporádica del promotor del gen MLH1 [3], pero la mutación de una enzima de reparación de apareamientos erróneos del ADN es el defecto subyacente en los casos de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) [4]. Los tumores con MSI tienen una forma de inestabilidad genética que se manifiesta como mutaciones de cambio en las secuencias de microsatélites repetitivas de ADN [1]. mutaciones de cambio en la codificación de los microsatélites (CMS) alteran el marco de lectura genética y en la mayoría de los casos codifican para las proteínas truncadas con secuencias únicas de proteína C-terminal.
Una característica patológica intrigante de los cánceres colorrectales MSI-High es una tendencia a tener aumento del número de tumor de la infiltración de linfocitos (TIL) en relación con MSI-Low y microsatélites estables (MSS) tumores [5]. El TIL en los tumores MSI-alto se activan los linfocitos T citotóxicos CD8 + (CTL) [6], adecuados para el reconocimiento de péptidos intracelulares tales como neo-antígenos derivados de MSI, presentado por moléculas HLA de clase I. Un MSI de alta fenotipo y el aumento de los TIL en un cáncer colorrectal connotan un mejor pronóstico etapa con ajuste en relación con los tumores MSI-Low o SMS [7], [8]. Esta ventaja en la supervivencia puede reflejar un beneficio de protección del infiltrado inmune [9].
péptidos sintéticos correspondientes a las proteínas mutantes predichos surgir de mutaciones del marco de lectura asociadas a MSI se han demostrado para ser inmunogénico. Durante la última década, los linfocitos T citotóxicos (CTL) se han descrito en contra HLA-A2 péptidos derivados de mutaciones de cambio en la A10 cms de TGFBR2 [10], [11], la A10 cms de CASP5 [12], el T10 vinculante cms de OGT [13] y, recientemente, el T15 cms de U79260 (FTO) [14]. Las respuestas de CTL a proteínas mutantes se han detectado en pacientes con cánceres de colon MSI asociadas y en los portadores de mutaciones HNPCC-saludables, aumentando la posibilidad de la vigilancia inmunológica protectora en esta última población [15].
No se publica mutación de datos disponible para al menos 1522 de codificación de mononucleótidos microsatélites de 460 genes en cánceres colorrectales MSI-alto [16]. Existe una correlación entre la longitud de la CMS y la tasa de mutación. Los genes con mutaciones cMS son fuentes potenciales de proteínas dirigibles para estrategias de terapia inmune. Dado que las mutaciones del marco de lectura afectan repeticiones cMS de una manera predecible, las proteínas mutantes generados son susceptibles de ser conservada en una población de pacientes con cáncer de colon MSI-alta [17], [18]. Aunque no un transcrito mutante es común a todos los MSI-alto tumores, una vacuna que se dirige a un conjunto de proteínas comúnmente mutado puede ser un tratamiento efectivo para el cáncer de MSI-alto de colon. Hay una necesidad de nuevas terapias contra el cáncer de colon MSI-alto, ya que varios estudios han demostrado que estos tumores que son resistentes a agentes quimioterapéuticos convencionales tales como 5-fluorouracilo [19], [20], [21].
la existencia de proteínas mutantes derivados de MSI se ha deducido por los estudios inmunológicos, pero hay una falta de datos publicados en relación con la detección directa de las proteínas mutantes derivados de MSI predichos. Western blot análisis se han publicado en las que se detectaron bandas de proteínas mutantes potenciales para la CREBBP, EP300 [22] y los genes MBD4 [23], pero no había ninguna validación de estas bandas. Confirmación de la expresión de proteínas mutantes en tumores MSI-alto es importante si se trata de ser dianas terapéuticas exitosas para una vacuna. La expresión estable de las proteínas mutantes que facilita la presentación cruzada de antígenos tumorales por las células presentadoras de antígeno profesionales y estimula una respuesta T helper es probable que proporcione superior de inmunidad anti-tumor [18]. Sin embargo, las transcripciones más mutantes generados por MSI son objeto de una rápida degradación por la descomposición mediada por el antisentido (NMD) [24], [25] y en ausencia de la intervención, poca o ninguna proteína mutante objeto de orientación se generará a partir de estas transcripciones aberrantes [24 ].
En este estudio hemos detectado tres proteínas mutantes derivados de MSI, los cuales surgen de las transcripciones NMD-resistentes. Después de una búsqueda en todo el genoma de las transcripciones NMD-resistentes adicionales, CMS-que contienen genes fueron seleccionados por mutaciones en un panel de líneas celulares de cáncer de 11 MSI-alta de colon. Los genes fueron seleccionados para análisis de la mutación sobre la base de la frecuencia probable de alta mutación (dependiendo de la duración CMS), probablemente inmunogenicidad (basado en el mutante C-terminal de longitud de aminoácidos) y es probable que la expresión en el cáncer de colon (basan en los datos de genes y expresión de la proteína cuando se disponga de ). transcripciones NMD-resistentes frecuentemente mutados Se evaluó la probable HLA-A * 0201 epítopos de CTL utilizando
in silico
software predictivo, SYFPEITHI [26], para la comparación con los epítopos derivados de MSI ya que han demostrado ser inmunogénica
In
vitro.
Nuestros resultados confirman que las transcripciones NMD-resistentes dan lugar a proteínas mutantes expresadas y también muestran que ocurren comúnmente mutaciones de cambio que generan NMD resistente transcripciones son una prometedora fuente de antígenos tumorales dirigibles en MSI- cánceres de colon alta. Un conjunto de proteínas mutantes expresadas comúnmente tiene el potencial para formar la base para una vacuna multivalente o inmunoterapia para combatir tumores MSI-alto.
Resultados
líneas celulares de cáncer de colon MSI de alta albergan mutaciones de cambio en múltiples de cMS
Proyección de las líneas de células de cáncer de colon para las proteínas de reparación de ADN no coinciden expresión aberrante reveló un fenotipo anormal consistente con MSI en 11 de 17 líneas celulares (Tabla 1). Las líneas de células se evaluaron para las mutaciones del marco de lectura en una selección de genes con la CMS se informó anteriormente para desarrollar mutaciones en cánceres MSI-alto de colon. Se detectaron numerosas mutaciones consistentes con un MSI de alta fenotipo en cada línea celular con genes de reparación del ADN aberrante mediante técnicas de inmunohistoquímica, pero pocas mutaciones en su caso se detectaron en las restantes líneas celulares (Tabla 2, Tabla S1). Supresión de 1 par de bases de ADN fue la mutación más común, representando el 82% (214/262) de las mutaciones observadas en este estudio (mutaciones bialélicas probables cuentan como 2 mutaciones). La mayoría de las mutaciones de cambio codifican para las proteínas truncadas de bajo peso molecular con un C-terminal mutado (Tabla 3).
proteínas mutantes derivados de MSI detectables son expresadas por las transcripciones NMD-resistentes
Para detectar las proteínas mutantes expresadas, compramos anticuerpos a la porción N-terminal conservado de proteínas seleccionadas. En una primera fase una selección de genes mutados comúnmente reportados como posibles genes diana "" [1]. experimentos de Western blot en lisados de células enteras y los inmunoprecipitados de las líneas celulares genotipo identificado bandas de proteína correspondiente al peso molecular esperado para BAX normal (Figura 1), MSH3 y CASP5 proteínas (datos no publicados) en líneas celulares con alelos no mutados de estos genes . Sin embargo, no se detectaron bandas de proteínas mutantes para cualquiera de estos genes. En el caso de BAX generamos anticuerpos policlonales de conejo a un péptido sintético correspondiente a la C-terminal mutado. Estos anticuerpos mostraron unión específica a péptido mutante sintético en Biacore, ELISA y ensayos de Western blot, pero no detectaron una banda de proteína BAX mutante en lisados de células enteras o inmunoprecipitados de BAX mutado líneas celulares (datos no publicados). Las mutaciones en BAX, MSH3 y CASP5 todo codifican para NMD-sensibles (NMD-S) transcripciones mutante; mutante BAX y MSH3 son conocidos por ser susceptibles a la degradación [27]. NMD-sensibilidad podría ser responsable de nuestra incapacidad para detectar cualquier proteínas mutantes que surgen de estos tres genes, aunque proteína anormal plegable con la pérdida de los epítopos de anticuerpos también puede ser un factor.
(A) normal de las proteínas BAX (21 kDa , flecha), pero no la proteína BAX mutante (predijo 6,4 kDa) se detectó en los análisis Western blot de lisados de células enteras de líneas celulares de cáncer de colon. líneas celulares con el estado de mutación BAX G8 de CMS: 1. LoVo (-1, +1), 2. SW480 (WT), 3. HCA7 (-1, en peso), 4. LS174T (-1), 5. HCT116 (- 1, en peso), 6. HeLa (en peso), 7. LIM1215 (-1). (B) en homocigosis la mutación de base -1 en el caso CMS del G8 en la línea celular LS174T (arriba) en comparación con la línea celular no mutada, SW1222 (inferior) (revertir la secuenciación del ADN). proteína (C) normal BAX (flecha), pero no la proteína mutante BAX detectado por inmunoprecipitación: 1. HeLa (en peso), 2. LS174T (-1). cadena ligera de IgG a 25 kDa.
Por lo tanto, trató de detectar las proteínas mutantes derivados de las transcripciones NMD-resistentes (NMD-R). previamente publicados Western blot datos mostraron posibles bandas de proteína mutante de la CREBBP y EP300 genes, cada uno derivado de un heterocigoto (-1, de tipo salvaje) mutación del marco de un mer 5 cm repite en el último exón, que se detectó en el LoVo (CREBBP) y líneas de células HCT116 (EP300), respectivamente [22]. Se confirmó la presencia de estas mutaciones en LoVo y líneas celulares HCT116 por PCR y secuenciación de ADN. Estos CMS no se mutaron en ninguna de las otras líneas de MSI-alto o SMS de células. Las bandas correspondientes a los pesos moleculares esperados de la CREBBP normal y proteína EP300 se detectaron sistemáticamente en los análisis Western blot de líneas celulares no mutado. Detectamos bandas de proteínas anormales correspondientes a los pesos moleculares esperados de CREBBP mutante y EP300 mutante en el LoVo y líneas celulares HCT116, respectivamente, en transferencias Western de lisados de células enteras (Figura 2) y en los inmunoprecipitados (Figura S1). Nuestra blot coincide con los datos publicados previamente para EP300 [22]. Los datos anteriores corresponden CREBBP una región de bandas no específicas en nuestra blot, pero las bandas de proteínas de peso molecular apropiado también estuvieron presentes en nuestras manchas. Las bandas CREBBP también fueron detectados en experimentos en los que se utilizó un anticuerpo para una inmunoprecipitación y un anticuerpo a un epítopo CREBBP diferente se utilizó para la detección.
se detectaron las proteínas normales (flecha blanca) y las proteínas mutantes (flecha negro) en Western Blot análisis sobre lisados de células enteras para CREBBP (a) y EP300 (B). (A) CREBBP C5 CMs: 1. SW480 (en peso), 2. LoVo (-1, en peso), 3. HCT116 (en peso), 4. LIM1215 (en peso), 5. LS174T (en peso). MW (kDa): peso 265, mut 209. (B) EP300 A5 de CMS: 1. LoVo (en peso), 2. HCT116 (-1, en peso), 3. HCA7 (en peso), 4. LIM1215 (en peso), 5 . LS174T (en peso). MW (kDa): 223 en peso, mut 187.
Validación de las proteínas mutantes
Para confirmar la identidad de las bandas de proteínas anormales y demostrar que estos representan ejemplos genuinos de la esperada proteínas mutantes, que inicialmente se llevan a cabo la espectrometría de masas en tándem en los inmunoprecipitados de las líneas celulares. Esta técnica confirmó la identidad de la CREBBP normal y bandas de proteínas EP300 (Figura S1), validando así la especificidad de los anticuerpos usados. Las proteínas mutantes no fueron detectados por este método, posiblemente debido a la co-inmunoprecipitación de más abundantes proteínas de peso molecular similar, tales como MYH9 (datos no publicados). La especificidad de las bandas de proteínas mutantes se confirmó en lugar mediante el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA) para llevar a cabo caídas de genes específicos del CREBBP mutante y proteínas EP300. Disminución de la expresión de la proteína mutante CREBBP relación con los controles no transfectadas y que no son objeto correlacionado con una disminución significativa en el ARNm objetivo, confirmado por qRT-PCR (Figura 3). Desmontables de la proteína mutante EP300 se demostró de manera similar en los inmunoprecipitados (Figura 4). Estos resultados confirman que las bandas de proteínas anormales detectados son variantes mutadas de las proteínas CREBBP y EP300. Este hallazgo indica que ciertas proteínas mutantes derivados de MSI se expresan naturalmente a niveles detectables.
La especificidad de la banda de proteína mutante fue confirmada por knockdown de genes específicos en transfectantes de siRNA CREBBP orientación. (A) Detección de la banda de la proteína mutante (flecha negro) en lisados de células enteras de la línea celular LoVo, pero la proteína normal sólo (flecha blanca) en la línea celular SW480 no mutado. (B) Transferencia Western de lisados de células LoVo conjunto de siRNA SmartPool transfectantes muestran disminución de la expresión de la normalidad (flecha blanca) y la banda de la proteína mutante (negro flecha) en lisados CREBBP orientados CREBBP (carril 1). control de beta-catenina de carga (flecha gris) de 92 kDa. (C) intensidad relativa de normal (azul) y bandas (rojo) de proteínas CREBBP mutantes en comparación con las células no transfectadas (PBS). (D) La disminución de la expresión de mRNA en CREBBP transfectantes CREBBP siRNA (carril izquierdo) respecto a las células no transfectadas (carril derecho).
La especificidad de la banda de la proteína mutante confirmado por derribo de genes específicos en transfectantes de siRNA dirigidos EP300. (A) Datos de QRT-PCR para evaluar siRNAs dirigidos EP300 (mejor desmontables utilizando P300-1 y P300-3). (B-C) Disminución de la proteína mutante EP300 detectado en los análisis Western blot en inmunoprecipitados de EP300 siRNA transfectantes relación con los controles sin transfectar (PBS).
La detección de bandas de proteínas mutantes potenciales adicionales
en experimentos adicionales Western Blot (Figura 5), se detectaron mutantes bandas de proteínas TTK en múltiples líneas de células mutadas en un poco más alto peso molecular (101 kDa) que no mutado proteína TTK (97 kDa), consistente con el tamaño predicho (Tabla 3) . Los intentos de siRNA desmontables mutante TTK se vieron obstaculizadas por la dificultad en la resolución de las bandas de proteínas mutantes y normales. Se detectó una banda AIM2 a aproximadamente 46 kDa en transferencias de Western en inmunoprecipitados de lisados de células enteras, consistente el tamaño detectado en estudios anteriores usando este anticuerpo [28]. se detectó proteína AIM2 en múltiples líneas de células no mutadas y también en células LoVo homocigotos mutantes AIM2. Las proteínas mutantes y de tipo salvaje AIM2 son de pesos moleculares predichos similares (39 kDa y 40 kDa, respectivamente). Debido a que las transcripciones NMD-resistentes a menudo tienen un CMS en el último exón cerca de la C-terminal, proteínas mutantes serán a menudo de tamaño similar a las proteínas normales. Esto hace que la validación de estas bandas de proteínas mutantes por técnicas utilizadas para confirmar la CREBBP y EP300 bandas más difícil.
(A) análisis de transferencia Western en lisados de células enteras identificado una banda de proteína TTK potencial mutante (flecha negro) en múltiples líneas mutantes celulares y proteína normal TTK (flecha blanca) solamente en las líneas no mutados: 1. LIM1863 (wT), 2. HCA7 (en peso), 3. LIM1899 (-1, en peso), 4. HCT116 (-1, en peso ), 5. LoVo (-1, en peso), 6. LIM2537 (-1, en peso), 7. LIM2551 (-1, en peso). TTK MW (kDa): peso 97, mut 101. (B) análisis de Western blot en inmunoprecipitados de lisados enteros de células identificadas una banda de proteína AIM2 (flecha negro) en todas las líneas celulares, incluyendo la línea celular LoVo mutante homocigótico: 1. SW480 ( en peso), 2. LoVo (-1), 3. HCT116 (-1, en peso). 4, LS174T (en peso). AIM2 MW (kDa):. En peso 39,0, 40,4 mut
bandas de proteínas mutantes no se detecta en todas las transcripciones NMD-resistentes evaluados. En el caso de ACVR2A, se detectaron bandas de proteína en los pesos moleculares esperados para la proteína normal y mutante, pero de una manera no específica que no se correlacionaron con los datos de la mutación. Se detectaron bandas de proteínas múltiples en transferencias para TCF7L2, un gen con numerosas transcripciones empalmados alternativamente [29], pero no se identificaron las proteínas mutantes que se correlaciona con los datos de mutación.
búsqueda en todo el genoma de las transcripciones NMD-resistentes como una fuente de proteínas dirigibles
una vez establecido que las transcripciones NMD-resistentes pueden dar lugar a proteínas mutantes derivadas expresadas en MSI, hemos tratado de identificar los genes adicionales que contienen CMS-susceptibles de generar proteínas mutantes expresadas en cánceres de colon MSI-alto que podría servir como dianas terapéuticas. Utilizando una estrategia bioinformático, se realizó una búsqueda en todo el genoma para CMS-que contiene los genes sobre la base de criterios prevé que codifican para los mutantes transcripciones NMD-irrelevantes [24], que son intrínsecamente resistentes a NMD (Tabla S2). Se identificaron 1.511 mononucleótido no redundante de CMS repite ≥7 mer de longitud (incluidos los genes hipotéticos) predijimos para generar mutantes transcripciones NMD-resistentes. Esto se compara con los 17.654 mononucleótido CMS (≥6 mer) identificado (independientemente del estado de NMD) en un estudio anterior [17].
Los genes fueron seleccionados para el análisis de CMS mutación en base a los criterios de selección que puedan ser importantes para la utilidad como una proteína objeto de orientación. Hemos limitado el estudio a la 316 mononucleótido de CMS repite ≥8 mer de longitud, ya que existe una correlación entre la longitud del microsatélite y la frecuencia de mutación probable. importantes tasas de mutación (& gt; 40%) se ha informado de algunos 8 repeticiones mer [16]. Se excluyeron, ya que estos son poco probable que genere epítopos útiles de células T para una gama de tipos de HLA comunes, como se requiere para superar la restricción MHC; genes con secuencias cortas predichos neo-C-terminales de proteínas (10 aminoácidos & lt). Excluyendo los genes hipotéticos (LOC prefijo o KIAA), CMS-179 que contienen genes satisfacen los criterios de selección (Tabla S3). La evidencia de expresión de la proteína en los cánceres de colon de los genes preseleccionados también se buscó como un criterio de selección adicional para indicar probable expresión de las proteínas mutantes. Human Protein Atlas [30] incluye la expresión de proteínas que muestra los datos en los cánceres colorrectales mediante técnicas de inmunohistoquímica. Sin embargo, tales datos no está disponible para muchos genes, debido a la dependencia de IHC de la disponibilidad de anticuerpos adecuados. Por lo tanto, perfiles de expresión génica de datos también se utilizó para identificar los genes con los más altos niveles de expresión de ARNm en base a los datos de dos estudios [31], [32] de MSI y SMS cánceres de colon (Figura S2).
genes seleccionados (Tabla 4) se hacen pruebas de mutaciones cMS en un panel de 5 y 1 MSI líneas celulares del SMS y un posterior del panel de 6 líneas de células MSI se puso a prueba si la pantalla inicial reveló mutaciones CMS. Tres genes (SFRS12IP1, MED8 y ASXL1) se mutaron en 6/11 (55%) de MSI de alta líneas celulares y dos genes (Fbxl3 y RGS12) se mutaron en 5/11 (45%). Varios genes con tasas de mutación menores también fueron identificados (Tabla S4).
in silico
análisis de epítopo para NMD-resistentes transcripción deriva proteínas mutantes
Para que sea útil como objetivos de la vacuna /inmunoterapia terapéuticos, las proteínas mutantes necesidad de generar CTL identificados epítopos para tipos de HLA comunes.
in silico
análisis utilizando el software disponible públicamente, tal como SYFPEITHI ha sido previamente identificado nuevos epítopos de CTL que fueron validados posteriormente en ensayos funcionales [26]. Para identificar qué MSI derivados de proteínas mutantes es probable que sean inmunogénicas, se evaluó proteínas mutantes derivados de transcripciones NMD-resistentes para potenciales HLA-A * 0201 epítopos. HLA-A * 0201 es el tipo más común de HLA, presente en aproximadamente el 50% de la población [33]. las puntuaciones se basan en SYFPEITHI motivos comunes a los epítopos presentes en la naturaleza conocidas de unión. De acuerdo con las directrices de puntuación SYFPEITHI, un epítopo expresado naturalmente debería estar entre el 2% de todas las puntuaciones de péptidos evaluados en el 80% de los casos [26]. Se evaluó mutante C-terminales que surge de mutaciones NMD-R comunes (cuadro S5) y el 2% de los alelos HLA-A * 0201 se determinaron las puntuaciones generadas a partir de las proteínas mutantes de unión SYFPEITHI (Tabla 5). Los péptidos de alto rango tenían SYFPEITHI puntuaciones que van de 23-31 vinculante. Estos resultados son comparables a las puntuaciones de unión de 135 conocido HLA-A * 0201 epítopos cancerígenos CTL [26], incluidos los 4 epítopos derivados de MSI publicados, que tienen una puntuación media de 24 años y una media de 23,4 (Tabla S6).
en base a las tasas de mutación disponible informó cMS para EPHB2, TTK y RGS12 (C8), una vacuna que incluye estas tres proteínas mutantes incluirán al menos un probable HLA-a * 0201 epítopo para el 69% de los pacientes ( 1- (1-41%) x (1-27%) x (1-28%)). Además HLA-A * 0201 se identificaron epítopos de varios genes (TMEM97, ASXL1, SFRS12IP1, RGS12 (A9), RTKN2) con mutaciones comunes en este estudio, lo que indica que también la orientación de estos genes podría ampliar HLA-A * 0201 cobertura. Algunas mutaciones raras (por ejemplo NTAN1, RAPH1) también producen epítopos inmunogénicos que no proporcionaría una cobertura amplia población, sino que también puede valer la pena la orientación en pacientes seleccionados.
Discusión
La inestabilidad de microsatélites da lugar a predecible mutaciones de cambio que implican el CMS de muchos genes. Las proteínas mutantes que surgen de estas mutaciones son una fuente lógica de antígenos específicos de tumor que podrían explicar tanto la presencia de un aumento de los TIL y el mejor pronóstico asociado con un MSI de alta fenotipo. Este concepto es apoyado por un reciente hallazgo de una correlación entre la densidad infiltrado inmune y el número de mutaciones de cambio de cMS detectados en una serie de cánceres de colon MSI-alto [34]. Hemos validado al menos dos ejemplos (CREBBP y EP300) de proteínas mutantes expresadas de forma natural en líneas celulares de cáncer de colon MSI-alta, ambos consecutivos a las transcripciones NMD-resistentes. Estos resultados confirman que las transcripciones NMD-resistentes pueden generar proteínas mutantes naturalmente expresada derivada-MSI [34], [35]. El CMS se repite en CREBBP y EP300 son cortos y poco probable que se mutado en una alta proporción de tumores MSI-alto. Sin embargo, es probable que algunas mutaciones NMD-resistentes comunes tales como TTK también generarán proteínas mutantes dirigibles en MSI-alto de cáncer. Nuestra estrategia para todo el genoma para identificar las transcripciones NMD-resistentes inmunogénicas ha identificado cinco mutaciones novela CMS (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, Fbxl3, RGS12) en al menos un 45% de las once líneas celulares de cáncer de colon MSI de alta probadas. El análisis de mutaciones en una serie más amplia de cánceres MSI de alta primarios de colon permitan a las frecuencias de mutación de estos potenciales dianas terapéuticas para determinar con mayor precisión.
in vitro
estudios han identificado las respuestas CTL a sintética péptidos mutantes que surgen de mutaciones cMS comunes, utilizando células mononucleares de sangre periférica de pacientes con cáncer de colon MSI [10], [11], [12], [13], [14], [36] y curiosamente, también en individuos sanos con HNPCC [15]. Estos estudios han demostrado que las proteínas mutantes específicos de tumores pueden estimular
vitro
inmunidad de células T en y apoyar el concepto de una estrategia de vacunación. El HLA-A * 0201 publicada epítopos CTL para TGFBR2 [10], [11], CASP5 [12], OGT [13] y U79260 (FTO) [14] todos se levantan a partir de transcritos mutantes NMD-sensibles. experimentos NMD-inhibición han demostrado que mutante TGFBR2 es uno de los transcritos más upregulated, con 10 veces mayor de la expresión de ARNm en un estudio [27], [37]. La respuesta de las células T conflicto con el impacto esperado de NMD en la expresión de proteínas mutantes. Un estudio mostró que la transfección de proteínas TGFBR2 mutante es detectable en transfectantes de cDNA mutante (NMD-resistente), pero no mutante gDNA (NMD-sensibles) [35]. No hemos detectar proteínas mutantes de transcripciones NMD-sensibles (BAX, CASP5 y MSH3). Sin embargo, NMD es un proceso de traducción dependiente de [24] y expresión de la proteína mutante de bajo nivel de la ronda inicial de la traducción pueden ser suficientes para estimular las respuestas inmunitarias. CTL puede mostrar exquisita sensibilidad a un ligando de péptido /HLA específico, con tan pocos como 3 diana de péptidos complejos MHC /siendo suficiente para la lisis de células CTL específica
in vitro
[38]. Las respuestas humorales a la proteína mutante TGFBR2 han sido identificados por ELISA, pero sólo en una minoría (10%) de los pacientes MSI-alto de cáncer de colon [39].
Un beneficio de transcripciones NMD-resistentes como fuente de objeto de orientación proteínas mutantes es que los antígenos tumorales expresados de manera estable pueden ser cruzada presentan al sistema inmune por las células dendríticas para estimular CTL y T respuestas de células helper [40]. Cross-presentación es probable que resulte en la inmunidad anti-tumor superior y transcripciones NMD-resistentes como fuente de proteínas mutantes dirigibles. Un ensayo de fusión de genes informó de una correlación significativa entre la expresión de proteínas mutantes derivados de MSI transfectadas y presentación cruzada de antígenos ovoalbúmina co-expresado [18]. Para los genes con proteína detectable insignificante, algunos moderados a fuertes respuestas de CTL se detectaron, pero sin la presentación cruzada [18]. Una limitación del ensayo de transfección es que las construcciones de ADNc mutantes se utilizan y por lo tanto los experimentos no evaluaron el impacto de NMD sobre expresión de la proteína mutante. Nuestro enfoque permite superar esto a través de la detección directa de la expresión de la proteína mutante. Un ensayo de transfección modificado requiere de empalme natural de la C-terminal también podría identificar objetivos de vacunación biológicamente relevantes.
NMD-inhibición experimentos han identificado algunas transcripciones "NMD-escape" que resisten parcialmente degradación debido a la NMD [27], . MBD4 se prevé generar una transcripción NMD-sensibles, sino una banda de proteína anormal leve ha sido reportado en análisis de Western blot de líneas celulares mutado MBD4. Esto puede representar expresión de la proteína mutante MBD4 debido a NMD-Escape [23]. transcripciones NMD-escape pueden ser una fuente útil de dianas proteicas, pero éstos no pueden predecirse y es necesario seguir trabajando para determinar qué transcripciones NMD-de escape producen proteínas mutantes dirigibles. Las estrategias que interfieren con NMD sin inhibir la traducción de proteínas deben causar una regulación al alza generalizada en los mutantes transcripciones NMD-sensibles, desenmascarando una serie de antígenos tumorales. Este enfoque podría complementar una vacuna para combatir tumores MSI-alto ampliando la gama de objetivos inmunes disponibles más allá de las transcripciones NMD-resistentes. NMD-inhibición por siRNA dirigidos de genes reguladores NMD SMG1 o Upf2 Recientemente se ha demostrado capaz de inducir protección
in vivo
la respuesta inmune a las células tumorales transfectadas con un antígeno diana NMD sensible a [41].
Nuestra confirmación de la expresión de la proteína mutante por tumores MSI-alta puede tener aplicaciones clínicas importantes. Una vacuna de orientación proteínas mutantes comúnmente expresados se ha propuesto como una estrategia prometedora para el tratamiento de MSI de alta tumores [15], [18], [34], [42]. Con objetivos suficientes, la vacunación puede ser factible siempre que las proteínas mutantes se expresan, epítopos antigénicos son generados y la presentación de antígenos es funcional. Es necesario seguir trabajando para determinar qué proteína mutante respuestas inmunes pueden conferir un beneficio de supervivencia para los pacientes con tumores MSI-alto. Las proteínas mutantes secretadas en el suero podrían servir como biomarcadores útiles para la detección precoz de los tumores MSI-alto, sobre todo en la población afectada HNPCC. Tales biomarcadores podrían ser un complemento útil para el cribado mediante colonoscopia, ya que los cánceres colorrectales MSI-alto tienen una propensión para los adenomas y tumores de intervalo en desarrollo en el período entre colonoscopias de cribado [43], [44]. La naturaleza común, predecible y específico de tumor de proteínas mutantes derivados de MSI hace candidatos ideales como objetivos terapéuticos o marcadores de diagnóstico.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo
líneas celulares de cáncer colorrectal LIM se establecieron a partir de biopsias de tumores en el Instituto Ludwig para la Investigación del cáncer (LICR) Melbourne Branch como se ha descrito anteriormente: LIM1215 [45], LIM1899 [46], LIM1863 [47], LIM2463 [48] y (LIM2099, LIM2405, LIM2408, LIM2537, LIM2550 y LIM2551) [49]. Las líneas de células LIM se establecieron a partir de los cánceres colorrectales esporádicos y familiares tanto [49] y se pueden obtener a partir CellBank Australia (www.cellbankaustralia.com) o desde el LICR Melbourne Branch en la finalización de un acuerdo de transferencia de material académico estándar. SW1222 células de cáncer colorrectal fueron proporcionados por el Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Nueva York Branch, (Nueva York, NY) y las células de cáncer colorrectal HCA7 se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares (Porton Down, Reino Unido). segundo. do. re.